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海洋弧茵s 9 8 0 1 次级代谢产物抑藻作用及作用机制研究 摘要 有害藻华己经成为当今全球性的海洋灾害，不仅破坏海洋生态环境，制约沿 海经济的发展，而且也威胁到人类的健康。利用微生物方法治理赤潮不仅可以有 效的抑制藻类的生长，而且还能降解藻类产生的毒素，保持海洋环境的生态平衡。 本文拟通过对胶州湾典型赤潮藻一塔玛亚历山大藻有明显抑制作用的海洋 弧菌s - 9 8 0 1 来研究该菌是否对棕囊藻、赤潮异湾藻、角毛藻等其它藻种有广谱抑 制性，并分析对以上藻种起主要抑制作用的化合物结构，以及该化合物作用的浓 度和机理。同时，分析了海洋弧菌s - 9 8 0 1 次级代谢产物对大型绿藻藻华生物一浒 苔抑制机理。本文的主要研究内容包括： ( 1 ) 以塔玛亚历山大藻为基础研究藻种，对前期实验显示抑菌、杀虫和抗 肿瘤活性的7 个菌株进行抑藻活性研究，通过实验筛选出抑藻活性较强的细菌： 弧菌s - 9 8 0 1 。 ( 2 ) 在此基础上，又选取了9 种藻种：棕囊藻、赤潮异湾藻、角毛藻、海链 藻、中肋骨条藻、东海原甲藻、链状亚历山大藻、锥状斯氏藻和卡氏前沟藻为研 究对象，通过实验发现弧菌s 一9 8 0 1 次级代谢产物具有广谱的抑藻活性，而且对硅 藻的抑制作用明显强于甲藻。 ( 3 ) 对细菌s 一9 8 0 1 的次级代谢产物进行分离纯化，利用波谱学等方法确认 了对以上藻种起抑制作用的化合物为灵菌红素，通过正交实验，优化了该菌代谢 产灵菌红素的条件，结果表明采用蛋白胨和酵母粉培养基，在n a c i 浓度为2 ，p h 为5 ，3 0 的条件下培养4 8h ，灵菌红素的产量达n 3 0m g l 。 ( 4 ) 通过实验，得到灵菌红素对棕囊藻、赤潮异湾藻、角毛藻、海链藻、 中肋骨条藻、东海原甲藻、链状亚历山大藻和锥状斯氏藻的半抑制浓度1 1 1 5 0 ，依 次为0 1 5 舭、0 1 5i t g m l 、0 1 5 蚓m l 、0 5i t e , m l 、2i t e d m l 、41 t g m l 、61 t g m l 和81 t g m l 。结合赤潮藻细胞显微结构、超微结构的观察及生理生化研究，分析灵 菌红素对微藻的抑制机理，结果表明：灵菌红素抑藻作用主要是通过对藻细胞膜 系统造成伤害从而抑制藻类的生长。 ( 5 ) 利用海洋弧菌s - 9 8 0 1 次级代谢产物对浒苔进行抑制试验，结果表明： 该菌次级代谢产物能显著抑制浒苔生长，浒苔生长缓慢时发现浒苔藻体叶绿素含 量和蛋白质含量同比空白组有所减少。 关键词：微藻生长抑制次级代谢产物灵菌红素浒苔 s t u d i e so nt h ei n h i b i t i o na c t i v n yo f s e c o n d a r ym e t a b o l i t e so f l 气r i n e 8 尺，ds p s 9 8 0 1a n dt h ei n h i b i t i o nm e c h a n i s m a b s t r a c t t h ei n c i d e n c eo fh a r m f u la l g a e sb l o o m s ( h a a s ) h a sr e c e n t l yi n c r e a s e di n f r e q u e n c ya sal o n g t e r mt r e n do n ag l o b a ls c a l e i th a sn o to n l yi n f l u e n c e dt h em a r i n e e c o s y s t e m ，c o n s t r a i n t e dc o a s t a le c o n o m i cd e v e l o p m e n t ，b u ta l s of o r m e dat h r e a t t o h u m a nh e a l t h n em e t h o do fu s i n gb a c t e r i at oc o n t r o lr e dt i d ec a nn o to n l ye f f e c t i v e l y i n h i b i tt h eg r o w t ho f a l g a e ，b u ta l s oh a s t e nt h ed e g r a d a t i o no f t o x i cp r o d u c t i o no fa l g a e ， h e n c e ，t om a i n t a i nt h ee c o l o g i c a lb a l a n c eo ft h em a r i n ee n v i r o n m e n t b a s e do nt h es t u d yo fi n h i b i t i o na b o u tv b r i os p s 9 8 0 1o n at y p i c a lr e d - t i d ea l g a - - a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ，t h i sp a p e rt e n d st ot e s t i f yi t sb r o a d s p e c t r u mi n h i b i t i o no n o t h e rn i n ea l g a e s ，s u c ha sp h a e o c y s t i sg l o b o s a ，h e m r o s 辔m aa k a s h i w o ，c h a e t o c e r o s s p a n do t h e ra l g a e s f u r t h e r ，t h es t r u c t u r eo fp r o d i g i o s i n ，i t sc o n c e n t r a t i o na n d m e c h a n i s mt oi n h i b i tt h o s ea l g a e sh a sb e e na n a l y s e d o nt h eo t h e rh a n d ，t h i sp a p e r s t u d i e st h em e c h a n i s mo fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e so fv b r i os p s 9 8 0 1o nl a r g eg r e e n a l g a e e n t e r o m o r p h ap r o l i f e r a t h i sp a p e rc o m p r i s e so ff i v ep a r t s ： f i r s to fa l lt h ei n h i b i t i o na c t i v i t yo fs e v e ns t r a i n so nt h et y p i c a lr e d - t i d ea l g a e a l e x a n d r i u mt a m a r e n s eh a sb e e na n a l y s e d i ts h o w st h a tv i b r i os p s - 9 8 0 1h a ss t r o n g i n h i b i t i o na c t i v i t y s e v e ns t r a i n sh a v eas o m e w h a td e g r e eo fa n t i b a c t e r i a l ，m s e c t i d d a l a n da n t i - t u m o ra c t i v i t yi nt h ee a r l ye x p e r i m e n t s s e c o n d l y ，b a s e do nt h i s ，o t h e rn i n ek i n d so fa l g a es p e c i e sh a sb e e ns e l e c t e d ：只 g l o b o s a ，ha k a s h i w o , c h a e t o c e r o ss p ，砌l a s s i o s i r as p ，s c o s t a t u m ，p d o n g h a i e n s e , a c a t e n e l l a ，s t r o c h o i d e a ，a c a r t e r a e t h er e s u l ti n d i c a t e st h a tt h ev i b r i os p s - 9 8 0 1s h o w e d s t r o n ga n db r o a d s p e c t r u mi n h i b i t i o na c t i v i t yo na l m o s ta l la l g a e s ，w h i l ei th a da w e a k e rf u n c t i o no nd i n o p h y c e a e t h i r d l y t h er e dc o m p o u n dw a ss e p a r a t e df r o mt h es e c o n d a r ym e t a b o l i t e so f v i b r i os p s 一9 8 0 1a n di d e n t i f i e da sp r o d i g i o s i nw h i c he l u c i d a t e db ys p e c t r o s c o p i c m e t h o d s t h ec u l t u r ec o n d i t i o no fv i b r i os p s 一9 8 0 1f o rp r o d i g i o s i np r o d u c t i o nw a s o b t a i n e da c c o r d i n gt oo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，n l ee x p e r i m e n tf o u n dt h eo p t i m u m c u l t u r ec o n d i t i o nw i t ht h em a x i m a lp r o d i g i o s i np r o d u c t i o n i ts h o w e dt h a tw h e nv i b r i o s p s 9 8 0 1w a sc u l t u r e da t3 0 ，l a y e di nam e d i u mw h i c hc o n t a i n sp e p t o n ea n dy e a s t e x t r a c t ，w i t ht h es a l i n i t y2 a n dp h5 ，a f t e r4 8ht h ep r o d i g i o s i np r o d u c t i o nr e a c h e d i i l 3 0 m g l f o u r t h l y ，t h ee x p e r i m e n t sf o u n dt h ei r s oo fp r o d i g i o s i na b o u tp g l o b o s a ，h a k a s h i w o ，c h a e t o c e r o ss p w a s0 1 5 t g m l ，a b o u tt h a l a s s i o s i r as p s c o s t a t u m , 只 d o n g h a i e n s e ，a c a t e n e l l a ，s t r o c h o i d e aw a s0 5p g m l ，2i t g m l ，41 t g m l ，6l x g m l a n d8i t g m l ，r e s p e c t i v e l y c o m b i n a t i o no fa l g a ec e l l si nt h el i g h tm i c r o g r a p h s ，t e m m i c r o g r a p h sa n dp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lr e s e a r c h ，t h ei n h i b i t i o nm e c h a n i s mo n t h ea l g a eo f p r o d i g i o s i nh a sb e e ns t u d i e d t h er e s u l ts h o w s t h a tp r o d i g i o s i nd o e sh a r m t om e m b r a n eo f m i c r o a l g a e f i n a l l y , t h eg r o w t h i n h i b i t o r ye f f e c t so ft h ev i b r i os p s 一9 8 0 1o ne n t e r o m o r p h a p r o l i f e r aw e r ef i r s ti n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a ts e c o n d a r ym e t a b o l i t e so f v i b r i os p s 一9 8 0 1c o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho fe n t e r o m o r p h ap r o l i f e r a a n di ta l s o i n d i c a t e dt h a tw i t ht h es l o w e r l ys p e e do fe n t e r o m o r p h ap r o l i f e r ag r o w t h ，t h ec o n t e n t s o ft h ec h l o r o p h y l la n dt h es o l u b l ep r o t e i no fe n t e r o m o r p h ap r o l i f e r aw e r el o w e rt h a n t h a to fc o n t r o lg r o u p k e y w o r d s ：m i c r o a l g a eg r o w t hi n h i b i t i o ns e c o n d a r ym e t a b o l i t e s p r o d i g i o s i ne n t e r o m o r p h ap r o l i f e r a 青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人已 用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名：半毫 日期： 州年万月彩同 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解青岛科技大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文 或成果时，署名单位仍然为青岛科技大学。( 保密的学位论文在解密后适用 本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密囱。 ( 请在以上方框内打“ ) 本人签名： 导师签名： 日期：川年多月形f i 醐：可肜日 青岛科技大学研究生学位论文 第1 章文献综述 赤潮( r e dt i d e ) ，是指海洋中某些微小浮游生物( 尤其是藻类) 、原生动物或细 菌在一定的环境条件下突发性繁殖( 增殖) 或聚集而引起水体变色并对其它海洋 生物产生危害作用的一种异常的生态现象。近年来，赤潮发生频率不断增高、范 围也在扩大，对近海的海洋资源和海洋经济造成了严重的负面影响，已成为全球 性的海洋灾害。研究赤潮发生的规律、探索新的经济有效的防治方法，对于保护 海洋环境质量，保障养殖业持续发展及人类健康安全，具有重要科学意义和应用 一l l = j 日u 景o 1 1 赤潮的成因与危害 1 1 1 赤潮的成因 2 0 世纪以来，随着沿海地区人口激增，工农业的迅速发展，大量的工业废水 和生活污水未经处理即直接排入到海洋中，造成内湾、河口和沿岸水域严重污染 和富营养化，这是导致赤潮发生最直接的因素【1 1 。同时人类活动的加剧改变了沿 海生态系统的结构和功能，改变了气候条件以及其他环境因子，这也是导致赤潮 频繁发生的原因之一。此外，相对稳定的水体，适宜的温度、光照和盐度等环境 条件是诱使赤潮发生的物理因素。海水养殖的自身污染也是赤潮发生的主要原因 之一f 2 l ，这些因素相互作用决定着赤潮的形成、发展和消亡。 1 1 2 赤潮的危害 1 ) 赤潮对人类健康的危害 赤潮生物在代谢过程中产生大量的生物毒素，目前已发现的包括麻痹性贝毒 ( p s p ) 、腹泻性贝毒( d s p ) 、神经性贝毒( n s p ) 、失忆性贝毒( a s p ) 和西加鱼毒 ( c f p ) 。这几种毒素可在水生生物体内积累，引起鱼、虾、贝类等水生生物的病 变，直接或间接地通过食物链威胁人类健康。已有研究表明在全世界2 0 0 多种赤 潮生物中有毒种类8 0 多种( 我国有3 0 多种) ，以甲藻居多。塔玛亚历山大藻是一 种重要的有毒藻，其产生麻痹性贝毒( p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n ) ，经由贝类、鱼类 等媒介造成人类中毒。 2 ) 赤潮对水产养殖业的损害 赤潮不仅威胁人类健康，而且对水生生物也会造成危害，每年全世界由于赤 潮原因给水产养殖业带来巨大损失。对这方面的研究比较多，认为其作用方式主 海洋弧菌s - 9 8 0 1 抑藻作用及作用机制研究 要有以下三种：最直接的方式是通过分泌粘液或死亡分解后产生粘液，附着在鱼 虾贝类等海洋生物的腮上，使它们窒息死亡；其次赤潮爆发时大量赤潮生物迅速 繁殖，不仅消耗水中大量的溶解氧，而且会影响水下的光合作用，最终使得鱼虾 贝类由于缺氧而死亡；第三种方式是赤潮生物产生的毒素通过食物链在鱼虾贝类 体内直接或间接积累，使得这些海洋生物死亡【3 1 。 3 ) 赤潮对海洋生态的破坏 海洋是一种生物与环境、生物与生物之间相互依存，相互制约的复杂生态系 统，系统中的物质循环、能量流动都是处于相对稳定，动态平衡的。当赤潮发生 时这种平衡遭到干扰和破坏，少数赤潮藻类的暴发性异常增加，改变水的理化性 质，造成海水p h 值升高，粘稠度增大【4 l ，改变浮游生物的生态系统群落结构。此 外，大量聚集在表面的赤潮生物降低了水体透明度，影响水下其它植物的光合作 用，限制了其它海洋生物的生存繁殖。另一方面赤潮生物藻体腐解时会产生大量 硫化氢和甲烷等有害气体和毒素，使得海水变色、变质，破坏原有生态系统结构 和功能【5 j 。 1 2 国内外赤潮预防及治理概述 有害赤潮己经成为当今全球性的海洋灾害，并与沙尘暴并列成为我国目前面 临的、由于人类活动而造成的两大自然灾害之一，严重制约沿海经济的发展、破 坏海洋生态环境、威胁人类健康。防治赤潮应该将预防和治理相结合，首先应消 除引发赤潮的诱因以达到预防的目的；其次，赤潮一旦发生，立即采取相应措施 进行治理，减小损失，即在防治对策的实施中坚持“以防为主，防治结合 的原 则。 1 2 1 有害赤潮的预防 防治赤潮最好的办法是尊重自然规律，加强生态观念，在发展经济的同时， 注重生态环境建设。控制沿海工业和生活污水的任意排入，避免海区的富营养化， 从源头起有效控制。另外建立赤潮防治和监测监视系统，对有迹象出现赤潮的海 区进行连续的跟踪监测，及时掌握引发赤潮环境因素的消长动向，为预报赤潮的 发生提供信息。 1 2 2 赤潮的治理 赤潮已经成为目前世界上公认的海洋灾害之一，其对水体水质、水环境安全、 水生态系统平衡、渔业和水产养殖业等方面造成了破坏，对人类健康也构成了严 重的威胁，而且带来了严重的环境问题和巨大的经济损失，因此寻求有效的赤潮 防治途径势在必行。目前治理赤潮常用的方法有物理法、化学法、生物法，其中 2 青岛科技大学研究，学位论文 利用生物防治的策略安全性高、经济高效，特别是利用微生物抑制赤潮藻类受到 越来越多环境工作者的关注。 1 1 物理法 物理方法是通过物理途径减弱甚至消除藻类的繁殖条件或使藻类沉淀于水 底。主要方法包括机械法、臭氧曝气法、紫外线辐射法、气浮法和高压静电法除 藻等。 机械法除藻在一定程度上能够隔离赤潮藻，降低赤潮藻带来的影响，但却不 能灭杀和去除赤潮藻。臭氧曝气和紫外线辐射法除藻效果较好，但价格较高，且 处理水无持续抑藻的能力。气浮法和高压静电法除藻需要专门的仪器设备，一次 性投入成本高不宜于大面积操作。 虽然物理法除藻方法简单且不会对环境造成二次污染，见效速度也快，但是 此法效率较低，相对费用较高，而且无法消除有毒藻死亡后释放出的有毒物质， 仅适于做应急措施。 劲化学法 在目前应用的除藻技术中，化学方法是应用最广、发展最快的。化学法是利 用一些对赤潮生物细胞破坏力大、其自身的毒性又比较低、对海洋环境不造成污 染或污染轻微的化学物质来抑制、杀死或除去赤潮生物的方法。按其作用机理可 分为以下三类：直接灭杀法、絮凝剂沉淀法和天然矿物絮凝法。 幻直接灭杀法 直接灭杀法是杀灭赤潮生物常用的方法之一，主要是利用化学试剂直接杀死 赤潮生物，该方法操作简单，化学试剂用量少。化学预氧化杀藻是通过化学药剂 与构成微生物蛋白质的半胱氨酸的s h 基反应，使以s h 基为活性位点的酶钝化， 并可破坏某些藻类的细胞壁、细胞膜及细胞内含物而使其灭活甚至解体，从而杀 灭活体藻细胞，是一种工艺简单，操作方便的有效杀藻方法。硫酸铜是治理赤潮 研究中最早使用的化学试剂，主要通过铜离子作用于藻胆体，抑制其对光能的吸 收和传递，影响藻类的正常代谢从而达到杀灭藻类的目的，具报道，硫酸铜的浓 度仅为o 5 1 时便可杀死裸甲藻，但是铜类试剂具有毒性，在杀死赤潮生物的 同时对其它动植物也产生影响，并且利用这种方法控制赤潮投入成本较高，效果 也只是暂时性的，不能达到长期有效地治理。 目前国际上要求直接灭杀赤潮生物的化学试剂应具有以下特点：首先在低浓 度下能迅速破坏、杀死赤潮生物，而且过量的药物在海水中易分解、消失，不产 生二次污染；其次这种化学试剂对非赤潮生物不产生影响( 或影响很小) ，最后 从推广应用价值考虑要求成本比较低。目前如高锰酸钾、次氯酸钠、二氧化氯、 臭氧、氯气、过氧化氢、过碳酸钠等这些在水体中易分解、残留少、污染轻的氧 3 海洋弧菌s - 9 8 0 1 抑藻作用及作j f j 机制研究 化物应用较多，这些物质可以通过氧化作用破坏藻细胞从而达到出去赤潮生物的 目的。相对于前面提到的无机化合物，有机除藻剂药力持续时间长，对非赤潮生 物的影响较小，但是有机除藻剂速效性差，易受潮、流及扩散等因素的影响。 大多学者致力于找寻更为有效且对环境友好的化学试剂，吴敏1 6 】等研究结果 表明p 甲萘醌衍生物哌嗪甲萘醌亚硫酸盐( m p b ) 和三氨基三嗪甲萘醌亚硫酸盐 ( m t b ) 在极低的剂量时就可对小球藻有良好的抑制效果。而且m p b 和m t b 具 有很好的生物降解性能，用作防污和杀生方面不会影响生态平衡。张树林【7 1 等研 究发现三氯异氰脲酸对铜绿微囊藻具有很强的杀藻能力，而三氯异氰脲酸能够持 续提供一定浓度的有效氯，具有快速、高效、杀菌力强、储存稳定的特点，其使 用后最终产物是氨、二氧化碳等，对环境无害、对人体安全、无致畸和致癌作用。 化学药剂除藻技术虽有快速高效的优点，但其灭杀效果不彻底、对生态环境和 非赤潮生物影响、成本等问题仍尚待解决。 b 1 絮凝剂沉淀法 絮凝剂沉淀法是通过添加一定量的絮凝剂，利用物质的胶体化学性质使赤潮 生物絮凝、沉淀的方法。目前国际上使用的絮凝剂主要有无机絮凝剂和有机高分 子絮凝剂。普遍使用的无机絮凝剂是铝和铁的化合物，主要利用铝盐和铁盐在海 水状态下形成胶体粒子，对赤潮生物产生凝聚作用，从而去除赤潮生物。该作用 与水体的p h 值有关，胶体粒子表面电荷越少，凝聚作用越强。 有机絮凝剂包括合成类有机絮凝剂和天然有机絮凝剂，实验表明带正电且有 一定链长的有机高分子絮凝剂治理赤潮效果较好，如聚丙烯酰胺丙烯酸羟基丙酯 基三甲基氯化铵。但是合成絮凝剂一般难降解而且副作用较大，因此目前使用较 少，然而从天然生物体或其代谢产物中提取具有特殊官能团的高分子，对环境污 染较小，副作用也小，应用较广嘲。 用絮凝剂法处理生物密集的赤潮效果明显，且消除赤潮生物所需时间短，对 非赤潮生物影响比直接灭杀法小，在消除赤潮生物同时可消除水体中的其它悬浮 物。但是使用这种方法成本高，而且铁盐本身可以促进赤潮生物增殖，铝盐等也 有一定的污染，从而限制了絮凝剂法在治理赤潮方面的使用。 曲天然矿物絮凝法 用天然矿物( 如黏土) 治理赤潮是一种很有发展潜力的方法，日本是最早研 究天然粘土矿物治理赤潮的国家，早在1 9 6 1 年，日本的小岛祯男就对粘土矿物除 藻作用进行了研究。s e n g c 0 1 9 】研究2 5 种天然粘土矿物对赤潮藻的凝聚作用，发现 凝聚作用较强的1 2 种天然粘土矿物主要是由蒙脱石矿和f l o r i d a 磷酸盐构成。我国 在九十年代初也开始进行粘土矿物治理赤潮方面的研究，俞志h 月【1 0 l 在研究粘土对 原甲藻和夜光藻的吸附实验中发现高岭土的絮凝除藻能力强于同等条件的蒙脱 4 青岛科技大学研究生学位论文 土，打破了日本科学家代田认为高岭土无明显除藻作用的观点。 与前两种方法相比，用粘土矿物治理赤潮的成本低、对环境和非赤潮生物影 响也远远小于直接灭杀法和絮凝剂沉淀法，但是其溶胶性质差，迅速凝聚、沉淀 赤潮生物能力低，而且在量少时难以完全消除赤潮生物。在治理大面积赤潮的实 际应用时必须大量散播粘土，这就出现了原料量和淤渣量过大的问题。通过大量 实验研究发现，对粘土进行改性后，粘土粒子中阳离子置换容量增高、比表面积 增大，对赤潮生物的灭杀能力和凝聚作用也增强。俞志明1 1 1 】等在其研究中发现用 酸对粘土改性后，蒙脱土对藻的絮凝去除率从5 0 提升到9 0 。曹西华等【1 2 1 以我 国沿海典型赤潮生物一东海原甲藻为研究对象，利用阳离子型有机表面活性剂十 六烷基三甲基溴化铵对粘土进行表面改性，结果表明当有机粘土用量为0 0 1 l 时，对该藻2 4h 内去除效果可提高近9 5 。 由于天然矿物治理赤潮时对生物和环境无害，可促进生态系统的物质循环和 净化，操作简单易行，适宜大面积使用，而且粘土资源不仅丰富，还是底栖生物 和鱼贝类幼仔的饵料，因此用天然矿物治理赤潮是目前国际上运用较广的方法。 3 ) 生物法 生物法是利用生物间的营养竞争、摄食作用和相生相克作用，通过向赤潮水 体中引入它们的“天敌”如细菌、病毒、捕食赤潮生物的浮游动物、水生植物、 大型藻类等，达到降低赤潮生物密度或将其去除的效果，从而防止赤潮的发生或 消除赤潮。由于利用其它生物治理赤潮不仅可以抑制赤潮生物生长，降解赤潮生 物产生的毒素，使海洋环境保持长期可靠的生态平衡，而且这种方法操作简单、 不易引起污染，因此生物法治理赤潮得到了越来越多学者的认同【净1 7 1 。该法按所 用生物的不同主要分为以下几种类型： 幻利用植物间的拮抗作用抑制赤潮生物的生长 大型植物不仅能吸收水体中的营养物质，为水中营养物质提供输出的渠道， 而且能与赤潮微藻竞争有限的营养盐和光照方式，防止赤潮生物的爆发性繁殖与 增长f 1 8 1 9 】；另一方面，它们能够向环境中分泌相生相克类化学物质来限制赤潮微 藻的生长刚。而且这些化感物质是水生植物生长过程中产生的次级代谢物质，一 般能在自然条件下降解，不会在生态系统中长期积累，生态安全性好【2 1 】。 j i n 署 i d o n g t 2 2 】研究发现大型海藻孔石莼( u l v ap e r t u s a ) 通过分泌一些相生相 克类化合物抑制共培养体系中的赤潮异湾藻( h e t e r o s i g m aa k a s h i w o ) 和塔玛亚历 山大藻( a l e x a n d u mt a m a r e n s e ) 的生长，王悠【2 3 】等研究t 2 种大型海藻石莼( u l v a p e r t u s a ) 和江篱( g r a c i l a r i al e m a n e i f o r m i s ) 对东海原甲藻( p r o r o c e n t r u m d o n g h a i e n s e ) 和塔玛亚历山大藻( a l e x a n d u mt a m a r e n s e ) 生长的影响，结果表明在 大藻( 石莼或江蓠) 微藻( 东海原甲藻或塔玛亚历山大藻) 的共培养体系中，石 5 海洋弧菌s 9 8 0 1 抑藻作用及作用机制研究 莼和江蓠均能明显影响与其共培养的微藻的生长，并且石莼对微藻的影响强于江 蓠的作用。 大量研究发现凤眼莲具有抑藻效应，并指出凤眼莲主要通过根系分泌化感物 质，破坏其它藻体的叶绿素，影响其光和作用，降低细胞还原t 】r c 能力来抑制藻 类生长【2 4 ，2 5 1 。c h e n 2 6 l 等在研究中发现凤眼莲根粉末及其提取物对塔玛亚历山大藻 a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e 生长有显著的抑制作用，刘洁生阳等研究了风眼莲对东海 原甲藻生长的抑制作用，并通过g c m s 和h p l c 检测，推测n - 苯基2 萘胺和亚油 酸可能是风眼莲根抑藻的主要因子。但是值得注意的是凤眼莲是世界上一种漂浮 型有害水草，其本身对环境和生态都会造成严重危害，因此在应用凤眼莲抑藻时 应考虑到要避免其本身对环境造成的危害。 g i b s o n t 2 鲫，b a l l 2 9 1 等，张薛【3 0 】等，刘洁生【3 l 】等，研究了大麦秸秆对藻类生长 的抑制作用，结果表明大麦秸秆能很好地抑制藻类生长，而且腐烂的大麦秸秆提 取液在较低浓度时就对藻类有较强的抑制作用。r i d g e 年1 p i l l i n g e r t 3 2 1 等认为大麦秸 秆的抑藻物质是氧化的木质素，f e r r i e r 3 3 】等研究推测大麦杆对一些藻类生长没有 明显作用，可能是由于大麦杆的存在可增加浮游生物数量，通过改变生态结构从 而抑制藻类生长。 苦草能分泌生化抑制物质抑制羊角月牙藻和斜生栅藻的生长，而且它还是草 食性鱼蟹的喜爱饵料，所以可以在浅水湖泊中种植苦草等水生高等植物，放养适 量的鱼类，既可以保护水质，又可以发展渔业生产，增加经济效益。此外水花生、 穗花狐尾藻、西洋菜、水浮莲、满江红、石菖蒲、紫萍、马来眼子等大型水生植 物都能释放化感物质来去除水华藻，其中一些生物活性成分已被分离纯化并用于 淡水水华的控制和治理中。 b 、) 利用海洋动物或海洋滤食性动物抑制赤潮生物的生长 利用海洋动物或海洋滤食性动物抑制赤潮生物的生长是根据生态系统中食 物链的关系，引入摄食赤潮生物的其它动物( 如挠足类浮游动物、微型浮游动物 及纤毛虫等) ，通过捕食达到抑制或消灭赤潮生物的目的。t a k e d a & k u d h a r a l 3 4 1 在发生赤潮的水体中放入滤食性动物m y t i l u se d u l i sg a l l o p r o v i n c i a l i s ，结果发现这 种贻贝体内能有效地保留大于4 p m 的食物颗粒，通过贻贝的滞留，赤潮水体中的 浮游植物被迅速地除去，而贻贝排泄出的粪便迅速沉积在海底或被底栖动物海参 s t i c h o p u s j a p o n i c u s 所利用。除了贻贝外，牡蛎、扇贝、蛤蜊、文蛤等双壳贝类对 赤潮生物的摄食率也较高。这种方法是预防和清除赤潮的有效途径，但是由于有 毒赤潮的毒素会富集在食物链中，因此此方法不适于应用在产生赤潮毒素的赤潮 治理中。 c ) 利用微生物抑制有害藻类 6 青岛科技大学研究生学位论文 利用微生物控藻是利用生物法控藻中最有前途的一种控藻方式，具有廉价、 安全、特异、维持水体生态平衡的特点。f 1 2 0 世纪6 0 年代起，人们一直致力于研 究用生物控制试剂去除水体中多余的藻类，目前潜在的生物控制试剂主要包括病 毒、真菌、细菌、放线菌、原生动物、轮虫等。 病毒 病毒主要是指噬藻体( c y a n o p h a g e ) ，在海水中含量很高，它是以蓝藻为宿 主的病毒类群，早在1 9 6 3 年s a f f e r m a n 和m o r r i s 首次报道了可以感染鞘丝藻 ( l y n b y a ) 、席藻( p h o r m i d i u m ) 及织线藻( p l e c t o n e m a ) 的l p p 病毒1 3 5 1 。 病毒或病毒类粒子( v l p s ) 在浮游生物群落演替中可能具有极其重要的作用， 在水华和产毒蓝藻中常发现藻细胞中含有病毒和v l p s ，有研究表明可用病毒和 v l p s 来控制水华、抑制有毒藻类生长。f u h r m a n 3 6 1 指出病毒在海水表层的浓度高 达1 0 1 0c e l l l 1 ，造成了海洋细菌与蓝藻宿主的高致死率和初级生产力的下降。此 外病毒和v l p s 还是通过特异性溶解宿主维持种群关系平衡的关键因子，可以特异 性地感染亲缘关系邻近的一些藻1 3 7 1 ，这类病毒可用作转移致死基因的载体，杀死 有害或不需要的藻体。n a g a s a k i 3 8 】等研究了赤潮异湾藻( h e t e r o s i g m a a k a s h i w o ) v i r u sd o n e0 1 ( h a v 0 1 ) 病毒生长特性，其在赤潮异湾藻中的潜伏期为 3 0 3 3 h r ，在自然环境中，该病毒具有很高的增殖速率。h a v 0 1 的严格专一性，不 会对其它生物产生任何影响，采用h a v 0 1 来治理赤潮异湾藻具有一定的可行性。 病毒作为控制因子是安全的，复制周期很短，能迅速降低水体中特定藻类的 数量，而且对其宿主的侵染具有很高的特异性。但是病毒在自然条件下的侵染性、 有效性和适应性还有待研究，病毒的寄主藻群之中也存在着敏感群和抗性群，后 者阻碍了其专一性，使得病毒不能裂解多种藻类。 真菌 真菌主要通过以下两个途径影响藻类的生长：一是释放抗生素或抗生素类的 物质，一是寄生溶藻。青霉素就是由青霉菌分泌的一种广泛用于医药和科研的抗 生素，青霉素不仅对细菌的生长有明显的抑制作用，而且对藻类也有很强的毒性。 除青霉素( p e n i c i l l i n ) 外，由几个支顶孢真- 嚣l 4 c r e m o n i u mc h r y s o g e n u m 的品系及 一些丝胞壳属e m e r i c e l l o p s i s 的种类分泌的头孢霉素c ( c e p h a l o s p o r i nc ) 等对藻类 也有很强的毒性。其作用机制和青霉素相同，都是通过抑制粘肽合成的后期酶活 性，和限制初生粘肽与既有的完整粘肽上侧链相联接，来阻止蓝藻细胞壁中的粘 肽层( l 2 ) 的形成。由于失去了主要骨架结构的粘肽层支持，细胞变形，大多数 的细胞变成球形体或原生质体，随后被溶解掉【3 9 1 。真菌在藻类中寄生是比较普遍 的，报道最多的宿主是水绵属s p i r o g y r as p 的藻类，寄生物有卵菌纲o o m y c e t e s ； 细长腐霉p y t h i u mg r a c i l e ；噬藻丝水霉a p h a n o m y c e sp h y c o p h i l u s 和星状水霉 7 海洋弧菌s 一9 8 0 1 抑藻作用及作j j 机制研究 s a p r o l e g n i aa s t e r o p h o r a 等真菌。j e n k i n s l 4 0 1 等从一种海洋真菌s c y t a l i d i u ms p 提取了 两个环状缩肽，e x u m o l i d ea 和b ，并且发现在浓度达到2 0 t g m l 时对海洋单细胞 藻杜氏藻( d u n a l i e l l as p ) 的生长有明显的抑制作用。 放线菌 放线菌可以产生多种生物活性物质，但是水体中的放线菌数量和种类有限， 目前研究中的溶藻放线菌大部分是从土壤中分离得到的。a i t a i 分离到的2 5 种可 以抑制蓝藻生长的放线菌，一株a n 6 分泌到细胞外的物质可以导致蓝藻、绿藻、 真菌的裂解。s i g e e 等分离到的脱叶链霉菌( s e x f o l i a t u s r g l 2 ) 可以裂解9 种蓝藻， 包括形成水华的鱼腥藻、微囊藻和颤藻【4 l l 。肖慈琼【4 2 1 等从土壤中分离到1 3 株具有 抑藻活性的放线菌，经过进一步筛选得到a n 0 2 菌株，该菌株胞外代谢产物对铜绿 微囊藻具有较好的抑杀作用。b i a b a n i l 4 3 】等人从墨西哥海湾底沉积物中分离得到海 洋链霉菌b 7 7 4 7 ，研究发现该菌能产生一个抑藻的植物性毒素a n t h r a n i l a m i d e3 ，对 微藻c h l o r e l l av u l g a r i s ，c h l o r e l l as o r o k i n i a n a ，c h l o r e l l as a l i n a 和s c e n e d e s m u s s u b s p i c a t u s 的生长有抑制作用，其最小抑制浓度( m i c ) 达到2 0 1 0 7m 幽【i l l 。 其它藻抑制微藻的生长 研究结果表明一些微藻问存在着拮抗作用。早在1 9 6 0 年h o g e t s u l 4 4 l 等研究发现 共培养时赤潮异湾藻强烈抑制以中肋骨条藻为优势种的中心硅藻的增殖，而对三 角褐指藻和异湾藻本身的生长则有促进作用，通过进一步的研究发现这主要是由 于赤潮异湾藻分泌的一种多糖的作用。s i n g h l 4 5 l 等发现铜绿微囊藻m i c r o c y s t i s a e r u g i n o s a 能释放一种活性物质一肝毒素( h e p a t o t o x i n ) ，这种活性物质对某些 特定绿藻和蓝藻等微藻的生长能起到抑制作用。n a g a y a m a i 删等探讨了褐藻 e c k l o n i ak u r o m e d e 的乙酸乙酯萃取物对赤潮生物( k a r e n i am 溉n o t o i 、c o c h l o d i n i u m p o l y k r i k o i d e 和c h a t t o n e l l aa n t i q u e ) 的灭杀作用，结果表明该粗产物能显著抑制k m i k i n o t o i 、cp o l y k r i k o i d e 两种微藻，并且通过观察发现，实验过程中藻细胞首先 丧失运动性，然后细胞变圆至最后溶解破碎。这种利用微藻问的拮抗作用治理赤 潮的方法最终结果可能是使无害藻类取代有害的藻类，但是不能达到完全治理赤 潮的目的。 1 3 溶藻细菌的研究概况 在利用物理、化学和其它生物学方法治理赤潮不理想的情况下，微型藻类和 海洋微生物之间的关系越来越引起人们的重视，随着人们将赤潮的发生、持续、 消亡以及毒素的产生过程分解为最基本的元素来研究，人们逐渐发现在海洋细菌 同有毒藻华相互关系中，海洋细菌对藻类的生长和毒力起着潜在的调控作用f 佣。 8 青岛科技人学研究生学位论文 1 3 1 溶藻细菌的种类 近年来，不少国外研究者认为水华和赤潮的突然消亡可能与溶藻细菌的感染 有关【鹪1 。早在1 9 2 4 年，g e i t l e r 4 9 1 就报道了一种粘细菌寄生多束菌( p o l y a n g i u m p a r a s i t i u m ) 寄生在刚毛藻( c l a d o p h o r a ) 上，导致藻的死亡。随着藻类学、水生 生态学和环境科学研究的进展，溶藻细菌在国外文献中陆续有一些报道，无论在 海洋生态系统中还是在淡水生态系统，都已经成功地分离了多株溶藻细菌f 5 0 l ，主 要有粘细菌脚施c 幼) 【5 1 1 、噬胞菌属( c y t o p h a g a ) 1 5 z , 5 3 1 、纤维弧菌属( c e l l v i b r i o ) 、 节杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) 1 4 9 1 、屈挠细菌属( f l e x i b a c t e r ) 、蛭弧菌属 ( b d e l l o v i b r i o b a c t e r i o u s ) 、杆菌属( b a c i l l u s ) 、黄杆菌属( 砌v o b a c t e r i u m ) 、弧 菌属( v