（微生物学专业论文）一株恶臭假单胞菌代谢芳香化合物产物及机理研究.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 多氯联苯( p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ，p c b s ) 、溴代联苯醚( p o l y b r o m i n a t c d d i p h c n y le t h e r s ，p b d e s ) 、芴( f l u o r e n e ，f n ) 和多氯代二苯并二恶英 ( p o l y c h l o r i n a t e dd i b e n z o - p d i o x i n s ，p c d d s ) 等是环境中的持久性有机污染物。 这些化合物一般都具有致癌、致畸、致突变的三致特性，释放到环境中会严重地 威胁人类的健康。研究微生物降解该类化合物，对修复被其污染的环境具有很重 要的理论意义和应用价值。 本工作以课题组前期筛选得到一株能以联苯为唯一碳源生长的恶臭假单胞 菌p s e u d o m o n a s p u t i d ab 6 2 为研究对象，研究了该菌株对于模式化合物d e 、f n 和d d 的降解特性，以及代谢途径。pp u t i d ab 6 2 是一株能以联苯为唯一碳源生 长的菌株，该菌株也能以联苯降解上游途径的最终产物苯甲酸为唯一碳源生长， 说明该菌株可以将联苯完全矿化，具有降解p c b s 的潜力。 研究发现b 6 2 不能够利用d e ，f n 和d d 生长，进一步考察了利用联苯生 长的菌株降解d e 的能力，初步研究该菌株降解d e 的中间产物，发现该菌株能 通过侧面双加氧途径降解d e ，生成对二苯酚和苯酚等化合物；研究了菌株b 6 2 对多环芳烃的代表性化合物f n 的降解特点，发现在降解过程中，有两个产物积 累分别为9 芴酮和9 芴醇，说明该菌株可以攻击f n 中间的五碳环；还检测到微 量的产物1 茚酮，说明只p u t i d ab 6 2 也可以通过侧面双加氧途径降解f n ；研究 了菌株代谢二恶英类化合物d d 的特性，检测到的三个中间产物，邻苯二酚和羟 基取代的d d ，以及d d 代谢的侧面双加氧开环产物，发现该菌株可以通过侧面 双加氧途径降解d d 。综上所述，该菌株降解以上各类化合物主要通过侧面双加 氧途径，生成苯酚和邻苯二酚等物质，而菌株b 6 2 可以以苯酚和邻苯二酚为底 物生长，说明菌株b 6 2 可以通过共代谢将这些化合物完全或者部分矿化，具有 较好的降解能力。 研究了pp u t i d ab 6 - 2 联苯降解基因簇的序列组成。通过构建p o c 文库和筛 选转化子的手段，测序获得了该菌株的联苯降解基因簇，该联苯降解基因簇包含 一株恶臭假单胞菌代谢芳香化合物产物及机理研究 联苯上游降解基因簇和下游降解基因簇。联苯的上游降解途径包含 b p h a b c k h j i d 八个基因，这八个基因的排列顺序与联苯降解菌b u r k h o l d e r i as p l b 4 0 0 和p s e u d o m o n a sp s e u d o a l c a l i g e n e sk f 7 0 7 相似。其中b p h a b c d 基因将联 苯转化为2 - h y d r o x y p e n t a - 2 ，4 - d i e n o a t e 和苯甲酸，而b p h k h j i 基因簇是负责降解 2 - h y d r o x y p e n t a - 2 ，4 一d i e n o a t e 的。下游降解基因簇为水杨酸降解基因簇( n a h ) ，该 基因簇也存在于k f 7 0 7 之中与上游降解基因簇相距6k b ，菌株b 6 2 中该基因簇 与菌株k f 7 0 7 具有1 0 0 的相似性。而b p h a b c k h j i d 基因簇也仅联苯双加氧酶 基因( b p h a ) 的氨基酸序列与k f 7 0 7 稍有不同，可能是这二者降解能力差别的 主要原因。 通过将降解p c b s 广底物谱菌株b u r k h o l d e r i as p l b 4 0 0 的联苯双加氧酶基 因印m 导入联苯降解菌株pp u t i d ab 6 2 中，构建更广底物谱的p c b s 降解菌株。 通过原位p c r 检测证实菌株l b 4 0 0 的联苯双加氧酶基因幼m 已经导入了菌株 b 6 2 之中，但是检测不到该酶的活性，在降解p c b s 同系物2 ，2 ，3 ，37 四氯联苯时， 获得l b 4 0 0 印h a 基因的b 6 2 菌株与野生型的b 6 2 菌株没有差异，对该化合物 没有降解能力。 关键词：多氯联苯、恶臭假单胞菌、生物降解、基因组文库、基因簇、联 苯双加氧酶 2 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ( p c b s ) ，p o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e r s ( p b d e s ) ， p o l y c y c l i e a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s0 a n s ) a n dp o l y c h l o r i n a t e d d i b e n z o - p - d i o x i n ( p c d d s ) a r ee n v i r o n m e n t a lp e r s i s t e n to r g a m cp o l l u t a n t so fe n v i r o n m e n t s t h e s e c o m p o u n d sa r eu s u a l l yc a r c i n o g e m c ，t e r a t o g e n i ca n dm u m g e n i c t h er e l e a s eo f t h e s ec o m p o u n d si n t ot h ee n v i r o n m e n t sw i l lb es e r i o u st h r e a t st oh u m a nh e a l t h ，s o s t u d i e so nm i c r o b i a ld e g r a d a t i o no ft h e s ec o m p o u n d sh a v ev e r yi m p o r t a n tt h e o r e t i c a l m e a n i n g sa n da p p l i c a t i o nv a l u e sf o rr e m e d i a t i o no ft h ec o n t a m i n a t e de n v i r o n m e n t s t h i sw o r kf o c u s e do n ab i p h e n y l d e g r a d i n gs t r a i nb 6 2w h i c hw a si s o l a t e di no u r l a b o r a t o r yp r e v i o u s l ya n dw a sa s s i g n e dt op s e u d o m o n a sp u t i d a s t r a i nb 6 - 2w a s a b l et og r o ww i t hb i p h e n y lo rb e n z o a t ea c i da st h es o l ec a r b o ns o u r c e ，i n d i c a t i n gt h a t s t r a i nb 6 - 2c o u l dc o m p l e t e l ym i n e r a l i z e d b i p h e n y l a l t h o u g hc o u l dn o tg r o wo nd e ，f l u o r e n e ( f a n dd d ，b i p h e n y l - g r o w nc e l l so fp p u t i d ab 6 2w e r es h o w nt ob ec a p a b l eo fe f f i c i e n t l yd e g r a d i n gt h e s et h r e em o d e l s c o m p o u n d so fp b d e s ，p a h sa n dp c d d s i d e n t i f i c a t i o no fm e t a b o l i t e ss u g g e s t e d t h a ts t r a i nb 6 2d e g r a d e dd et op h e n o lt h r o u g ht h el a t e r a ld i o x y g e n a t i o np a t h w a y , a n dt h ep r o d u c t i o no fh y d r o q u i n o n ew a sa l s od e t e c t e d d u r i n gt h ed e g r a d a t i o no f f n ，t w om e t a b o l i t e s ，9 一f l u o r e n o la n d9 - f l u o r e n o n e ，w e r ef o u n dt oa c c u m u l a t e d e t e c t i o no fa n o t h e rm e t a b o l i t e1 - i n d a n o n ei n d i c a t e dt h a ts t r a i nb 6 2c o u l da l s o d e g r a d ef nt h r o u g ht h e l a t e r a ld i o x y g e n a t i o np a t h w a y d dw a sd e g r a d e dt o 4 一( 3 - h y d r o x y b e n z o l 1 ，4 d i o x i n - 2 - y 1 ) - 2 一o x o b u t - 3 一e n o i c a c i d t h r o u g h t h el a t e r a l d i o x y g e n a t i o np a t h w a yb ys t r a i nb 6 - 2 ，a n dt h ef u r t h e rd e g r a d a t i o np r o d u c tc a t e c h o l w a sa l s oi d e n t i f i e d t h ea b o v er e s u l t si n d i c a t et h a ts t r a i n 户p u t i d ab 6 - 2d e g r a d e s d e ，f na n dd dm a i n l yt h r o u g hl a t e r a ld i o x y g e n a t i o np a t h w a y t h em e t a b o l i t e s ， p h e n o la n dc a t e c h o l ，w e r ed e t e c t e d , a n dw e r es h o w nt ob ec a p a b l eo fs u p p o r tb 6 - 2 c e l lg r o w t h t h e r e f o r e ，a tl e a s tp a r t i l eo fd e ，f na n dd dc o u l db em i n e r i l i z e d 3 一株恶臭假单胞菌代谢芳香化合物产物及机理研究 t h r o u g h tac o m e t a b o l i cw a yb ys t r a i nb 6 2 a g e n o m el i b r a r yo f 户p u t i d ab 6 - 2w a sc o n s t r u c t e df o rc l o n i n gf u n c t i o ng e n e c l u s t e r t w oc l u s t e r sc o r r e s p o n d i n gt ot h eb i p h e n y l d e g r a d i n ga n ds a l i c y l i c a c i d d e g r a d i n g w e r ec l o n e d i ns t r a i nb 6 - 2 ，t h ea r r a n g e m e n to ft h et h e b i p h e n y l d e g r a d i n g ”g e n ec l u s t e rw a st h es a m ea st h o s ei ns t r a i nb u r k h o l d e r i as p l b 4 0 0a n dp s e u d o m o n a sp s e u d o a l c a l i g e n e sk f 7 0 7 t h e b i p h e n y l - d e g r a d i n g g e n ec l u s t e rc o n t a i n se i g h tg e n e sn a m e db p h a b c k h j i d b p h a b c de n c o d i n g e n z y m e sc a t a l y z i n gb i p h e n y lt o b e n z o i ca c i da n d2 - h y d r o x y p e n t a 一2 ，4 - d i e n o a t e b p h k h j li sc o r r e s p o n d i n gf o r t h ed e g r a d a t i o no f2 - h y d r o x y p e n t a 一2 ，4 一d i e n o a t e s a l i c y l i ca c i dd e g r a d i n gg e n ec l u s t e ro fs t r a i nb 6 - 2w a sa s s i g n e dn a h i ns t r a i n k f 7 0 7 ，t h en a hw a s6 - k i l ob a s ed o w n s t r e a mf r o mb p h d t h ea m i n oa c i ds e q u e n c e o fb p h a b c k h j i di ns t r a i nb 6 - 2i sh i g h l ys i m i l a rw i t ht h ec o r r e s p o n d i n ge n z y m e si n s t r a i nk f 7 0 7 h o w e v e r , t h e r ea r ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h es e q u e n c e so fs e v e r a l a m i n oa c i dg r o u p so fb i p h e n y ld i o x y g e n a s eg e n e s ( 印m ) i nt h e s et w os t r a i n s ，w h i c h s h o u l d b et h er e a s o nf o rt h e i rd i f f e r e n c e si nc a t a b o l i ca c t i v i t i e s b e c a u s eo ft h ee x t e n s i v ed e g r a d a t i o na b l i t yo fb u r k h o l d e r i as p l b 4 0 0t o w a r d s p c b s ，t h ec r u c i a lb i p h e n y ld i o x y g e n a s eg e n e ( b p h a ) f o rp c b sd e g r a d a t i o no ft h i s s t r a i nw a si n t r o d u c e di n t o 户p u t i d ab 6 2 h o w e v e r , t h ee n z y m a t i ca c t i v i t yw a sn o t d e t e c t e d ，t h e r ew a sn od i f f e r e n c eb e t w e e nt h ea b i l i t i e st od e g r a d e2 ，2 7 ，3 ，3 - t e t r a c h l o r o b i p h e n y lb ypp u t i d ab 6 - 2c o n t a i n i n g 助h ao fs t r a i nl b 4 0 0a n dt h ew i l ds t r a i no f r 6 2 k e y w o r d s ：p c b s ；p s e u d o m o n a sp u t i d a ；b i o d e g r a d a t i o n ；g e n o m el i b r a r y ；g e n e c l u s t e r ；b i p h e n y ld i o x y g e n a s e 4 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：皇堕圭 日期2 呈! 丛 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：曼坠导师签名：肚日 期：必 山东大学硕士学位论文 第一章前言 1 环境中多氯联苯、溴代联苯醚、芴和二恶英的分布及特点 多氯联苯( p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ，p c b s ) 、溴代联苯醚( p o l y b r o m i n a t e d d i p h e n y le t h e r s ，p b d e s ) 、芴( f l u o r e n e ，f n ) 和多氯代二苯并二恶英 ( p o l y c h l o r i n a t e dd i b c n z o - p d i o x i n s ，p c d d s ) 等是环境中的持久性有机污染物， 这些化合物通常都具有致癌、致畸、致突变的三致特性。以下是本文研究中用到 的模式化合物结构示意图。 9 f l u o m n e d i p h e n y le t h e r 4 ：65 d 4 ： 图1 1 本研究所用到模式化合物的结构示意图 f i g1 1t h ec o m p o u n d su s e di nt h i sg r a d u a t i o nt h e s i s 1 1 环境中多氯联苯的特征及分布 多氯联苯( p o l y c h l o f i n a t e db i p h e n y l ，p c b s ) 是联苯上的氢原子被氯原子不 同程度地取代形成的一类化合物，根据氯原子取代的数目和位置的不同，这类化 一株恶臭假单胞菌代谢芳香化合物产物及机理研究 合物共有2 0 9 种同系物。典型的商业化的p c b s 混合物通常含有2 0 6 0 种同系物， 例如，a r o c l o r 、k a n e c l o r 、c l o p h e n 、d e l o r 等主要是含3 6 个氯原子的p c b s 。由 于这类化合物具有高效的阻燃性、化学稳定性、高沸点和绝缘性等特点，被广泛 地应用于工业生产和商业目的，比如，电器行业、热传导、压力平衡、油漆的增 塑剂、塑料和橡胶的生产，用于染料、涂料和无碳复印纸的生产等等。据报道自 1 9 2 7 年到上世纪8 0 年代初期全世界大约生产了1 5 0 万吨p c b s ( f a r o o ne ta 1 2 0 0 3 ) ，并且其中有很大一部分被释放到了环境中。自上世纪3 0 年代p c b s 对健 康的影响被报道后，又发现了其对一些动物的致癌性特征( m a y e s e ta 1 1 9 9 8 ) ， 接着又发现p c b s 可以对免疫、繁殖、神经和激素系统产生严重影响( a t s d r2 0 0 0 ； f a r o o ne ta 1 2 0 0 1 ) ，并且发现p c b s 对人体也有潜在的致癌性影响( a t s d r 2 0 0 0 ) 。 p c b s 具有环境持久性，生物蓄积性，半挥发性及高毒性，属于难降解有机 物。水体、土壤和底泥中存在的p c b s 可在环境中存在长达数十年之久，比如， m a n i r a k i z a 等( 2 0 0 2 ) 间隔很长时间测定同一种类鱼体内的p c b s 含量，发现p c b s 的含量并没有减少；由于p c b s 具有低水溶性和高脂溶性的特点，所以非常容易 聚集在脂肪组织中，并通过食物链浓缩，对人体造成危害，比如，k i d d a 等人( 1 9 9 8 ) 的研究表明高脂溶性的p c b s 在人体内的积聚程度最大；p c b s 还具有半挥发性， 使得p c b s 能够从土壤和水体等环境进入大气，大气颗粒通过吸附作用，能携带 p c b s 远距离迁移，从而造成全球性的污染( 卢冰等，2 0 0 5 ) ；另外，p c b s 还具 有高毒性，对人的生殖、遗传、免疫、神经和内分泌系统具有强烈的危害作用。 比如，1 9 6 8 年日本的米糠油事件导致p c b s 中毒患者超过1 0 0 0 人，1 6 人死亡， 实际受害者达到1 5 0 0 0 人之多。 最近，杜瑞雪等( 2 0 0 8 ) 对我国水体的p c b s 污染情况的研究进行了综述， 发现东北地区的第二松花江出现了中度p c b s 污染；对水底沉积物的p c b s 含量 研究总结后发现辽河、海河、黄河、太湖和官厅水库的沉积物中都检测出了p c b s 的存在( 1 0n g g 以下) ，而第二松花江( 2 5 4 7 0 3n g g ) 、淮河( 6 3 4 - 1 6n g g ) 、 长江( 5 2 0n g g ) 、珠江( 1 2 5 - 4 8 5 5n g g ) 和南四湖( 7 8 4 4 2 8n g g ) 都表现出 了不同程度的污染；并总结了一些海域水生生物体内的p c b s 污染情况，发现珠 江口的翡翠贻贝和杭州湾北三区的青蛤中的p c b s 的浓度超标。 6 山东大学硕士学位论文 由于p c b s 化合物影响环境和人类健康，世界上绝大多数国家已经停止生 产。2 0 0 1 年5 月2 1 日召开的斯德哥尔摩会议通过了关于持久性有机污染物的 斯德哥尔摩公约，将p c b s 列入首批持久性有机污染物之一。由于p c b s 相当稳 定，未来很多年内p c b s 仍会长期存在于环境中。目前，以微生物降解修复p c b s 污染环境的方法最有前景，已有很多关于联苯降解菌及其它降解菌株通过共代谢 作用对p c b s 污染环境修复研究的报道。 1 2 环境中溴代联苯醚的特征及分布 目前，多溴联苯醚( p o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e r s ，p b d e s ) 作为新的持久 性有毒化学污染物已经引起各国科学家的注意。p b d e s 是一类以溴原子取代联 苯醚上的氢原子而形成的一系列化合物，按所含的溴原子数及取代位置的不同共 有2 0 9 种同类物。在化学结构上p b d e s 与p c b s 和d d t ( d i c l o r od i f e n i l t r i c l o r o e t a n o ) 相似。它们的化学性质、环境中的持久性和分布情况也是相似的。 在过去的3 0 年中，p b d e s 以其阻燃效率高、热稳定性好、添加量少、对材料性 能影响小等优良的性状被广泛应用于电子、电器、化工、交通、建材、纺织、石 油、采矿等领域中( w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ，19 9 4 ) 。p b d e s 通过生产、使用、 处置等过程进入环境，并且低溴联苯醚可以随着大气长距离迁移。由于p b d e s 的亲脂性极强，使其可以通过食物链在生物体内富集放大。目前，在环境中的废 水、沉积物和野生动物( 包括海洋哺乳动物、鱼、鸟和蛋) 均有p b d e s 检出( h o o p c r e ta 1 2 0 0 0 ；h i t e s2 0 0 4 ) 。甚至人体的乳汁，血液，脂肪组织中都检测到p b d e s ( g u v c n i u se ta 1 2 0 0 3 ；h i t e s2 0 0 4 ；m a z d a ie ta 1 2 0 0 3 ；s h ec ta 1 2 0 0 2 ) ，并且浓度增 长迅速，有报道称( v o se ta 1 2 0 0 3 ；s c h e c t e rc ta 1 2 0 0 3 ) ，1 9 7 2 1 9 9 7 年期间，瑞典 妇女母乳中p b d e s 每隔5 年浓度加倍；1 9 9 2 2 0 0 2 年温哥华妇女母乳中p b d e s 的 浓度增加了5 倍。研究证实，这类有毒的溴化物会干扰甲状腺激素，妨碍人类和 动物脑部与中枢神经系统的正常发育( w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n1 9 9 4 ) 。实验室 研究表明，当小鼠及鱼类等动物暴露于一定含量的p b d e s 时，会表现出内分泌 紊乱，生殖能力及神经受损，以及致癌的现象( b r a n c h ie ta 1 2 0 0 2 ；m o r s ee ta 1 】9 9 3 ) 。 7 一株恶臭假单胞菌代谢芳香化合物产物及机理研究 目前，p b d e s 的污染遍布全球，甚至扩张到深海。海洋中的哺乳动物海豚 和鲸的脂肪和肝脏中都检测到p b d e s 的存在，并且浓度已达8 0 0 0p p b 之高( 魏 爱雪等2 0 0 5 ) 。我国的p b d e s 污染情况也较为严重，u e n o 等( 2 0 0 4 ) 报道了我 国东海及南海的污染状况，结果表明中国海域取的三个点是除台湾海之外检出最 高的海域。此外，杨永亮等( 2 0 0 3 ) 测定青岛近岸沉积物和贝类中p b d e s 的含 量，总量在1 1 7 5 5 1 0p g g 干重范围内。c a i 等( 2 0 0 4 ) 报道了电子垃圾处理中心 广东贵屿的p b d e s 污染状况，土壤和底泥中p b d e s 含量在o 2 6 8 2 4n g g 范围内， 比其它报道的污染区高1 0 6 0 倍。p b d e s 在环境中的污染程度及变化趋势越来越 引起人们的关注，控制p b d e s 的污染已经成为目前迫切需要开展的工作。 现在已经有少数国家停止使用p b d e s 作为阻燃剂，但是，由于其持久性存 在，修复环境中的p b d e s 污染仍然是非常重要的。研究表明十溴联苯醚在大气 中光分解脱溴是一个比较可能的转化方式。d e c a b d e 溶解于有机溶剂中在紫外 或太阳光的照射下能快速地分解为毒性更强的低溴代联苯醚( 如：五溴联苯醚，) ( d a m e r u de ta 1 2 0 0 1 ；s 6 d e r s t r 6 me ta 1 2 0 0 4 ) 。虽然光解有一定的应用价值，但 是由于存在光解过程中分解不完全、有可能造成二次污染、p b d e s 在环境中低 浓度存在、土壤中二恶英类光解难以实施等因素，限制了光解的实际应用。 比之于物理化学的修复方法近年来微生物修复被污染的环境引起人们的重 视。因为用微生物修复异源生物质污染有很多优点，比如：污染物在原地被降解； 就地处理操作简便，对周闱环境干扰少；较少的修复经费；人类直接暴露在这些 污染物下的机会减少；不产生二次污染，遗留问题少等。所以研究微生物降解 p b d e s ，对修复被其污染的环境具有很重要的理论意义和应用价值，同时也将为 我国持久性有毒污染物的污染控制做出贡献。 1 3 环境中芴的特征及分布 芴( f l u o r e n e ，f n ) 是多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 化合物中的一种，经常存在于p a h s 污染环境中，具有典型的p a h s 结构。经常 被作为研究多的p a h s 降解的模式物。f n 是煤焦油和杂酚油的主要成分，是结 构最简单的p a h s 之一，具有强烈的致癌性、致畸性和致突变性，可以通过食物 山东大学硕士学位论文 链富集，对人体的健康具有相当大的毒性( z a s a d o w s k ie ta 1 2 0 0 2 ) 。美国环保局 已将其列为土壤水体中优先控制的1 6 种不带支链的p a h s 之一。 一般在碳氢化合物不完全燃烧，产生自由基，经过活性大、反应快的自由 基催化和环化等化学反应后会生成p a i - i s 类化合物包括f n ( b a d g g e re ta 1 1 9 6 0 ) ： 另外，在高压和低温( 2 0 0 0 c 以下) 条件下，经过衰变等不同碳化过程会产生p a h s 类物质，所以石油和煤中都含有p a h s 类物质。虽然自然现象会产生一定量的 p a h s ，但人类活动才是现在环境中p a h s 类物质的主要来源，如在焦化煤气、炼 钢炼铁等生产过程、纸张和塑料等有机原料的焚烧、柴油和汽油的使用以及家用 燃料的燃烧都会产生f n 等p a h s 类物质污染环境( g a r c i ae ta 1 2 0 0 3 ；g e r t l e re ta 1 2 0 0 2 ) 。 1 9 7 6 年国际上已确认具致癌性的p a h s 至少有三十种，一旦进入机体组织， 经过生化反应就会形成致癌或致突变的化合物，对机体产生毒害，甚至导致死亡。 p a h s 是环境中一类分布广泛的有毒有机污染物，并且会随着食物链富集，并在 环境中发生转化、迁移，造成全球性的污染。许珊珊等( 2 0 0 5 ) 估算了1 9 9 9 年 p a h s 的全国排放量，计算求得1 6 种亲体p a h s 的全国排放总量为9 7 9 9 吨；张 天彬等( 2 0 0 5 ) 对东莞市土壤中1 6 种优先控制的多环芳烃分析发现p a h s 的平 均含量为4 1 3 “g k g ，化石燃料的高温燃烧产物的大气沉降为东莞市土壤p a h s 的主要来源。 f n 作为研究p a h s 降解的主要模式化合物，研究微生物对f n 的降解对 p a h s 污染的控制具有重要意义。 1 4 环境中二苯并二恶英的特征及分布 多氯二苯并二恶英( p o l y c h l o r i n a t e dd i b e n z o - p d i o x i n s ，p c d d s ) 也是1 2 种 持久性有机污染物之一，有7 5 种同系物。这类物质一般都是工业生产的副产物。 比如：城市生活垃圾的焚烧；含氯杀虫剂和除草剂的生产；金属冶炼和机械制造 等生产中均会生成二恶英类物质( w i 仕i c he ta 1 1 9 9 8 ) ，造成环境污染。 二恶英类物质具有很强的毒性，具有致畸、致癌、致突变作用，会对人体 的皮肤造成伤害，并且对下一代的生殖、发育和智力也有影响 9 一株恶臭假单胞菌代谢芳香化合物产物及机理研究 ( h t t p ：w w w c h i n a - p o p s n e t ) 。 二苯并二恶英( d i b e n z o - p - d i o x i n ，d d ) 是多氯二苯并二恶英的母体化合物， 研究生物对二苯并二恶英的降解具有重要的意义。 2 多氯联苯、联苯醚及溴代联苯醚和芴的微生物代谢机理 2 1 多氯联苯的微生物降解 近来，人们对微生物降解p c b s 进行了广泛地研究，很多微生物的联苯代谢 基因簇的遗传组织形式被阐明，并根据它们的进化关系分析了其结构，发现了一 些可移动因子的信息。联苯代谢的关键酶，尤其是联苯2 ，3 双加氧酶被很多研究 者分析其特性，结构和序列的关系，以及其在p c b s 转化中的应用。但是，由于 p c b s 的降解是一个复杂的反应过程，所以单个菌株对p c b s 的降解是有限的。 因为联苯降解菌通常不能将p c b s 完全矿化，通过共代谢转化p c b s 会形成有毒 的中间物，所以对氯代苯甲酸的降解格外引起人们的关注。一系列细菌降解氯代 苯甲酸的途径，以及很多氯代芳香环化合物降解的主要产物氯代邻苯二酚的降解 途径被报道。 1 9 7 0 年l u n t 和e v a n s 分离了第一个可以以联苯为唯一碳源和能源生长的菌 株。此后多株联苯降解菌被发现，这些菌株有革兰氏阳性菌也有革兰氏阴性菌， 包括p s e u d o m o n a s ，b u r k h o l d e r i a ，a c h r o m o b a c t e r ，c o m a m o n a s ，r a l s t o n i a ， a c i n e t o b a c t e r ，r h o d o c o c c u s 和b a c i l l i u s 。 通常微生物代谢联苯，以联苯2 ，3 双加氧酶( b i p h e n y l2 ，3 - d i o x y g e n a s e s ) 为 起始酶类。联苯2 ，3 双加氧酶属于r i e s k e 非血红素铁氧化酶家族( g i b s o na n d p a r a l e s2 0 0 0 ) 。联苯2 ，3 双加氧酶通常含一个由大亚基( a 亚基) 和小亚基( p 亚 基) 组成的末端氧化酶，以及铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶组成的电 子传递链，该电子传递链负责将电子从n a d h 传递给末端氧化酶。联苯2 ，3 双 加氧酶将联苯氧化为2 ，3 一二氢2 ，3 二羟基联苯 ( 2 ，3 d i h y d r o 一2 ，3 一d i h y d r o x y b i p h e n y l )该化合物被脱氢酶作用转化生成2 ，3 一二羟 1 0 山东大学硕士学位论文 基联苯( 2 ，3 - d i h y d r o x y b i p h e n y l ) ：2 ，3 一二羟基联苯被开环裂解生成黄色的化合物 2 - h y d r o x y - 6 o x o 6 - p h e n y l h e x a - 2 ，4 - d i e n o a t e ( h o p d a ) ；然后该化合物被水解后生 成苯甲酸和2 - h y d r o x y p e n t a - 2 ，4 - d i e n o a t e 。这一系列反应被称之为联苯降解的上游 途径( t h e b i p h e n y l u p p e rp a t h w a y ) ( 图1 2 ) 。a h m e d 和f o c h t 于1 9 7 3 年首次报 道联苯降解菌株可以转化几种p c b s 同系物。自此以后，很多关于联苯降解微生 物的研究都把焦点集中在其对p c b s 的降解特性上，不同微生物之间的降解特性 差异很大。 联苯的“上游途径” 基因簇的结构 f u r u k a w a 等于19 8 6 年首次报道克隆了p s e u d o m o n a sd o a l c a l i g e n e sk f 7 0 7 的 联苯降解上游途径的基因簇，接着b u r k h o l d e r i as p l b 4 0 0 的联苯降解上游基因 簇也被克隆( m o n d e l l o1 9 8 9 ) 。在这两株菌中，联苯降解上游途径的四个基因， 联苯2 ，3 - 双加氧酶( b i p h e n y l2 , 3 一d i o x y g e n a s e ，b p k a i a 2 a 3 a 4 ) ，2 ，3 一二氢一2 ，3 一二羟 基联苯脱氢酶( d i h y d r o d i o ld e h y d r o g e n a s e ，b p h b ) ，2 , 3 一二羟基联苯1 ，2 - 双加氧酶 ( 2 ，3 一d i h y d r o x y b i p h e n y l1 , 2 - d i o x y g e n a s e ，b p h c ) ，h o p d a 水解酶( h o p d a h y d r o l a s e ，b p h d ) 位于同一个操纵子的调控之下；而谷胱甘肽转移酶和h o p d a 水解后生成的 2 - h y d r o x y p e n t a 一2 ，4 - d i e n o a t e的转化酶类 2 - h y d r o x y p e n t a - 2 ，4 一d i e n o a t e 水合酶( b p h h ) ，乙醛脱氢酶( 幼材) ， 4 - h y d r o x y 一2 - o x o v a l e r a t e 醛缩酶( b p h d 】都位于这一操纵子的b p h c 和b p h d 基 因之间( h o f e re ta 1 1 9 9 4 ) ( 图1 2 ) 。进一步的研究发现有很多联苯降解菌上游降 解途径的基因簇都是以这种方式排列的，比如r a l s t o n i ae u t r o p h ah 8 5 0 ( b e d a r de t a 1 1 9 8 7 ) 以及其它一些联苯降解微生物( b a r t e l se ta 1 1 9 9 9 ) 。p s e u d o m o n a s p u t i d a k f 7 1 5 含有一个简单的b p h a b c d 基因簇( 图1 2 ) ，通过与其它的联苯降解基因簇 相比较发现，k f 7 1 5 的上游降解基因簇中包括一个1 0 6 碱基的 2 - h y d r o x y 2 o x o v a l e r a t e 醛缩酶编码基因，这说明这个菌株曾经含有一个与l b 4 0 0 菌株相同的b p h 基因簇( n i s h ie ta 1 2 0 0 0 ) 。l b 4 0 0 、k f 7 0 7 和k f 7 1 5 三个菌株 中都含有一个叫作d 加的基因，该基因的产物属于g r i t 家族( w a t a n a b ee ta 1 2 0 0 3 ) 。当菌株k f 7 0 7 被联苯诱导后，o r y 0 基因产物可以正调控其自身以及 一株恶臭假单胞菌代谢芳香化合物产物及机理研究 b p h k h i j 的表达( w a t a n a b ee ta 1 2 0 0 0 ) 。当k f 7 0 7 的o , f 0 基因突变时，突变的 k f 7 0 7 不能以联苯为底物生长，并且由于b p h d 不能正常表达，会积累大量的 h p o d a ；而l b 4 0 0 的d 加基因突变后，该菌株还可以利用联苯为底物生长，但 是b p m l a 2 基因的r n a 表达量有所下降，说明d ，徊控制l b 4 0 0b p h a 基因的表 达( b e l t r a m e t t ie ta 1 2 0 0 1 ) 。而d 郴l 是否控制k f 7 0 7 的助砌的表达仍然需要进 一步研究。近来，报道属于l y s r 家族的调控蛋白b p h r 2 可以对k f 7 0 7 中的 b p h a i a 2 a 3 a 4 b c 基因簇的表达进行正调控( w a t a n a b ee ta 1 2 0 0 3 ) 。 在菌株a c h r o m o b a c t e rg e o r g i o p o l i t a n u m ( 起初被鉴定为p s e u d o m o n a ss p ) k k s l 0 2 ( k i m b a r ae ta 1 1 9 8 9 ；k i k u c h ie ta 1 1 9 9 4 ) 和菌株w a u t e r s i ao x a l a t i c aa 5 ( s p r i n g a e le ta 1 1 9