（植物学专业论文）编码叶绿体质体rna结合蛋白及nakcl共转运体基因的功能研究.pdf

独创声明 y1 0 1 2 3 3 3 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要 一魏新擀砻易修 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂控有关保留、使用学位论文的规定有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 生控可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权 书) 学位论文作 签字日期神 导师签字： 签字日期 山东师范大学博士学位论文 编码叶绿体厂质体r n a 结合蛋白及n a + k * c 共转运体基因的功能研究 ( 山东师范大学生命科学学院，济南，2 5 0 0 1 4 ) 摘要 植物生长发育、分化、衰老和抗逆等生命过程是受严格的遗传调控的。这些过程实现的 分子基础是基因的时空差异表达。在基因表达过程中，转录调控是基因表达调控的主要调控 点。真核生物中，转录后调控更为复杂多样，转录后水平的调控能对基因表达最终产物的种 类和数量( 即蛋白质的复杂性) 产生重要雨直接的影响。基因在转录后，新合成的p r e - m r n a 或核不均一r n a ( a ) 要经过p r e - m r n a 剪接( p r e - m r n as p l i c i n g ) ，5 端加帽 ( c a p p i n g ) ，3 端合成多聚腺苷酸( p o l y a ) 尾( p o l y a d e n y l a t i o n ) 等加工环节才能成为成熟的 m r n a 。许多环境及体内因子可通过调控基因表达和转录后过程影响植物的生长发育过程。 r n a 结合蛋白( r b p s ) 是一类参与转录后水平调控的重要蛋白。这类蛋白质可通过直接结合 r n a 或间接调节其它参与转录后水平调控的成分，影响p r e m r n a 的加工成熟、m r n a ( 由 绍胞核至细胞质) 的转运、m r n a 的定位、翻译和代谢等多个后转录环节，进而影响受遗传 调控的植物生长、发育、增殖、分化、胁迫应答等生命过程。因此对r b p s 及其编码基因的 研究对阐明植物的生长、发育及胁迫应答的机理十分重要。已有的研究表明，c p r b p 2 9 是 一个核基因编码并定位到叶绿体中的蛋自，叶绿体中，该类蛋自主要包括c p r b p 2 8 c p r b p 2 9 ( a 、b ) c p r b p 31 ( a 、b ) c p r b p 3 3 ( a 、b ) 这几大类，它们与叶绿体基因组编码的基因 表达调控密切相关，同时还起着细胞( 核基因组) 和叶绿体( 基因组) 之间的信息传递和协 调功能，但关于该基因对生长发育相关的生理作用则缺少相关的研究。 许多环境因子会对植物的生长产生胁迫影响，是植物生长的胁迫因子。植物生长发育过 程中不可避免的会受到( 环境) 胁迫因子的影响。重度的胁迫会对植物的生长发育造成伤害； 在农业生产中则会降低农作物的产量、质量和经济效益。研究植物对胁迫的应答及调控机理 对降低胁迫的不利影响，指导农业生产具有积极的意义。高盐是常见的胁迫因子，土壤盐渍 化会严重抑制植物的生长和发育，影响农作物的品质和产量。盐对植物造成的胁迫同植物的 离子运输密切相关，因此，研究植物的离子运输对理解植物耐盐的机理及调节至关重要。动 物中的研究表明，n k c c 是一类与盐腺泌盐功能密切相关的离子转运结构，它同c i c h a n n e l ( 氯离子通道) 以及该基因家族的其它成员的编码产物如k c c 、n c c 协同配合对动物盐腺 的泌盐功能至关重要。在植物中，泌盐是盐生植物耐盐的一种重要策略，但分子水平上对植 山东师范大学博士学位论文 物泌盐的机理还了解甚少。因此，在植物，特别是在盐生植物中，n k c c 的研究对理解植物 的泌盐机理，了解动植物中类似基因的功能具有一定的意义。 基于以上研究背景我们选择了编码盐芥c p r b p 2 9 的基因t h - c p r b p 2 9 ，及中华补血草 n k c c 做为研究目标进行了相关研究。主要包括以下工作： 一进行了盐芥和拟南芥中r n a 结合蛋白c p r b p 2 9 的研究。包括： 1 ) 克隆了盐芥叶绿体k n a 结合蛋白基因( 拍- c p r b p 2 9 ) ，并对该基因进行了相关的遗传操 作及转基因研究。 2 ) 构建了t h c p r b p 2 9 的植物过量表达载体，并。( 用花浸染法) 在拟南芥中进行了异源过 量表达。 3 ) 构建了t h - c p r b p 2 9 的r n m 载体，并( 用花浸染法) 转化盐芥( 用于基因功能的 k n o c k - d o w n 分析) ； 4 ) 构建了t h - c p r b p 2 9 - g f p 融合蛋白植物表达载体，并转化拟南芥( 进行蛋白定位分析) 。 5 ) 克隆了t h c p r b p 2 9 的拟南芥同源基n ( a t - c p r b p 2 9 ) 及其启动子( a t - c p r b p 2 9 - p r o m o t e r ) 序列。 6 ) 构建了a t - c p r b p 2 9 的过量表达载体，并( 用花浸染法) 转化拟南芥进行同源过量表达。 7 ) 构建了a t - c p r b p 2 9 - p r o m o t e r ：；g u s - r e p o r t e rg e n e 表达载体，并转化拟南芥进行组织表达 分析。 8 ) 构建了a t - c p r b p 2 9 的r n a i 载体并转化拟南芥用于该基因的k n o c k - d o w n 分析。 二选择了泌盐盐生植物中华补血草为材料，对n k c c 进行了初步的研究： 1 ) 创立了中华补血草的遗传转化体系。 2 ) 克隆了中华补血草n k c c 的o r f 编码区多个序列片段。 3 ) 构建了该基因的沉默载体l s n k c c ：p g s a l 2 5 2 。 4 ) 进行了基因沉默载体l s - n k c c ：p g s a1 2 5 2 在补血草中的遗传转化。 5 ) 对n k c c 进行了表达定位研究。 三结果如下： 1 对盐芥及拟南芥r n a 结合蛋白的转基因植物的遗传转化及功能分析表明： 1 ) 过量表达t h - c p r b p 2 9 、a t - c p r b p 2 9 可促进萌发并促进苗期主根的生长、并在一定程度上 增强苗期植物的抗氧化胁迫能力及植物萌发期的耐受盐胁迫和渗透胁迫的能力。在添加 a b a ，6 - b a 及i b a 的m s 0 培养基上的实验表明：添加a b a 的培养基对过量表达 山东师范大学博士学位论文 t h c p r b p 2 9 、t 和k n o c k d o w n 转基因株系种子的萌发速率无明显的影响。培养基中添加 i b a 或i a a 则可提高w t 和i m o c k - d o w n 转基因植株种子的萌发速率使其接近过量表达 t h - c p r b p 2 9 转基因种子的萌发速率，这暗示过量表达t h - c p r b p 2 9 对转基因植物种子的萌发 促进作用可能同生长素具有一定的相关性。 2 ) t h - c p r b p 2 9 一g f p 融合蛋白的细胞定位分析表明该基因的编码产物定位于叶绿体，质体中。 3 ) a t - p r o m o t e r ：g u s r e p o r t e rg e n e 转基因拟南芥的功能分析表明：在植物萌发期及苗生长的早 期阶段，该基因在下胚轴及根的连接处呈高水平表达；在萌发9 6 h r 幼苗的子叶顶端呈现高 水平表达。表明该基因与植物的早期生长发育过程密切相关。 4 ) 转基因( 基因沉默、过量表达) 拟南芥的种子同野生型拟南芥种子的萌发比较实验表明， 种子的萌发速率和萌发一致性同该基因的表达量呈正相关，呈现出( 异源，同源) 过量表达 转基因拟南芥一讯拟南芥一基因k n o c k - d o w n 拟南芥种子萌发速率由高到低的趋势。这表明 r b p ( r n a 结合蛋白) 的过量表达可提高种子的萌发速率和萌发一致性。 5 ) r t - p c r 结果表明：该基因的过量表达会影响多种编码p s i i 的结构蛋白基因m r n a 的水 平。 6 ) 蛋白电泳分析表明，过量表达a t c p r b p 2 9 可引发某些蛋白表达的改变。 二补血草的相关研究： 1 ) 成功创制了中华补血草的遗传转化系统。 2 ) 优化了补血草的r n a 提取过程及流程，并克隆了n k c c 基因编码区的多个片段。 3 ) 构建了n k c c 基因的沉默载体，实现了补血草n k c c 基因沉默载体的遗传转化，获得了 转基日 直株。为进一步研究该基因在盐生植物中的功能奠定了基础。 4 ) n k c c 基因表达的组织定位表明该基因主要表达于输导组织周围的薄壁细胞，推测其功能 可能与水及离子的运输密切相关，这与我们对该基因的功能分析和预测相一致。 本论文主要创新点： 1 首次克隆了盐芥的t h c p r b p 2 9 全长序列并将其进行了拟南芥中的异源过量表达和基因沉 默操作。 2 首次证明t h c p r b p 2 9 的过量表达可促进转基因拟南芥的早期萌发，并会影响转基因植物 耐受氧化胁迫和盐胁迫的能力。 3 初步证明该基因的过量表达会改变多种编码p s i i 的结构蛋白的m r n a 的表达水平和某些 蛋白表达的变化。 山东师范大学博士学位论文 4 初步证明t h c p r b p 2 9 对拟南芥种子萌发的影响同生长素的调节相关。 5 克隆了拟南芥a t c p r b p 2 9 及其启动子口t - c p r b p 2 9 - p r o m o t e r ) 序列，并在拟南芥中进行了过 量表达及r n a i 的相关实验研究工作，对该基因的组织表达特异性及生理作用进行了初步研 究和探讨。 6 首次建立了中华补血草高效再生及遗传转化系统。 7 首次克隆了补血草的n k c c 并对其进行表达定位分析。 关键词：补血革；盐芥；组织培养；遗传转化；耐盐；分子策略；n k c c ；t h - r b p ；r n a i ： 过量表达；后转录调控；基因沉默 分类号：q 9 4 5 山东师范大学博士学位论文 f u n c t i o n a la n a l y s i so f t h eg e n e se n c o d i n g 础帕b i n d i n gp r o t e i n ( t h - c p r b p 2 9 ) a n dn a + k + c l - c o t r a n s p o r t e r ( l s - n a + k + c l - c o t r a n s p o r t e r ) ( l i f es c i e n c ec o l l e g e ，s h a n d o n gn o r m a lu n i v e r s i t y , j i n a n ，2 5 0 0 1 4 ) a b s t r a c t t h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fp l a n ta r er e s t r i c t l yc o n t r o l l e db yi t sp r o g r a m m e dg e n e t i c e x p r e s s i o n m a n ye n v i r o n m e n t a la n di n t e r i o rf a c t o r so fp l a n t s c a l li n f l u e n c et h ep r o c e s so f d e v e l o p m e n ta n dg r o w t ho fp l a n tb yi n t e r f e r i n gt h eg e n e s 。e x p r e s s i o n g e n e s e x p r e s s i o ni sa p r o c e s st r a d e rs t r i c tr e g u l a t i o n ，w h i c hi n c l u d e sm u l t i p l er e g u l a t i n gs t e p ss u c ha st h ea c t i v a t i o no f g e n es t r u c t u r e ，t h ei n i t i a t i o no ft r a n s c r i p t i o n ，p o s t 4 r a n s c d p t i o n a lp r o c e s s e s ，t r a n s l a t i o na n d p o s t t r a n s l a t i o n a lp r o c e s s e s p r o t e i n sp l a yav i t a lr o l ei na l m o s ta l l o ft h er e g u l a t i o np r o c e s s e s e s p e c i a l l yp o s t - t r a n s c r i p t i o np r o c e s s r n ab i n d i n gp r o t e i n s ( r b p s ) a r c t h ek e yf a c t o r st h a ti n v o l v e i nt h ep o s t t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n t h e ya f f e c ta l lb u te v e r yp r o c e d u r eo ft h em r n a p o s t t r a n s c r i p t i o np r o c e s sb yd i r e c t l yc o m b i n i n gr n a o ri n d i r d c t l yr e g u ! a t i n gt h ef u n c t i o n so f o t h e rf a c t o r s s o ，r b p sh a v ew i d ei n f l u e n c eo nv a r i o u sa s p e c t so fp l a n t st h a ti n c l u d eg r o w t h , d e v e l o p m e n t ，p r o p a g a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o na n dt h e s t r e s sr e s p o n s e s ，w h i c ha r ea l ir e g u l a t e d g e n e t i c l y f r o mt h i sa s p e c t ，i ti sc l e a rt h a tt h es t u d yo fr b p sa n dr b p s e n c o d i n gg e n e sw i l lh e l p t oi l l u s t r a t et h em e c h a n i s m st h a tp l a n t sa d o p ti ng r o w t h ，d e v e l o p m e n t ，s t r e s st o l e r a n c e ，a n d r e s p o n s e s o m ed o c u m e n t e dp a p e r sh a v es h o w nt h a tc p r b p 2 9b e l o n g sas o r t so fp r o t e i n se n c o d e db y n u c l e a rg e n o m ea n dl o c a t e di nc h l o r o p l a s t t h i sg r o u po fp r o t e i n sa r ec o m p o s e do fc p r b p 2 8 ， c p r b p 2 9 ( a 、b ) ，c p r b p 3 1 ( a 、b ) a n dc p r b p 3 3 ( a 、b ) t h e y a r ec l o s e l yr e l a t e d t o t h er e g u l a t i o n o fg e n ee x p r e s s i o no fc h l o r o p l a s tg e n o m e i na d d i t i o n ，t h e ya l s op l a yar o l e i ni n f o r m a t i o n e x c h a n g i n ga n dc o o p e r a t i n gb e t w e e nn u c l e a rg e n o m ea n dc h l o r o p l a s tg e n o m e u n f o r t u n a t e l y ， a l t h o u g hs o m ew o r kh a sb e e nd o n et oi d e n t i f yt h er n a st h a tt h e yp r o c e s s ，l i t t l ei sk n o w na b o u t t h es p e c i f i cf u n c t i o no f c p r b p 2 9 p l a n t sa r ei n e v i t a b l et os u f f e rf r o me n v i r o n m e n t a ls t r e s s e sd u r i n gt h e i rw h o l el i v e s s t r e s s e s m i g h ti m p e d et h en o r m a lg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fp l a n t sa n dl e a dt ot h ed e c r e a s eo fp r o d u c t s q u a n t i t y ，q u a l i t ya n de c o n o m i cv a l u e s r e s e a r c h e sa b o u tt h em e c h a n i s mp l a n t sr e s p o n dt os t r e s s e s a r eo fg r e a ti m p o r t a n c ef o rp e o p l et oa v o i dt h ea d v e r s ee f f e c to fs t r e s s e so np l a n t sa n di m p r o v et h e 5 山东师范大学博士学位论文 a g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o n h i g l ls a l i m t yi ns o i l i sac o m m o ns t r e s sf a c t o ra n dc a nh i n d e rp l a n t s g r o w t ha n dd e v e l o p m e n ts e r i o u s l y ，w h i c he v e n t u a l l yr e s u l t si nt h ed e c r e a s eo fp r o d u c t sq u a l i t y a n dq u a n t i t y s a l ts t r e s si sc l o s e l yc o r r e l a t e dt ot h ei o nt r a n s p o r ti np l a n t s t h e r e f o r e ，i ti sq u i t e m e a n i n g f u lt os t u d yt h ei o nt r a n s p o r ti no r d e rt om a k ec l e a rt h em e c h a n i s m so fs a l tt o l e r a n c ea n d c o r r e s p o n d i n gr e g u l a t i o n r e s e a r c h e si na n i m a l sr e v e a lt h a tn k c c i sak e yk i n do fi o nt r a n s p o r t o r t h a ti st i g h t l yr e l a t e dt ot h es a l ts e c r e t i o nf u n c t i o no fs a l tg l a n d s c o m p a n i e dw i t hc r h a r l n e la n d o t h e rm e m b e r si nt h es a m eg e n ef a m i l ys u c ha sk c c ，n c c ，n k c cp l a y sas i g n f i c a n tr o l ei ns a l t s e c r e t i n go fa n i m a l s s a l tg l a n d s i np l a n t s ，s a l ts e c r e t i o ni sav i t a ls t r a t e g yo fh a l o p h y t e st or e s i s t s a l ts t r e s s ，b u ts t u d i e sc o n c e r n i n gt h es a l ts e c r e t i o no fp l a n to nt h em o l e c u l a rl e v e la r ef a rf r o m e n o u 曲n o w a sac o n s e q u e n c e ，i no r d e rt oe l u c i d a t et h em e c h a n i s m so f s a l ts e c r e t i o ni np l a n t sa n d d e m o n s t r a t et h ef u n c t i o no fg e n e st h a ti ss i m i l a rt oa n i m a l s ，i ti sp r a c t i c a l l yw o r t h w h i l et oa n a l y z e t h ef u n c t i o no f n k c ci np l a n t s ，e s p e c i a l l yi nh a l o p h y t e s b a s e do i lt h er e s e a r c hb a c k g r o u n dm e n t i o n e da b o v e ，ag e n ei nt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a e n c o d i n gc p r b p 2 9a n dt h en k c c i nl i m o n i u ms i n e n s ew e r ec h o s e na sm ys t u d y i n go b j e & sf o r t h e r e l a t e de x p e r i m e n t s s o ，t h em a i nw o r ki nt h i st h e s i si n c l u d e st w op a r t s ： l s t u d yt h er e g u l a t i n gf i m c t i o no fc h l o r o p l a s t t ) l a s t i dr n ab i n d i n gp r o t e i n ( c p r b p 2 9 ) i nb o t h t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l aa n da r a b i d o p s i st h e l i a n a 1 ) t h et h c p r b p 2 9g e n ew a sc l o n e da n dc o r r e s p o n d i n gg e n e t i cm a n i p u l a t i o na sw e l la st r a n s g e n i c e x p e r i m e n t sw a sp e r f o r m e d 2 1p l a n tb i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o ro v e r - e x p r e s s i n gt h c p r b p 2 9w a sc o n s t r u c t e da n di tw a s h e t e r o g e n e o u s l ye x p r e s s e di na r a b i d o p s i s t h e l i a n ab yu s i n gt h et r a d i t i o n a lf l o w e r d i p t r a n s f o r m a t i o nm e t h o d 3 ) r n a i n t e r f e r e n c ev e c t o ro ft h c p r b p 2 9w a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t ot h e l l u n g i e l l a h a l o p h i l au s i n gt h ef l o w e rd i pm e t h o d t h ef u n c t i o no ft h - c p r b p 2 9g e n ec a nt h e r e f o r eb e s t u d i e db yk n o c k d o w na n a l y s i s 4 ) p l a n tb i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o ro ft h c p r b p 2 9 - g f pf u s i o np r o t e i nw a sc o n s t r u c t e da n d t r a n s f o r m e di n t o a r a b i d o p s i st h e l i a n a f o r a n a l y z i n g t h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no f t h - c p r b p 2 9 、 5 ) t h eh o m o l o g o u sg e n eo ft h c p r b p 2 9i na r a b i d o p s i st h e l i a n a 纠t - e p r b p 2 9 ) a n di t sp r o m o t e r t - c p r b p 2 9 - p r o m o t e r ) w e r ec l o n e d 6 坐查堕翌查堂竖主兰竺丝苎 6 ) p l a n tb i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o r0 v e r - e x p r e s s i n ga t - c p r b p 2 9w a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e d i n t oa r a b i d o p s i st h e l i a n af o r t h eh o m o l o g o u so v e r - e x p r e s s i o na n a l y s i s 7 ) p l a n tb i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o ro f a t - c p r b p 2 9 一p r o m o t e r ：g u s - r e p o r t e rg e n ew a sc o n s t r u c t e da n d t r a n s f o r m e di n t oa r a b i d o p s i st h e l i a n af o rt h et i s s u ee x p r e s s i o na n a l y s i s 8 ) r n ai n t e r f e r e n c ev e c t o ro fa t - c p r b p 2 9w a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t oa r a b i d o p s i s t h e l i a n af o rt h ek n o c k d o w na n a l y s i so f t h eg e n ef u n c t i o n i i r e s e a r c ho nn k c c , ag e n ec l o s e l yr e l a t e dt oi o nt r a n s p o r t ，w h i c hw a so b t a i n e df r o m l i m o n i u r ns i n e n s e ，as o r to f h a l o p h y t ew h i c hp o s s e s s e st h es a l ts e c r e t i o nf u n c t i o n 1 ) f o u rf r a g m e n t sf r o mt h eo r f ( o p e nr e a d i n gf r a g m e n t ) o f n k c cw e r ec l o n e df r o ml i m o n l u m s i n p 凇p 2 ) r n ai n t e r f e r e n c ev e c t o ro f l s - n k c c ：p g s a l 2 5 2w a sc o n s t r u c t e d 3 ) t h eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f l i m o n i u ms i n e n s ew a se s t a b l i s h e d 4 ) t h ev e c t o ro f l s - n k c c ：p g s a l 2 5 2w a st r a n s f o r m e di n t ol i m o n i u ms i n e n s e 5 ) t h el o c a l i z a t i o no f n k c cw a ss t u d i e d i i i r e s u l t s i f u n c t i o n a la n a l y s i sa b o u tt h et r a n s g e n i cp l a n t so fr n ab i n d i n gp r o t e i n si n t h e l l u n g l e l l a h a l o p h i l aa n da r a b i d o p s i st h e l i a n as h o w st h er e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 ) t h eo v e r e x p r e s s i o no ft h c p r b p 2 9 , a t - c p r b p 2 9c a l lp r o m o t et h es e e d l i n gg e r m i n a t i o n ，t h er o o t g r o w t h i tc a na l s oe n h a n c et h ep l a n t s o x i d a t i v es t r e s st o l e r a n c ed u r i n gs e e d l i n gp e r i o da n dt h e s a l ts t r e s st o l e r a n c ed u r i n gg e r m i n a t i o np e r i o d 2 ) t h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n a n a l y s i s o ft h - c p r b p 2 9 - g f pf u s i o n p r o t e i ns h o w st h a t t h - c p r b p 2 9i sl o c a l i z e di nc h l o r o p l a s t s 3 ) f u n c t i o n a la n a l y s i sa b o u tt h et r a n s g e n i ca r a b l d o p s i st h e l i a n ao fa t - p r o m o t e r ：g u s - r e p o r t e r g e n er e f l e c t st h a ta t - c p r b p 2 9i se x p r e s s e da tt h ec o n n e c t e dp a r to fh y p o c o t y la n dp r i m a r yr o o to n h i g hl e v e ld u r i n gt h eg e r m i n a t i o np e r i o da n dt h ee a r l yp e r i o do fs e e d l i n g t h i sr e s u l tr e f l e c t st h a t a t - c p r b p 2 9i st i g h t l yr e l a t e dt ot h ep l a n te a r l yg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t 4 ) c o m p a r i s o no fs e e d sg e r m i n a t i o ne x p e r i m e n tb e t w e e nt r a n s g e n i ca r a b i d o p s i st h e b a n a ( s e e d s o f g e n es i l e n c e t r a n s g e n i c p l a n t s a n d t h o s eo f o v e r e x p r e s s i o n t r a n s g e n i c p l a n t s ) a n d t h e w i l d t y p e p l a n t sr e v e a l st h a tt h e r ei s ap o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e ne i t h e rt h e g e r m i n a t i o nr a t eo rt h e g e r m i n a t i o nc o n s i s t e n c ya n dt h ee x p r e s s i o no fa t - c p r b p 2 9 t h a ti s ，b o t ht h eg e r m i n a t i o nr a t ea n d 7 山东师范大学博士学位论文 t h eg e r m i n a t i o nc o n s i s t e n c yd e c l i n eg r a d u a l l yf r o mo v e r e x p r e s s i o nt r a n s g e n i cp l a n tt ow i l dt y p e p l a n tt og e n es i l e n c e 仃a n s g e n i cp l a n t ，i te a r lb ec o n c l u d e df r o mt h e s er e s u l t st h a tt h ee x p r e s s i o n o f r n a b i n d i n gp r o t e i n sc a np r o m o t et h eg e r m i n a t i o nr a t ea n dt h eg e r m i n a t i o nc o n s i s t e n c y 5 ) r e s u l t so fr t - p c rs h o wt h a tt h eo v e r e x p r e s s i n no f a t - c p r b p 2 9c a l li n f l u e n c et h em r n al e v e l o f m u l t i p l eg e n e se n c o d i n gs t r u c t u r ep r o t e i n si np h o t o s y n t h e s i ss y s t e mi i 6 ) 2 de l e c t r o p h o r e s i ss h o w t h a to v e r e x p r e s s i o no fa t - c p r b p 2 9c a nc a u s et h ec h a n g eo fv a r i e t yo f p r o t e i ne x p r e s s i o n 2 r e s e a r c ho nl i m o n i u ms i n e n s es h o w st h er e s u l t sb e l o w ： 1 ) t h eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f l i m o n i u ms i n e n s ew a ss u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d 2 ) t h er n ae x t r a c t i o n p r o c e d u r eo f l i m o n i u ms i n e n s ew a so p t i m i z e d ，a n d4f r a g m e n t so f t h e o r f r e g i o no f n k c cw e r ec l o n e d 3 ) r n ai n t e r f e r e n c ev e c t o ro fl s n k c c ：p g s a l 2 5 2w a sc o n s t r u c t e da n dt h et r a n s f o r m a t i o no f t h i sv e c t o ri n t ol i m o n i u ms i n e n s ew a sp e r f o r m e d f i n a l l yt h er n ai n t e r f e r e n c et r a n s g e n i ep l a n t s w e r eo b t a i n e d t h i sw o r kl a y st h ef o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d ya b o u tt h ef u n c t i o no fn k c c f r o mh a l o p h y t e s 4 ) t h et i s s u ee x p r e s s i o nl o c a l i z a t i o no fn k c cs h o w st h a tn k c cm a i n l ye x p r e s s e di nt h e p a r e n c h y m a lc e l l sa r o u n dc o n d u c t i n gt i s s u e s b a s e do nt h i sr e s u l li tc a nb es p e c u l a t e dt h a tt h e f u n c t i o no fn k c cm a yb et i g h t l yr e l a t e dt