（有机化学专业论文）高效液相色谱法测定d—泛酸钙含量的方法研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名； 日期：皿肆 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 导燃：萄密 期：竺扯型口 | 山东大学硕士学位论文 摘要 本论文通过卖验建立了d 一泛酸钙含量的高效液相色谱检浏方法， 建立了一种区分真假泛酸钙的有效方法。根据d 一泛酸钙和含有的杂质 在结构及性质上的差异，分别选用不同的柱温、流动相比例，流速等 条件以确定最佳色谱方法然后对所确定的液相色谱方法进行了验证， 证明此方法能够适合d 一泛酸钙含量的测定。 先对d 一泛酸钙标准品的色谱分离条件分别进行了探索和优化，最 终确定色谱柱选用c 1 8 色谱柱，流动相用o 0 2 m 磷酸二氢钾水溶液和 乙腈，建立起d 一泛酸钙的h p l c 检测方法本文以市售d 一泛酸钙为样 品( 山东新发药业有限公司生产) ，对所建立的检测方法进行了验证， 通过精密度、准确度和标准曲线等验证项目的实验，结果表明，本文 所建立的d 一泛酸钙的高效液相色谱检测方法可以准确地检测产品的含 量；利用液相色谱图谱，可以有效地区分真假d 一泛酸钙，d 一泛酸钙样 品图谱与标准品图谱在相同的保留时间处，有类似谱图，含量符合规 定；搀假的泛酸钙主要靠添加无机钙盐、尿素和葡萄糖等使比旋度、 钙含量、氮含量达到国家标准，但这些物质在此处无谱图造成峰面积 很小，外标含量低。 结果表明：根据实验证明，采用以下方法：色谱柱为o d s 一2c 1 8 ， 柱长1 5 0 m m ；流动相：乙腈+ 水( o 0 2 m o l l 磷酸二氢钾溶液p h = 3 ) = 1 0 + 9 0 ，检测波长：2 1 0 n m ，流速：0 8 皿l 皿i n ，进样量2 0 微升，柱温 2 5 度，可以有效地分离d 一泛酸钙中的各种杂质，准确的测定泛酸钙的 含量；同时可以鉴别d 一泛酸钙的真假。 关键词：d 一泛酸钙：高效液相色谱法；含量 5 a b s t r a c t 下h i st h e s i sb u i i tu pah p l ca n a i y s i sm e t h o do ft h ec o n t e n to f d c a i c n j mp a n t o t h e n a t e 。a n db u i i tu pt h ev a l i dm e t h o dt od i s t i n g u i s h t r u eo rf a i s ep r o d u c t i o n a c c or d n 口t ot h ed i 仟e r e n c eo fs t r u c t u r ea n a c h a r a c t e r b e t w e e n d c a i c i u m p a n t o t h e n a t e a n d i t s i m p u r t y ，c o l u m n ，w ec h o o s ed i 仃e r e n t c o i u m nt e m p e r a t u r e m o b j i e p h a s et dc o n f j r mt h eb e s tc o n d i t i o n s ，t h e nt ov a i d a t i o n t ob es u r e t h em e t h o da p p i i c a b l e w ec h o o s et h ea n a i y t l c a im e t h o db yt e s t ，t h a t i s ：a n a i y t i c a i c o i u m n ：c 18 。m o b f ep h a s e ：a c e t o n i t r j e ：0 0 2mp o t a s s i u md i h y d r o g e n p h o s p h a t es o l u t l o n l l o ：9 0 t h e m e t h o dl sv a l i d a t e db yt h et e s tt o d r e c j s j o n 。a c c u r a c ya n d s t a n d a r dc ur v e e t ct ov e r i f c a t i o nt h e m e t h o da c c u r a t e m a k eu s eo fh p l c 。 c a na v a i l a b l yc l a s s i f y t r u eo rf a i s e d c a i c i u m p a n t o t h e n a t e t h ed - c a l c i u mp a n t o t h e n a t e s a m p l e d i a gr a ma n d s t a n d a r dd i a g r a m h a v e s i m i i a f d i a g r a m i ns a m e r e s e r v a t i o nt i m e ，t h ec o n t e n tm e e t sp r o v i s i o n ：t h ef a l s ed1 8 m a n l y d e p e n do na d d i n gc a i c i u mi n o r g a n i c8 a n ，u r e aa n dg l u c o s e e t c tt o m a k es p e c i f i co p t ；c a lr o t a t l o n 。c a l c i u mc o n t e n t n i t r o g e f ic o n t e n t t o a t t a i nan a t i o ns t a n d a r d ，b u tt h e s em a t e r i a li nt h es a m e r e s e r v et i m e h a v en e v e ra b s o r b e dd i a g r a mt om a k ep e a ka r e av e r ys m a h t h e c o n t e n to fe x t e r n a is t a n d a r db el o w k e y w o r d s ：d c a i c j u mp a n t o t h e n a t e h p l c a s s a y 6 山东大学硕士学位论文 1 前言 1 1d 一泛酸钙概述 国外自本世纪4 0 年代起己开始进行泛酸钙的合成研究，其工业化 生产始于6 0 年代，主要生产国家为日本和美国，其中以日本的生产能 力为最大，约占世界总能力的l 2 ，日本第一制药公司的2 4 0 0 t a 装置 能力居全球之首，其国内消费量每年为4 0 0 5 0 0 t ，7 0 用作饲料添加 ； ! i ，2 5 用于嗣药，5 1 1 6 用作食品添加剂，其余大部分供出口。 国内d 一泛酸钙从6 0 年代后期开始研制，先后有上海市第二制药厂、 上海市第四制药厂、江苏昆山化工厂等进行试生产，但生产规模很小， 总能力不足1 0 0 t a ，且工艺较落后目前d 一泛酸钙国内生产厂家主要 为浙江鑫富和山东新发药业，工艺采用生物发酵法，工艺先进产品 主要是用于医药、食品和饲料添加剂，市场需求量大，国外市场前景 良好随着国内经济的发展和人民生活水平的提高，人们越来越重视 食品对自身健康的影响而用泛酸钙制作的各种营养保健食品，在强 化和改善食品的天然营养成分和含量比例、维持人体健康和提高精神 适应能力方面的作用十分显著 泛酸又称遍多酸、维生素b ，是辅酶 的组成部分，参与糖、脂 肪、蛋白质代谢辅酶 是泛酸与3 一磷酸腺苷、焦磷酸和巯基乙胺 结合的复合分子，因此，泛酸的作用即是辅酶 的生理功能：参与体 内脂肪酸降解、箱肪酸合成、柠檬酸循环、胆碱乙酰化( 一种神经冲动 传导物质) ，抗体的合成等代谢，泛酸的存在有j ! | 于各种营养成分的吸 收和利用。由于泛酸对热、碱、酸均不稳定，其商品形式主要为d 一泛 酸钙“” 泛酸钙( d c a l c i u ip a b t o t h e n 8 t e ，c a s ：1 3 7 一0 8 6 ) 是泛酸的右 旋体钙盐，d 一泛酸钙为白色吸湿性粉末，无臭，味微苦，易溶于水， 微溶予乙醇其水溶液为中性或弱碱性在阴冷、干燥条件下较稳定， 吸湿后或水溶液中会水解，效价降低，在酸、中性条件下更易破坏， 特别对酸敏感，对热中等敏感，但对氧化、还原作用和光稳定。 7 山东大学硕士学位论文 d 一泛酸钙的结构性质，泛酸钙结构式如下： c f 目前全球泛酸钙消费量大约9 0 0 0 t a ，欧美各国是泛酸钙的主要 消费市场，其中美国约3 2 0 0 t 、欧洲约2 8 0 0 t 、亚洲2 5 0 0 t 、拉美等地 区5 0 0 t 1 2d 一泛酸钙应用 泛酸钙大约7 5 用作饲料添加剂，2 5 用于医药和食品工业，丽近 年来其在国外医药领域的应用得到拓展，大量的保健晶均添加右旋泛 酸钙 1 2 1d 一泛酸钙在饲科添加剂中的应用 饲料添加剂( f e e da d d t i v e s ) 是指添加到饲粮中能保护饲科中的营 养物质、促进营养物质的消化吸收、调节机体代谢、增进动物健康， 从而改善营养物质的利用效率提高动物生产水平、改进动物产品品 质的物质的总称 d 一泛酸钙较高的生物活性使其在饲料行业中得以广泛应用，特别 是家禽家畜及鱼科类动物的生长发育、脂肪的合成私分解，都不可缺 少对泛酸钙的需求缺乏泛酸会导致家禽，家畜生长迟缓，生殖机能 发生障碍，适应性降低目前国内外市场的大约7 5 的d 一泛酸钙用 作禽畜饲料添加剂泛酸钙在此领域的消费需求缓慢增长 泛酸是由b 一丙氨酸借肽键与a ，y 一二羟一9 ，昼一二甲基丁酸缩 合而成的一种酸性物质 游离的泛酸是一种粘性的油状物，不稳定，易吸湿，也易被酸碱 和热破坏泛酸钙是该维生素的纯品形式，为白色针状物有右旋( d 一) 山东大学硕士学位论文 和消旋c d l ) 两种形式，消旋形式泛酸的生物学活性为右旋的二分之一 饲科中的泛酸大多是以辅酶a 的形式存在。少部分是游离的只 有游离形式的泛酸以及宝的盐和酸能在小肠吸收，不同动物对泛酸的 吸收率差异较大( 4 0 一9 4 ) 泛酸主要以游离形式经尿排出 泛酸是两个重要辅酶，即辅酶a 和酰基载体蛋白质( a c p ) 的组成成 分辅酶a 是碳水化合物、脂肪和氨基酸代谢中许多乙酰化反应的重 要辅酶，在细胞内的许多反应中起重要作用 c p 在脂肪酸碳链的合成 中有相当于辅酶a 的作用并己证明，a c p 与辅酶a 有类似的酰基结合 部位 猪缺乏泛酸，皮肤皮屑增多，毛细，眼周围有棕色的分泌物，胃肠 道疾病，生长缓慢并表现为典型的鹅步症尸检可发现神经退化和实 质性器官的病交 鸡缺乏泛酸，首先是生长受阻，羽毛生长不良，进一步表现5 为皮 炎，眼睑出现颗粒状的细小结痂并粘连在一起，嘴周围也有痂状的损 伤，胫骨短粗，严重缺乏时可引起死亡 泛酸广泛分布于动植物体中，苜蓿干草、花生饼、糖蜜、酵母、 米糠和小麦麸含量丰富；谷物的种子及其副产物和其它饲料中含量也 较多常用饲粮一般不会发生泛酸的缺乏饲粮能量浓度增加，动物 对泛酸的需要量增加饲粮脂肪含量高可促使猪出现泛酸缺乏症。抗 生索能节约鸡和猪对泛酸的需要高纤维饲粮可使瘤胃微生物的泛酸 合成减少，而高水平的可溶性碳水化合物可促进泛酸的合成维生素 b 1 2 能节约家禽对泛酸的需要。高蛋白质也可节约大鼠对泛酸的需要 不同品种的生长猪对泛酸的需要也存在差异，相差可达4 0 畜禽对泛酸的需要量一般为每千克饲科7 一1 2 m g ，鱼类为l o 一3 0 m g 泛酸中毒只在饲喂超过需要量l o o 倍剂量的大鼠中发现 1 2 2d 一泛酸钙在食品添加剂中的应用 鉴于d 一泛酸钙具有补充人体内维生素b 需求和增强食品风味两方 面的功效，食品加工领域主要用于制作各种营养保健食品泛酸虽然 广泛存在于食品中，但随着加工过程中要损失2 0 4 0 ，甚至高达 9 山东大学硕士学位论文 5 0 的泛酸，因此，在一些强化食品中应适当添加d 泛酸钙根据我 国卫生部食品营养强化剂使用卫生标准 ( g b l 4 8 8 0 一9 4 ) ，每公斤 婴幼儿食品中添加1 5 2 8 m g ( 以泛酸计) 、每公斤饮液中添加2 4 r a g ( 以泛酸计) 泛酸还添加于烧酒、威士忌酒中以增强风味，添加 于蜂蜜中防止冬季结晶，还能缓冲咖啡囚及糖精等的苦昧目前国内 外市场的大约6 d 一泛酸钙用于食品工业，泛酸钙在此领域的消费量 基本平稳。 国家食品卫生标准规定的泛酸( d 一泛酸钙) 使用范围和使用量如 下表( 一) ： 颁布年份使用范围最大使用量 娶幼儿食品 l5 - 2 8 m g ，k g 9 4 年 饮液 2 - 4 m g 仕g 9 7 年固体饮料 2 9 6 6 0 m g ，k g o o 年 含乳固体饮料 4 8 8 6 5 3 m g ，i o o g 即食早餐谷类食品 3 0 一5 0 m g ，k g o o 年 果冻 2 5 m g ，k g 即食早餐谷类食品 3 0 一5 0 m g ，k g 0 1 年 果冻 2 5 m g ，k g 0 2 年 可可粉及其他营养型固体饮料 2 2 8 m g ，l o o g 孕产妇配方奶粉2 0 一8 0 m g ，k g 0 4 年 婴儿配方奶粉较大耍儿及幼儿配方奶耪1 5 4 0 m g ，k g 儿童配方奶粉 3 0 一6 0 m g ，k g 0 6 年 学龄前儿童配方奶粉 1 o 一2 o m g ，d 0 7 年 果汁( 味) 饮料茶饮料和碳酸饮料 1 1 2 2 m g 压g ( 以泛酸计) 0 7 年 婴儿配方食品较大婴儿和幼儿配方食品 1 s 一8 5 m g ，l o o g 1 2 3d 一泛酸钙在医药中的应用 d 一泛酸钙属维生素类药物，是人体和动物体内辅酶a 的成分之一， 存在于活细胞中，作为辅酶a 的组成物质参与调节蛋白质、糖和脂肪 的代谢，改善毛发色泽并预防疾病人类的一些没有明显特征的疾病 l o 山东大学硕士学位论文 都可归咎于泛酸缺乏所引起例如在脚气病、核黄素缺乏症和糙皮病 的患者血液中常可观察到泛酸的水平很低。d 一泛酸钙作为b 族维生素， 在国内外广泛应用于医药工业，其单方制剂主要适应症为泛酸缺乏症， 复合维生素b 和多种维生素制剂主要用于补充维生素，而与不同组分 配伍的复方制剂适应症更广，如胃肠道疾病，呼吸道疾病，皮肤疾病， 精神不振，神经衰弱等另外，泛酸钙还用于保健食品目前国内外 很多保健品都添加泛酸钙，如养生堂的“成人维生素”、。成长快乐 等泛酸钙在此领域的消费需求增长最快 从全球市场而言，目前大约1 9 d 一泛酸钙用于医药工业，但有些 地区如日本在此领域的消费比例要高于这数值。 1 3d 一泛酸钙的含量测定方法综述 1 3 1茜素分光光度法测定泛酸钙含量 茜素是一种缺电子化合物，可与富电子有机物质如含氮药物进行 电荷转移反应，本试验利用泛酸钙与茜素的电荷转移反应建立了泛酸 钙含量分析的分光光度法”1 方法所用仪器包括：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅和酸度计； 试剂包括茜素的乙醇溶液、d 一泛酸钙等 实验方法：取泛酸钙溶液适量置于5 毫升比色管中，加入茜素溶 液2 0 毫升，用乙醇稀释至刻度，摇匀，以试剂空白为参比，在5 6 0 n m 处测量吸光度利用已做的标准曲线计算d 一泛酸钙的含量。 1 3 2 应用旋光度法测定泛酸钙含量 旋光度法测定d 一泛酸钙的含量是利用旋光仪测定出不同浓度泛 酸钙的旋光度，经过统计处理，得出浓度与旋光度的回归方程样品 检测时可检测出溶液的旋光度，然后带入方程进行计算可得检测方 法如下 精密称取d 一泛酸钙对照品适量，制成浓度为1 0 o ，2 0 o ，3 0 0 ， 4 0 o ，5 0 o ，6 0 o ，7 0 0 ，8 0 0 ，9 0 o m g m l 的溶液，用旋光仪检测旋 光度，分别为o 2 4 8 ，0 5 0 0 ，o 7 4 1 ，o 9 8 6 ，1 2 3 4 ，1 4 5 7 ，1 7 0 2 ， l l 山东大学硕士学位论文 1 8 7 6 ，2 1 3 5 。经过统计处理后，回归方程为y ；4 2 6 0 l l x 1 4 9 5 3 检测样品时，精密称取样品5 o o o 克放入1 0 0 毫升容量瓶，用水溶解 并稀释到刻度，按旋光度检测方法检测得旋光度，带入方程可以得出 d 一泛酸钙韵含量。 此方法虽然简便易行，但旋光度检测受温度等环境因素影响大， 拟合方程时也带来误差，势必使计算结果的误差加大，同时由于使用 了旋光仪，掺入比旋度高的物质做成的假泛酸钙，检测出的含量就很 不真实了，无法实现区分假货妁耳韵， 1 3 3 高效毛细管区带电泳法同时测定迂酸钙、量一丙氨酸钙和丫一 丁内鸶 本文采用高效毛细管区带电泳技术测定了饲料级泛酸钙产品中泛 酸钙的含量，为毛细管电泳技术在泛酸钙工业化生产中的分析监测提 供了实验依据毛细管电泳法是以高压电场为驱动力，以毛细管为分 离通道，依据试样中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离、 分析物质的一类液相技术实验所用仪器：毛细管电泳仪。二极管阵 列检测器。实验条件：缓冲溶液( 浓度1 0 m m d l l ) 的磷酸盐溶液，p h 等于8 5 ：分离电压：1 0 k v ；实验温度：3 0 ；检测波长：1 9 2 n m ；进 样：l k p a 3 s 。本方法的主要目的在于同时测定样品中的d 一泛酸钙、 b 一丙氨酸钙和y 一丁内酯的含量” 1 3 氨基酸分析仪蔫定泛酸钙的方法 本文根据d 一泛酸钙在酸作用下分解为8 一丙氨酸及其他产物的性 质，研究利用6 m 0 1 l 盐酸，在l l o 水解d 一泛酸钙，采用氨基酸分 析仪测定b 一丙氨酸含量来检测饲料添加剂d 一泛酸钙纯度本方法可 满足饲料添加剂中d 一泛酸钙的检测要求“ 1 3 5d 一泛酸钙的高氯酸滴定测定方法 溶解o 1 8 0 9 样品在5 0 m l 冰乙酸中( 9 9 6 ) 用o ，1 m 0 1 几高氧 酸( 珏c 1 0 。) 滴定，用结晶紫指示液( 5 9 l ) 作指示剂，渣定至溶液显 1 2 山东大学硕士学位论文 蓝绿色为终点，同时作空白1 m l o 1 m o l l 高氯酸等于 2 3 8 3 m g c ，。h 3 ：c a n ：0 本方法虽然简便，但实践证明在终点时变色不明 显，很难判定终点颜色，造成读数误差大，同时冰乙酸和高氯酸刺激 性强，腐蚀大，操作危险“1 1 3 6d 一泛酸钙中氮含量和钙含量测定方法 钙含量， 精确称取o 5 9 样品，溶解在1 0 0 m 1 水中，加入4 3 的氢氧化钠 试液和0 1 9 钙紫红素指示剂，用o 0 5 m 0 1 l 乙二胺四醋酸二钠滴定液 滴定至溶液变为蓝色。每l m l o 0 5 m o l l 乙二胺四醋酸二钠滴定液相当 于2 0 0 4 m g 钙 氮含量 取o 5 9 样品，精确称重，放入5 0 0 皿】烧瓶中。样品如果是固体或 半固体，则用无氮滤纸包好后，转移至瓶中加入l o g k 。s o 。粉末( 或无 水n a ：s o 。) ，o 5 9 c u s 0 4 粉末再沿瓶壁缓缓加硫酸2 0 m 1 ；在烧瓶口放 一小漏斗并使烧瓶成4 5 。斜置，用直火缓缓加热，使溶液的温度保持 在沸点以下，等泡沸停止，强热至沸腾，至溶液成澄明的绿色后，继 续加热3 0 分钟，放冷沿瓶壁缓缓加水2 5 0 m l ，振摇使混合，放冷后， 加4 0 氢氧化钠溶液7 5 m l ，注意使沿瓶壁流至瓶底，自成一液层，加 锌粒数粒，不要停留，连接好连接球管( 先前已和冷凝器连接) ，导出 管放入装有5 0 m l 硼酸溶液( 2 ) 的5 0 0 m 1 锥形瓶或广口瓶液面以下 混合瓶中溶液( 轻轻旋转) ，蒸馏至接受液的总体积约为2 5 0 m l 时，将 冷凝管尖端提出液面，使蒸气冲洗约1 分钟，用水淋洗尖端后停止蒸 馏；馏出液用硫酸滴定液( o 0 5 m o l l ) 滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色， 并将滴定的结果用空白试验校正每l m l 韵硫酸滴定液( o 0 5 m 0 1 l ) 相 当于1 4 0 l m g 的氮“。” 很多厂家根据氮含量来折算泛酸钙的含量，虽然能够算出泛酸钙 含量，但误差很大，因为本身氮含量测定时就有很多人为魄的误差因 素 钙含量和氮含量是检浏d 一泛酸钙质量的主要指标，国家饲科添加 1 3 山东大学硕士学位论文 剂标准和美国药典标准都以这两个指标为主就是因为如此才造成d 一 泛酸钙市场出现很多假货，因为，钙含量可以通过添加氯化钙获得， 而氮含量通过添加廉价的尿素也很容易达标；所以从这两个指标根本 无法真正判定产品的质量 1 4 本课题研究的意义和目的 国家标准规定了饲料添加剂d 一泛酸钙含量测定方法是测定氮含 量和钙含量，没有直接的含量测定方法；中国药典、中国兽药典、美 国u s p 2 8 都是如此。在英国药典b p 2 0 0 3 中规定了泛酸钙总含量典测定 方法，这是唯一一个涉及测定泛酸钙本身含量的药典，不过是通过电 位滴定的方法，不但过程复杂，而且难于平行，不适合企业快速测定， 同时无法测出杂质含量的情况饲料添加剂国家标准和美国药典只测 定氮含量和钙含量，很难准确评价药品的质量，目前市场上出现了通 过添加氯化钙、尿素和葡萄糖的方式使钙、氮和比旋度符合规定，这 样就必须有一种方法能够识别假货本文通过摸索建立一个高效液相 色谱法测定d 一泛酸钙含量，能够快速准确地进行分析，通过外标法准 确测出泛酸钙的含量，避免假货。 1 4 山东大学硕士学位论文 2 高效液相色谱介绍 2 1 高效液相色谱法概述 作为对高沸点、热不稳定有机化会物及生化试样的高效分离分析 方法，高效液相色谱法在分析化学中占有重要地位高效液相色谱与 气相色谱两者的分析对象几乎涉及了所有的有机化合物随着生物有 机化学工业的迅速发展，高效液相色谱的作用将会更加重要 高效液扭色谱法的历史可以追溯到最初的柱层析分离法柱层析 法依靠重力使流动相通过固定相，则固定相的颗粒必然较大，分离能 力差，稍复杂试样的分析时间可能长达数天，费力费时，使得该方法 发展缓慢气相色谱法的迅速发展促进了色谱理论的成熟高压输液 泵、高灵敏度检测器的采用，使经典液相色谱在2 0 世纪7 0 年代发生 了巨大变化并迅速发展，形成了以高压，高效、高速、高灵敏度为特 点的高效液相色谱分析法另外以溶剂为流动相的高效液相色谱通常 在室温下进行分离，只需将试样制成溶液，且分离过程中不存在气化 和加热的操作，特别适用于高沸点，热稳定性差、分子量大及生化试 样的分析而成为其另一个显著特点 高效液相色谱分离原理：高压泵输送流动相和试样组分高速流过 色谱分离柱时，具有不同分配系数的组分在两相间经过反复多次的分 配平衡时被分离，通过检测器时被检测并给出信号” 2 2 高效液相色谱分析方法特点及条件选择 高效液相色谱有以下特点；压力可达1 5 0 3 0 0 k g c m 2 色谱柱每 米降压为7 5 k g c _ 2 以上高速一流速为o 1 l o 0m l 皿i n 高效可达 5 0 0 0 塔板每米在一根柱中同时分离成份可达1 0 0 种高灵敏度一紫外 检测器灵敏度可达o 0 l n g 同时消耗样品少 h p l c 与经典液相色谱相比有以下优点：速度快，通常分析一个样 品在1 5 3 0 - i ，有些样品甚至在5 - i n 内即可完成分辨率高，可 选择固定相和流动相以达到最佳分离效果灵敏度高一紫外检铡器可达 山东大学硕士学位论文 o 0 1 n g ，荧光和电化学检测器可达o 1 p g 。柱子可反复使用一用一根色 谱柱可分离不同的化合物样品量少，容易回收一样品经过色谱柱后不 被破坏，可以收集单一组分或做制备 色谱条件的选择：色谱理论不仅适用于气相色谱，对高效液相色 谱也完全适用，但由于流动相的不同，被测组分在气液两相和液液两 相间的扩散和分配行为也存在较大差异在高效液相色谱中，液体流 动相的分子量要比气相色谱中的气体流动相的分子量大得多，由于被 测缀分在流动相中的扩散系数d m 与流动穗的分子量成反比，因此速率 方程中的分子扩散项b u 较小，可以忽略不计，故只有两项，即 h = a + c u 液相色谱与气相色谱两者的h u 曲线的形状不同， 如图8 6 所示在高效液相色谱分离中，影响分 离效率的主要因素有流动相的流速、性质和极性 但柱温要保持恒定，通常在室温下 ( 1 ) 流速；在液相色谱中，被测组分分子在流 动相中的扩散系数比气相中小4 5 个数量级，当 流速大于o 5 c m s 一1 时，h u 曲线是一段斜率不大的直线降低流 速，柱效提高不是很大但在实际操作中，流速仍是一个调整分离度 和出蜂时间的重要的可选择参数 ( 2 ) 固定相及分离柱：气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相 色谱，其选用原则与气相色谱一样但在高效液相色谱中，分离柱的 制备有较大难度，需要一定设备和相应技术，一般很少自行制备 ( 3 ) 流动相及流动相的极性：由于高效液相色谱的分离柱制各困 难、保管不便，可供选择的商品柱种类也不多，可显著改变组分分离 状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要液相色谱流动相的作 用除与气相色谱中载气的作用相同之外，还具有调节组分与固定相之 间作用力大小的能力，也即溶剂效应液相色谱的流动相又称为：淋 洗液，洗脱剂在液液色谱中，为了避免固定液的流失，一般来说， 对于亲水性固定液常采用疏水性流动穗，郎流动相的极性小于固定相 山东大学硕士学位论文 的极性，这种情况称为正相液液色谱法，极性柱也称为正相柱反之， 若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱 也称为反相柱，这是由于后者的出峰顺序与前者相反对于目前常用 的化学键合固定相来说，固定液的流失大大减小，流动稆的选择范虽 则要大得多流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分 为极性、弱极性、非极性：按使用方式分，有固定组成淋洗和梯度淋 洗常用溶剂的极性( 由小到大) 顺序如下： 庚烷、己烷、环已烷、四氯化碳、甲苯、苯、氯仿、乙醚、乙酸 乙酯、正丁醇、丁酮、四氢呋喃、二氧六环、丙酮、丙醇、乙醇、甲 酵、乙腈、甲酸胺、水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性 或增加选择性，以改进分离或调整出峰时问。如可在正己烷、苯、甲 苯中有目的地加入醚、醇、酯、酮等；在水中加入甲醇、乙腈等能与 水混溶的有机溶剂，可以先混合均匀后使用，也可以采用梯度淋洗方 式 选择流动相时应注意下列几个闯题； ( 1 ) 尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色 谱柱和使检测器噪声增加 ( 2 ) 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使 固定液溶解流失：酸性溶剂破坏氧化铝吸附剂固定相等。 ( 3 ) 试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉 积。 ( 4 ) 流动相同时还应满足检测器的要求当使用紫外检测器时，流 动相不应有紫外吸收”1 2 3 分析方法验证介绍 方法验证的目的是判断采用的分析方法是否科学、合理，是否能 有效控制药品的内在质量从本质上讲，方法验证就是根据检测项目 的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所 采用的分析方法能否符合检测项目的要求 1 7 由东大学硕士学位论文 方法验证在分析方法建立过程中具有重要的作用，并成为质量研 究和质量控制的组成部分只有经过验证的分析方法才能用于控制药 品质量，因此方法验证是制订质量标准的基础。方法验证是药物研究 过程中豹重要内容。 方法的验证是由药品的开发者或使用者来检验其方法是否达到预 期的可靠性、准确度和精密度的过程 验证内容包括方法的专属性，线性范围、准确度、精密度和系统 适用性等 山东大学硕士学位论文 3 实验内容 3 1 实验材科 d 一泛酸钙山东新发药业有限公司 3 2 标准品 泛酸钙标准品s i g m a a 1 d r i c h 3 3 化学试剂 甲醇色谱纯天津协和吴鹏色谱科技有限公司 磷酸分析纯天津市西化特种试剂厂 磷酸二氢钾分析纯天津科密欧化学有限公司，中国天津 乙腈色谱纯天津协和吴鹏色谱科技有限公司 水为去离子水，应符合g b t 6 6 8 2 二级水的规定 3 4 主要仪器及设备 l c l o a t v p 高压泵岛津 7 2 5 i 进样阀 s p d 1 0 a v p 紫外检测器岛津 色谱柱( 1 5 0m m 4 6 蛐i d ，5m )安捷伦 a u y 2 2 0 型电子天平岛津 p h 一2 5 型酸度计上海精密科学役器 s b h 一1 1 l 循环水式多用真空泵郑州长城仪器厂 溶剂过滤器龙口市先科仪器公司 3 5 实验方法 3 5 1 流动相的配翩 流动相配制： 流动相：于洁净的1 0 0 0 毫升容量瓶中称量2 7 3 克分析纯的磷酸 二氢钾，用去离子水定容到1 0 0 0 毫升然后用量筒量取1 0 0 毫升色谱 伸 山东大学硕士学位论文 纯乙腈和9 0 0 毫升上述的磷酸二氢钾溶液( 0 0 2 m o l l ) ，用分析纯的 盐酸调p h = 3 ，通过o 4 5 硼滤膜过滤脱气备用。 3 5 2 样品的制备 准确称取d 一泛酸钙样品0 d 5 0 0 9 左右，置于5 0 m l 容量瓶中，用流 动相溶解，然后用流动相定容至刻度，摇匀 3 5 3 标准溶液的配制 准确称取已知纯度的d 一泛酸( 或d 一泛酸钙) 标准纯品o 0 5 0 0 9 ， 置于5 0 m 1 容量瓶中，用流动相溶解，然后用流动相定容至刻度，摇匀。 标准溶液不使用时放冰箱中保存 3 5 4 色谱条件的确定 通过自动紫外可见分光光度计扫描d 一泛酸钙的最大吸收波长，确 定高效液相色谱检测的波长 采用乙腈和磷酸二氢钾水溶液为流动相，通过改变柱温流速和流 动裰浓度配比确定最佳分析条件，使杂质获得最好的分离。 3 5 5 定性分析 在已确定的色谱条件下将单个标准品分别进样，比较每个标准品 和混合标准品溶液的保留时间，若保留时间相同或很接近，则可证明 是同一种物质 3 5 6 样品的测定 在确定的色谱条件下将通过0 4 5 u m 膜过滤的d 一泛酸钙样品溶液和 标准品溶液分别进样，必要时需调整样品的浓度使其在校正曲线的线 性范围内通过比较样品和标准品的保留时间定性，d 一泛酸钙的含量 通过获得的标准品和样品色谱峰面积，以外标法计算得到；泛酸钙样 品的的色谱峰的相对保留时间应于标准品图谱一致 3 5 7 回收辜、精密度和标准曲线的测定 回收率：将样品溶液与标准溶液按l ：l 比例混合，用h p l c 分析。 山东大学硕士学位论文 连续测定三次，同时分析样品溶液，测定三次用下述公式计算回收 率： ! ! g = 堡。l 回收率= c 3 ( 9 5 一1 0 5 ) 式中： c 卜标准品与样品以l ：l 混合后，经h p l c 分析检测混合样的峰 面积，由线性方程计算的浓度，m g m 1 ； c 2 一样品溶液测出的蜂面积，由线性方程计算出的浓度，m g m l ； c 3 一标准溶液的浓度，皿g m 1 精密度系指在规定的测试条件下，同一均质供试品，经多次取样 进行一系列检测所得结果之间的接近程度( 离散程度) 精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示用标准偏差 或相对标准偏差表示时。取样测定次数应至少6 次。 精密度可以从三个层次考察：重复性、中间精密度、重现性。 重复性； 重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间闯隔内，由同一分 析人员测定所得结果的精密度重复性测定可在规定范围内，至少用9 次测定结果进行评价，如制备3 个不同浓度的试样，各测定3 次，或 1 0 0 的浓度水平，用至少测定6 次的结果进行评价 通过连续进六针样品溶液，记录六次的泛酸钙色谱峰面积，其相 对标准偏差不超过2 中间精密度 中间精密度系指在同一实验室，由于实验室内部条件改变，如时 间、分析人员、仪器设备、测定结果的精密度验证设计方案中的变 动因素一般为日期，分析人员、设备 由六名不同分析人员在不同时间分析同一批次的d 一泛酸钙样品， 用外标法求出d 一泛酸钙的含量，其含量的相对标准偏差应2 重现性： 指不同实验室之问不同分析人员测定结果的精密度当分析方法 山东大学硕士学位论文 将被法定标准采用时，应进行重现性试验 标准曲线的测定：取样品，配制5 个浓度的溶液，每个样品溶液 进样两次记录峰面积，求出平均值，由峰面积和浓度拟和直线，求 出线性 3 5 8 系统适用性和专一性实验 对一些仪器分析方法，在进行方法验证时，有必要将分析设备、 电子仪器与实验操作、测试样品等一起当作完整的系统进行评估系 统适用性便是对整个系统迸行评估的指标系统适用性试验参数的设 置需根据被验证方法类型而定色谱方法对分析设备、电子仪器的依 赖程度较高，因此所有色谱方法均应进行该指标验证，并将系统适用 性作为分析方法的组成部分 系统适用性实验：调整好仪器，待基线稳定后，取配制好的工作 标准溶液连续进样6 次，由n z o o o 色谱数据工作站进行面积外标法积 分在表一中记录工作站所给出主蜂的数据；峰面积、分离度、拖尾 因子等各项系统参数 专属性系指在其他成分( 如杂质、降解物、辅料等) 可能存在下， 采用的分析方法能够正确鉴定、检出被分析物质的特性 专属性实验：取样品溶液进样，记录各峰的保留时间、峰面积、 分离度各组分分离度应大于1 5 3 5 9 吸收波长选择 通过紫外分光光度计检测溶液和溶剂的吸收波长，选择溶液中样 品的最大吸收，同时在此波长溶剂没有最大吸收 3 5 1 0 色谱柱选择 在液一液分配色谱中为避免色谱柱中固定相的流失和提高分离效 果，现在已广泛采用化学键合固定相常见的烷基键合相有十八硅烷 c 1 8 ( 0 d s ) 和辛基硅烷c 8 两种由于c 8 填料的碳链长度比o d s 的要短， 相对极性要强，对极性相近的物质分离效果不是很理想。而d 一泛酸钙 中杂质极性耜近，分离对c 1 8 柱的柱效明显高于c 8 柱敖本试验采用 丝 山东大学硕士学位论文 c 1 8 柱虽然使用长的色谱柱能提高分离度，但同时会使分析时同延长， 本实验采用1 5 0 m m x 4 6 m 曩，0 5 l l _ 的色谱柱可达到分离度的要求 3 5 柱温选择 在h p l c 仪中色谱拄及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温 度，柱子的恒温精度要求在士o 1 0 5 之问，检测器的恒温要求则 更高 温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响 一般来说，温度升高，可提高溶质在流动相中的溶解度，从而降低其 分配系数k ，但对分离选择性影响不大；还可使流动相的粘度降低，从 而改善传质过程并降低柱压但温度太高易使流动相产生气泡 色谱柱的不同工作温度对保留时问、相对保留时间都有影响总 的说来，在液固吸附色谱法和化学键合相色谱法中，温度对分离的影 响并不显著，通常实验在室温下迸行操作 3 5 1 2 进样体积 在液相色谱中，一般来讲在一定迸样量范凰内，进样量改变，分 离度不会有太大改变，且保留时间也不会变，只是峰面积随进样量的 增加而增大但当进样量增大到某一值时，会使分离度受到影响，保 留时间会改变，甚至完全分不开而共同流出若迸样量太少，吸收少， 有时会检测不到实验考察了进样量分别为3 u l 、5 u l 、1 5 u l 、2 0 u l 的 情况，结果见图1 7 色谱图自上而下进样量分别为3 u l 、5 u l ，1 5 u l 、 2 0 u l 3 5 1 3 流速 根据速率理论：h = a u 3 + b 阳+ c u ，其中h 为理论塔板高度，u 为流 动租流速，常数a ，b ，c 因柱子的不同而不同在一定的流速范围内， 当流速减少时，柱效提高，分离度交大，但当流速过慢时，分析时间 延长，纵向扩散的影响变大，柱效降低。虽然提高流速可缩短分析时 间，但柱子压力正比于流速，为了保护泵头和柱子，流速不宜过高：并 且流动相流速过快物质来不及分离就被洗出，得不到好的分离效果因 篮 山东大学硕士学位论文 此流速的选择对分离度的影响也是很大的当流动相浓度梯度洗脱体 系确定后，可通过调节流速来进一步提高分离度，或在保证分离度达 到要求的情况下通过调节流速来缩短分析时间 3 5 1 检测罱选择 高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件( 高压输液泵、色谱 柱、检测器) 之一，是将样品的浓度( 从色谱柱中流出) 转换成电信号的 传感器。并由数据处理系统记录，根据样品在该检测器上的响应值来 计算组分的浓度，它主要用于监溺经色谱柱分离后的组分浓度的变化， 并由色谱工作站绘出色谱图来进行定性，定量分析 在评价检测器时要特别强调以下几点：由仪器的电器元件，温度 波动，电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的 无规则波动引起的噪声要低。基线不应漂移太大。要有足够灵敏 度( 信号与噪声的比值等于2 时，在单位时间内进入检测器的溶质的浓 度或质量) 。在一次分析中可同时对主要组分和痕量组分同时进行检 测检测器的池体积应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的 l 1 0 0 一个理想的液相色谱监测器应具备以下特征：灵敏度高：对所有的 溶质都有快速响应：响应对流动相流量和温度变化都不敏感：不引起柱 外谱带扩展：线性范围宽：适用的范围广 在几种常用的检测器中，折光检测器和蒸发光散射检测器是通用 型检测器，对所有的化合物均有响应，灵敏度相对较差，样品缺乏u v 响应，蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待 测物的质量有关，与待铡溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需 对响应值进行数学转换后进行计算，可用于峰面积，归一化测定未知 成分的含量 荧光检测器( f 1 1 l o r e s c e n c e d e t e c t o r ，f d ) 是选择性检测器，灵敏度 较高，但对湿度，溶剂性质，p h 等敏感电化学检测器选择性，灵敏 度较高对流速，温度，离子强度，p h 等敏感，维护较麻烦 二极管阵检测器( d i o d e a r r a y d e t e c t o r ，d a d ) 可以同时记录待测 m 山东大学硕士学位论文 物在规定波长范围内的吸收光谱，可用于待铡物的光谱鉴定和色谱峰 的纯度检查 质谱检测器( m s ) 选辱性，灵敏度较高，具有通用性，可获取化合 物分子量及结构信息，但相对较贵 紫外吸收检测器( u l t r a v i o l e t a b s o r p ti o n d e t e c t o r ，u v d ) 是高效 液相色谱仪中使用最广泛的一种检测器，是一种选择性检测器，其响 应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，它不仅与待测溶液 的浓度有关，还与化合物的结构有关它灵敏度高，噪音低，线性范 围宽，对流速和温度均不敏感，可于制备色谱。由于灵敏高，因此既 使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用u v 检测器进行微量分析 但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长如果溶剂中含有吸 光杂质，则会提高背景噪音，降低灵敏度( 实际是提高检测限) 此外， 梯度洗脱对，还会产生漂移。由于它可选择的波长范围很大 ( 1 9 0 6 0 0 姗) ，既提高了检测器的选择性，又可选用组分的最灵敏吸收 波长进行测定，从而提高了检测的灵敏度它采用氖灯作光源，波长 在1 9 0 6 0 0 n m 范围内可连续调节光源发出的光经聚光透镜聚焦，由 可旋转组合滤光片滤去杂散光再通过入口狭逢至平面反射镜l ，经反射 到达光栅，光栅将光衍射色散成不同波长的单色光，当某一波长的单 色光经平面另一反射镜2 反射至光分束器时，透过光分束器的光通过 样品流通池，最终到达检测样品的测量光电二极管：被光分束器反射的 光到达检测样品的测量光电二极管：被光分束器反射的光到达检测基 线波动的参比光电二极管：当获得测量和参比光电二极管的信号差，即 为样品的检测信息这种可变波长紫外吸收检测器的设计，使它在某 一时刻只能采集某一特定的单色波长的吸收信号光栅的偏转可由预 先编制的采集信号程序加以控制，以便于采集某一特定波长的吸收信 号，并可便色谱分离过程洗脱出的每个组分峰都获得最灵敏的检测 它还有停流扫描功能，可绘出组分的光吸收谱图，以进行吸收波长的 选择 u v 检测器的工作原理是l a m b e r t b e e r 定律，即当一束单色光透过 山东大学硕士学位论文 流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度 与吸光组分的浓度c 和流 动池的光径长度l 成正比 u v 检测器分为固定波长检测器、可变波长检测器和光电二极管阵 列检测器( p h o t o d i o d ea r