（微生物学专业论文）降解甲胺磷菌株的筛选和鉴定及生物学特性研究.pdf

摘要 有机磷农药对于防治农业病虫害具有经济、高效、方便的特点，一直是国内外广 泛使用的农药产品。然而，有机磷农药所带来的对环境和人类健康问题不容忽视，解 决有机磷农药的环境污染越来越受到人们的关注。本研究通过驯化富集培养从长期施 用甲胺磷农药的土壤中分离得到四株能以甲胺磷农药为唯一碳源生长的菌株 ( d z 1 1 、d z 1 2 、d z 2 1 、d z 2 2 ) 。并对这些菌株的种类、降解甲胺磷的效率、生 物学特性等进行研究。结果如下： 1 、根据菌落培养特征、生理生化鉴定和1 6 s r d n a 序列分析比较，结果表明它们 都是革兰氏阴性菌，现鉴定d z 1 1 为铜绿假单胞菌，d z 1 2 为粪产碱菌，d z 2 1 、d z 2 2 为致黄色假单胞菌。 2 、用分光光度法测定了上述菌株对甲胺磷、乐果和久效磷等有机磷农药的降解 能力。结果表明在1 5 0 0 m g l 的甲胺磷无机盐培养液中培养7 2 h ，四株菌对甲胺磷的 降解率分别为：8 1 4 7 ( d z 1 1 ) ，6 8 7 2 ( d z 1 2 ) ，7 5 3 3 ( d z 2 1 ) 和7 7 8 6 ( d z 一2 2 ) 。 同时，四株菌均可降解有机磷农药乐果和久效磷。 3 、用固体培养法和液体培养法研究了上述菌株对甲胺磷农药的耐受性。结果表 明这四株菌对甲胺磷农药具有较高的耐受能力，其中以d z 1 1 ，d z 1 2 的耐受力最强， 达到4 0 0 0 m l 。总的来说，菌株在固体培养基上的耐受能力相比在液体培养基中的 耐受能力高。 4 、用传代转接法研究了上述菌株降解甲胺磷农药的稳定性。结果表明四株菌降 解甲胺磷农药的稳定性较好。 5 、在充分供氧条件下，研究了四株菌的生物学性质。结果表明，四株菌的最佳 生长甲胺磷浓度为1 5 0 0 m g l ，最适p h 7 o ，最适生长温度2 5 3 0 ，最佳接种量在 4 6 之间。四株菌对常用抗生素表现不同的敏感性，金属离子对它们对甲胺磷农 药的降解有不同程度的促进或抑制作用。 6 、小区试验表明，四株菌的发酵液( 菌剂) 在土壤中有明显的甲胺磷农药降解 效果。 关键词：有机磷农药；微生物降解；分离；鉴定；生物学性质 s c r e e n i n g ，i d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f t h es t r a i n sw i t h h i 曲a b i l 时t od e g r a d a t i o no fm e t h a m i d o p h o s a b s t r a c t w i mm e i rf e a t u r e so fe c o n o i i l i c ，e 伍c i e n t 鲫dc o n v e n i e n ti nt h ec o n 仃o lo fa 鲥c u l n 删 p e s t s ，o 唱a n o p h o s p h o 印u sp e s t i c i d e sa r ea l w a y sm o s te x t e n s i v e l yu s e da r o u n dt h e 、o r i d b u ta tm es 锄et i m e ，w es h o u l dn o tn e g l e c tt h a ti ti sb r i r 培i n ga b o u tt l l ee n v i r o n m e n ta r l d h u n a i lh e a l mp r o b l e m s ，s om o r ea i l dm o r ea t t e n t i o ni sb e i n gp a i dt 0s 0 1 v ei t se n v i r o m e n t p o l l u t i o n t h r o u 曲d o m e s t i c a t i o n 觚de 耐c h m e n tc u l t i v a t i o n ， f o u rs t r a i l l sw e r ei s o l a t e d f o n ns o i lp o l l u t e db ym e t h a m i d o p h o sp e s t i c i d e sf o ra i ll o n gt i m e t h e ya l lc o u l du t i l i z e o 唱a l l o p h o s p h o 印u sp e s t i c i d e ss u c h 弱m e t h a m i d o p h o sa ss o l ec a r b o nr e s o u r c e ，a j l dw e n a m e dt l l e md z - 1 1 ，d z 一1 2 ，d z - 2 1 ，d z 一2 2 t h i sr e s e a r c hw a sf o c u so nt h el ( i n d so fm e s t r a i n s ，m ee 伍c i e n c yo fm em e t h 锄i d o p h o sd e g r a d a t i o na n dt h eb i o l o g i c a lc h 她a c t e r i s t i c s t h er e s “t sa r ea sf o l l o w s ： l 、a c c o r d i n gt 0m e i rc h 觚a c t e r i s t i c so ft h ec u l t u r ec 0 1 0 n y ，b i o l o g i c a la n dc h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n 、a i l a l y s i sa i l dc o m l ) a r i s o no ft 1 1 e16 s r d n as e q u e n c e ，w ec a i lk i l o wt h a tt 1 1 e y a r ea l l 伊a n ln e g a t i v es t r a i n s ，d z - l li s 尸始讹扬所d ，? 傩a p ，z 俘f ，z d s s p ，d z 一1 2i s 么缸讲辔口聆船 加e c 口凰s p ，d z - 2 1a n dd z - 2 2a r ep 鲫旭q 向c f p 刀s s p 2 、d e g e n e r a t i o ne f r e c tt 0m e t h a m i d o p l l o s 、d i m e t h o a t ea i l dm o n o c r o t o p h o so ft h e r e f e l l r e ds t r a i ni sd e t e m l i n e dv i as p e c t r o p h o t o m e t e ra n a l y s i sm e t h o d t h er e s u l ts h o w e d t h a ti n15 0 0 m g lm e t h a n l i d o p h o ss a l tm e d i u m ，m ee m c i e n t l yo ft h ef o u rs t r a i n st od e g r a d e m e t h a m i d o p h o si n7 2 hw e r e81 4 7 ，6 8 7 2 ，7 5 3 3 ，7 7 8 6 r e s p e c t i v e l y a tt h es a m e t i m e ，m ef o u rs 缸a i n sc o u l da l s od e g r a d ed i m e t h o a t ea n dm o n o c r o t o p h o s 3 、u s i n gt h es o l i da 1 1 dl i q u i dc u l t u r e ，w es t u d i e dt h et o l e 姗c ec o n c e n t r a t i o no ft h e f o u rs t 】r a j n st 0m e m 姗i d o p h o s t 1 1 er e s u l t ss h o w e d 血a tt h e yk l dh i g h e re n d u r a n c ei n m e t h a i l l i d o p h o sp e s t i c i d e s ，t l l eh i 曲e s tt o l e r a n c ec o n c e n t r a t i o nt oi ti 砌r e a c h e d4 0 0 0 m l ， w h i c hw e r ed z 一1 12 u l dd z - l2 o nt 1 1 ew h o l e ，m et 0 1 e r a n c ec o n c e n t r a t i o ni nt h es o l i d c u l t u r ei sh i 曲e rt h a 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h r a d v 首先发现有机磷杀虫剂后，已经历了六十 余年的历史( 罗明典，1 9 9 8 ) 。有机磷农药( o p s ，o 玛a n o p h o s p h a t eo ro 舯p h o s p h o m s p e s t i c i d e s ) 以其种类多、毒性高、环境中持久性低等特点替代了有机氯而成为农业生 产中使用最广泛的一类农药，不仅使用量成倍增长，使用范围也逐渐扩大，从控制农 作物病虫害的杀虫剂扩展到杀菌剂、杀软体动物剂、杀鼠剂、除草剂、脱叶剂和植物 生长调节剂等用途。除作为农药使用外，o p s 还广泛用作石油添加剂。 目前世界上有机磷农药的品种已有数百种，常用的1 0 0 种左右，产量约7 0 余万 吨，占农药总量的1 3 。我国是农业生产和使用大国，农药总产量居世界第二位，我 国自1 9 8 2 年“六六六 、“d d t 相继停产、限用、禁用后，有机磷农药的比重就更 为突出。现有有机磷农药品种达2 0 0 余种，其中常用的有3 0 余种，产量则占全国农 药总量的一半以上。耕地面积的不断减少，世界人口的不断增加，使得粮食问题成为 新世纪日益突出的问题。通过使用杀虫、杀菌、除草农药，世界农作物产量有效地提 高了3 倍。如若离开化学农药，世界农作物的损失将高达7 0 。由此可见，化学农药 作为农业丰收丰产的保障之一，已成为人类生存和发展不可缺少的物资。 目前，世界有机磷类杀虫剂的产量占整个杀虫剂产量的1 3 以上，年销售额在3 0 亿美元以上。我国年均防治农作物病、虫、鼠害化学农药按纯用量在2 2 2 5 万吨，而 杀虫剂占总量的7 0 ，有机磷农药又占杀虫剂总量的7 0 。近年来虽然开发了不少 超高效的新农药，但由于价格、使用习惯等因素，新产品还远远不能取代有机磷农药。 随着o p s 的大量使用，o p s 引发了_ 系列的世界性问题。o p s 对环境中地下水、 地表水等水资源和土壤的污染( l a c o n ese ta 1 ；m u n c hdje ta 1 ) ，对非靶向生物体 的毒性，在食物中的残留以及对人类健康的威胁等问题成了全球普遍关注的焦点 ( h a y e sale ta 1 ；m e 锄sje ta 1 ) ，因此，这些问题的解决也成为了近期的研究热点。 1 1 2 有机磷农药的种类 化学农药按其用途分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂、粮食熏蒸剂 等；按其化学组成分为有机氯、有机磷、有机氟、有机氮、有机硫、有机砷、有机汞、 氨基甲酸酯类等。有机磷农药( o 唱a n o p h o s p h o 印u sp e s t i c i d e s ，o p s ) ，大多数属于酯 类，一般难溶于水( 乐果、敌百虫除外) ，易溶于有机溶剂。一般分为四类：磷酸酯 类、硫代磷酸酯类、硫代磷酸酯类、硫代磷酰胺类，其中以磷酸酯类和硫代磷酸酯类 化合物居多。据2 0 0 3 年统计，以有机磷农药即甲胺磷、甲基对硫磷、乐果、马拉硫 磷、敌百虫、敌敌畏、氧化乐果、对硫磷、毒死蜱为代表的农药，仍然占据我国农药 市场的主导地位。 1 1 3 有机磷农药使用引起的环境问题 1 1 3 1 有机磷农药对大气的污染 有机磷农药对大气的污染主要是由于其挥发性。喷洒时可随风漂散，落在叶面上 可随蒸腾气流进入大气，在土壤表层时也可经日照蒸发到大气中，大风扬起农田的尘 土也带着残留的农药形成大气颗粒物，漂浮在空中。大气中的农药可随风长距离地迁 移，由农村到城市，由农业区到非农业区，甚至到无人区。人们己从世界屋脊青藏高 原的南迦巴瓦峰( 海拔4 2 5 0 m ) 的积雪中检测出有机磷农药。大气中残留的农药的危 害主要表现在两方面：一是通过呼吸影响人体或生物的健康；二是通过干湿沉降，影 响地表水体与植物( 刘维屏，2 0 0 6 ) 。 1 1 3 2 有机磷农药对水体的污染 有机磷农药水污染有以下几种途径：近水道农药喷洒，下水道排水；来自使用农 药区域的径流；不规范的处理农药容器；在田间渗水坑不得当的处理废农药；清洗喷 洒和贮存农药的设备或被农药污染的设备；农药泄漏；农药污染的土壤淋浴；大气污 染物的干湿沉降等。水体产生的农药污染，最终通过生物链影响人类的健康。 1 1 3 3 有机磷农药对土壤的污染 土壤是污染物的汇，也是污染物的源。农药土壤污染是农药污染最典型的例子之 一。农药进入土壤的途径有三种情况：第一种是农药直接进入土壤包括施用的一些除 草剂，防治地下害虫的杀虫剂和拌种剂，后者为了防治线虫和苗期病害与种子一起施 入土壤，按此途径这些农药基本上全部进入土壤；第二种是防治病虫害喷洒农田的各 类农药。它们的直接目标是虫、草，目的是保护作物，但有相当部分农药落于土壤表 面或落于稻田水面而间接进入土壤；第三种是随着大气沉降、灌溉水和植物残体。研 究表明，农田土壤一般都受到不同程度的农药污染。土壤污染了，土壤上生长的作物 和结出的果实也会吸收污染的空气，这是一个比较复杂的过程。最后人们食用污染了 的果实就相当于直接摄入农药。农药在土壤环境中的行为和归宿，包括滞留( 吸附、 结合残留等) 、迁移( 挥发、脱附、淋浴等) 和转化( 生物、化学及光降解) 过程。 这些过程除了与农药本身的分子有关系外，在很大程度上还受土壤的物理化学、生物、 气候等因素的影响( 刘维屏，2 0 0 6 ) 。 1 1 3 4 有机磷农药对农作物的污染 土壤农药对农作物的影响，主要表现在影响农作物的生长和农作物从土壤中吸收 的农药导致农产品质量的降低。 农作物吸收土壤农药的程度取决于农药的性质，植物一般容易吸收水溶性的农 2 药，而不易吸收脂溶性的被土壤强烈吸附的农药。农药被农作物吸收，进入植物体内。 由植物根部吸收的农药量，取决于农药在植物根部表皮脂质中的溶解性；在植物体内 被转移的量，则取决于农药在植物组织中的水溶性。例如内吸性药剂能被植物的根、 茎、叶所吸收，并随植物体内水分、养分的输导而传播，所以它们引起植物的污染程 度是突出的。而那些性质稳定的内吸剂，如氟乙酞胺，或消失缓慢的内转毒性内吸剂 如乙拌磷、内吸磷等，它们造成的污染问题更为严重。穿透性强的农药能透过植物表 皮组织深入到植物内部积累起来，这种药剂对作物的污染也较为突出。穿透性差的农 药仅污染作物表面，污染程度相对低一些。 此外，农药对作物的污染程度也与作物的种类有关。研究表明，最易吸收的作物 是胡萝卜，其次是草葛、菠菜、萝卜、马铃薯、甘薯等( 程国峰等，1 9 9 8 ) 。农作物 易从砂质土中吸收农药，而从粘土和有机质中吸收比较困难。水生植物从污水中吸收 农药的能力比陆生植物从土壤中吸收农药的能力要强得多。所以水生植物中的农药残 留量往往比其生长环境( 水) 中的农药含量高出许多倍。 1 1 3 5 有机磷农药对自然界各类动物的污染 由于农药可以污染自然环境，势必影响生活在自然界中的各种动物。有机磷农药 对昆虫和哺乳类动物均呈现毒性，破坏神经细胞分泌乙酰胆碱，阻碍刺激的传送机能 等生理作用，使之致死。如蜜蜂和其他传粉昆虫能帮助多种植物传粉，对农业生产起 着重要作用。但是蜜蜂对多种农药是敏感的，大田施药若不注意，就会引起蜜蜂大量 死亡，蜜蜂死亡除直接造成经济损失外，也间接影响农作物的产量。 在化学防治中，农药对非靶生物如青蛙、蜘蛛等害虫的捕食天敌以及寄生蝇、线 虫等寄生性天敌的影响也是不可忽视的。在不同类的农药品种中，以杀虫剂对害虫天 敌的影响较大，而杀菌剂与除草剂影响较小。由于大量杀伤天敌，破坏害虫与天敌间 的生态平衡，可能导致害虫再猖獗，给防治工作带来更大的困难。 农药残存在土壤中，对土壤中的原生动物以及其它的节肢动物、环节动物、软体 动物的等均产生不同程度的影响。研究发现三种杀虫剂( 乐果、抗蚜威、 f e n p r o p i m o 印h ) 对土壤原生动物自然种群具有消极影响( f l e m m i n ge e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 研究有机磷农药废水灌溉对土壤动物群落的影响时发现：土壤动物种类和数量随着农 药影响程度的加深而减少，在农药污染严重的试验区动物的种类和数量都显著低于轻 度污染区和对照区，有一些种类甚至完全消失( 王振中等，1 9 9 6 ) 。另外，试验证明 农药污染对土壤动物的新陈代谢以及卵的数量和孵化能力均有影响( a b d u lmme t a 1 ，1 9 9 7 ) 。 1 1 3 6 有机磷农药对人体的危害 农药既是重要的农业生产资料，又是对生物体有害作用的化学物质，即具有毒物 的属性。农药可经消化道、呼吸道和皮肤三条途径进入人体而引起中毒，其中包括急 性中毒、慢性中毒等。有机磷农药常被用作杀虫剂喷洒在果树、蔬菜上，虽然它比有 机氯农药较易降解，残留期较短，但有机磷农药毒性较高，如果残留在水果、蔬菜上 的农药或进入环境的农药进入有机体，大部分对生物体内胆碱酯酶有抑制作用，抑制 胆碱酯酶使其失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱积累，引起神经功能紊乱，从 而导致肌体的损害。另据报道有机磷农药对人们的思维和记忆以及后代的健康均有危 害，人们长期食用农药残留较多的蔬菜和水果，极为有害( l u c i a n o t t o z 西e ta i ， 2 0 0 1 ) 。 另外，由于人们的生活方式不注意，误服、误食、食用不卫生的水果，蔬菜和不 注重个人的清洁卫生的情况也会引起药物性中毒。大多有机磷农药能溶解在人体的脂 肪和汗液中，可以通过皮肤进入人体，危害人体的健康。农药对环境残留危害是不可 避免的，但人类可以通过适当措施加以控制，使其残留影响尽量减少到环境可以容许 的程度。 1 2 有机磷农药在环境中的降解 1 2 1 有机磷农药在环境中的水解 农药的水解是农药分子与水分子发生相互作用的过程，它是农药在环境中迁移转 化的一个重要途径。有机磷农药水解形式主要包括酸催化、碱催化，但有机磷农药碱 催化水解要比酸催化水解容易得多，有机磷农药在碱性条件下水解速率比在酸性条件 下高，这是因为有机磷农药的水解主要是发生在磷原子与有机基团连接的单键结构上 ( 这个有机基团是取代羟基或羟基上的氢原子的) ，而o h 。取代有机磷农药的有机基 团要比矿取代有机磷农药的有机基团要容易的多，这与农药的本身结构以及o h - 的 氧化能力强有关。当发生碱性水解时，有机基团被水中的o h 。所取代；当发生酸性 水解时，有机磷农药中的有机基团被h + 取代。 有机磷农药在土壤中的水解速率与在纯水中的水解速率是不一致的，有机磷农药 在无土体系中的水解要比在有土体系中的水解慢得多。反应温度、水解时间、农药浓 度及反应p h 值等都对水解反应有不同程度的影响。在处理甲胺磷生产废水的研究中 发现，当反应温度由1 4 提高到2 0 时，有机磷水解率由2 5 7 上升到7 5 5 ，水 解时间由0 5h 提高到3 0h 时，有机磷水解率由3 6 4 上升到7 3 1 ，有机磷浓度由 9 8 9 m l 提高到5 5 3 0 m g l ，有机磷水解率由2 5 9 提高到4 6 9 ( 高明华等，1 9 9 9 ) 。， 有机磷农药的水解速度也随p h 值的增大而加快，如甲胺磷在2 3 、p h 值由4 0 上 升到1 0 0 时，其水解5 0 的时间由7 4 d 下降到2 。2 d 。亚胺硫磷在2 5 、p h 值由4 0 6 上升到9 0 时，其水解5 0 的时间则由1 5 h 下降到0 2 2 h ( h h 麦尔尼科夫，1 9 8 5 ) 。 4 1 2 2 有机磷农药在环境中的光降解 光解反应是指光电离、光解离和光异构化等反应，一般包括初级反应过程和次级 反应过程。农药可以吸收一定的光能量或光量子，发生光物理和光化学反应。光物理 反应包括辐射能以光、热等能量形式吸收或释放，但农药分子形态没有变化；而光化 学反应则是通过农药分子的异构化、键断裂、分子重排或分子间反应生成新的化合物 ( 刘维屏，2 0 0 6 ) 。其中光分解反应是其中最重要的一种。由紫外线产生的能量足以 使农药分子结构中碳一碳键和碳一氢键发生断裂，引起农药分子结构的转化，这可能 是农药转化或消失的一个重要途径。各种农药对光化学反应都具有一定的敏感性，光 解对于降解土壤中的农药有着重要作用。光降解也是有机磷农药在土壤环境中转化 的一条主要途径。如辛硫磷在2 5 3 7 m n 的紫外光下照射3 0 h ，可产生中间产物硫 代特普，但照射8 0 h 以后，中间产物逐渐光解消失( 戴树桂，1 9 9 7 ) 。但紫外光难于 穿透土壤，因此光化学降解对落到土壤表面与土壤结合的农药的作用可能是相当重要 的，而对土表以下的农药的作用较小。 光强度的强弱和土壤湿度的变化对有机磷农药的光降解产生重大的影响。光强度 的不同，有机磷农药的降解速率亦不同。j e a nm a r i eh e n l n a r u l 等证实了安啶磷在辐射 能量为1 5 1 0 1 7 p s 时光降解9 8 的时间为1 0 m i n ，而在辐射通量为1 4 1 0 1 6p s 时光 降解9 8 的时间则为3 0 m i n ，并且指出安定磷的光降解反应符合一级动力学反应 ( j m h e m a n ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。岳永德等研究了甲基对硫磷、氟乐灵和三哇酮在土 壤中的光化学降解，发现它们也都符合一级反应动力学( 岳永德等，1 9 9 5 ) 。在不同 湿度下，有机磷农药的光解半衰期有很大的变化，土壤湿度的变化影响光解速率的可 能机制为：当湿度变大的时候，溶于水中的农药量也随之增加，而且水中的o h 氧 化基团因光照也随之增加，从而使农药的氧化降解速率加快。 1 2 3 有机磷农药在环境中的微生物降解 有机磷农药被微生物降解是它们在土壤中转化的重要途径，有机磷农药的微生物 降解主要存在以下过程，一种是微生物本身含有可降解该农药的酶系基因，当有机磷 农药进人土壤后，微生物马上能产生降解有机磷农药的降解酶，在这种情况下，降解 菌的选育较为容易；另一种是微生物本身并无可降解该有机磷农药的酶系，当农药进 入环境以后，由于微生物生存的需要，微生物的基因发生重组或改变，产生新的降解 酶系。y o n e z a v 忆y 等认为当微生物对有机化合物的降解作用是由其细胞内的酶引起 时，微生物降解的整个过程可以分为三个步骤：首先是化合物在微生物细胞膜表面的 吸附，这是一个动态平衡；其次是吸附在细胞膜表面的化合物进入细胞膜内，在生物 量一定时，化合物对细胞膜的穿透率决定了化合物穿透细胞膜的量；最后是化合物进 入微生物细胞膜内与降解酶结合发生酶促反应，这是一个快速的过程( y - o n e z a 、v a ye t a 1 ，1 9 7 9 ) 。 5 农药的微生物降解作用其实质是酶促反应，农药的微生物降解途径已做了大量的 研究。总的说来，农药微生物降解的途径包括氧化、还原、水解，脱卤、缩合、脱羧、 异构化等( 虞云龙等，1 9 9 6 ) 。在对有机磷农药的微生物降解途径的研究中发现，水 解作用是有机磷农药微生物降解最主要的途径。微生物降解主要是多种酶促反应，其 中微生物酶促反应降解方式主要有氧化、还原、脱氢、合成等几种类型( 张超等，2 0 0 6 ) 。 同样，可降解有机磷农药的酶有多种，主要包括加氧酶、脱氢酶、偶氮还原酶和过氧 化物酶等( 林玉堂等，1 9 9 9 ) 。在许多情况下，有机磷农药的微生物降解是在多种酶 的协同作用下完成的。因此，与物理和化学降解相比，微生物降解具有反应条件温和、 反应速度快和反应专一性强的特点。 1 3 微生物降解有机磷农药的研究进展 1 3 1 国外研究概况 国外在农药残留降解方面的工作开展比较早，在降解菌的富集分离、微生物降解 的途径、降解酶及遗传特征和微生物降解的基因工程等方面作了大量工作。e s g i l b e r t 等利用两种能够降解对硫磷的微生物构建对硫磷的生物降解体系，携带对硫 磷水解酶基因的质粒和绿色荧光蛋白标记报告基因。明显提高了对对硝基苯酚的耐受 能力，共焦显微镜分析结果表明生物膜中假单胞菌k t 2 4 4 0 p s b 3 3 7 明显占优势，生物 膜中的分布是异质的。构建的对硫磷生物降解体系用作生物膜，其降解性能优于单种 生物降解体系( e s g i l b e r te tm ，2 0 0 3 ) 。m u b l 巧等从3 支革兰氏阴性细菌中提取 到对硫磷水解酶并测定了分子量和基质特异性，三种酶存在差异( m u b l 巧w w e t a l ， 1 9 8 9 ；m u b l 巧w we ta 1 ，1 9 7 6 ) 。m u r u l e c k e 从混合菌( 月“d 旭卵口耵胖砌m d 嬲， 肌v f 6 叩衙f “肌，彳刃砌m d 行鲫，物聆历d m o 力傩) 提取了对硫磷水解酶，2 2 水解对硫磷 的速率比化学水解( p 1 m o l ln a o h ，4 0 ) 快2 4 5 0 倍，对其它七种有机磷酸酯杀 虫剂( 甲基对硫磷、二嗦农、毒死蜱、三畔磷、杀螟松、杀螟睛、对氧磷) 的水解比 化学水解快4 旺1 0 0 0 倍，且该酶不为农药及农药制剂中的溶剂所抑制( m u 皿e c k e d m e ta 1 ，1 9 7 6 ) 。m 嘲e c k e 将对硫磷水解酶固定于多孔玻璃微粒制成固化酶，固化 酶对对硫磷的k m 为1 0 m l ，净化率达9 0 。用共价结合的方式将对硫磷水解酶固 定于硅胶微粒，也具有良好的活性和稳定性。两种固化酶在大于5 0 ，p h 1 0 和p h 6 时失活，对环境条件的耐受范围较宽，可用于水体中对硫磷及类似结构的有机磷杀虫 剂的净化( m u n n e c k ed m e ta 1 ，1 9 7 9 ：m u 肋e c k ed m e ta 1 。，1 9 8 0 ) 。 1 3 2 国内研究概况 目前从有机磷农药的结构来看，含碳、氮、磷等元素可作为微生物生长要素。自 然界中降解有机磷农药的微生物大体可分为两大类：一类是利用其作为碳、氮、磷源 生长的矿化菌( 许保孝，1 9 8 7 ) ；另一类是仅能利用它作为氮源或磷源，而要补充碳 6 源生长的共代谢菌。由于矿化作用能使农药生物降解，避免产生对环境有潜在威胁的 中间产物，因而是农药生物降解的最理想方式，为降解微生物筛选的首要目标。我国 科学工作者自2 0 世纪4 0 年代开始进行研究，6 0 年代中期以后，这一领域日趋活跃。 国内研究工作者己经分离筛选了大量的降解有机磷农药的微生物，主要表现在：许多 有机磷农药的微生物降解菌株( 包括细菌、真菌、放线菌和藻类等) 相继被分离和鉴定， 如王永杰等从污泥中分离到降解有机磷农药乐果的不动杆菌属菌株g 1 ，能较好地降 解乐果，同时还能降解敌敌畏( 第3 天时降解率为5 3 5 ，2 0 0 m g l ) 、对硫磷( 降解 率为4 3 6 ，1 0 0 m g l ) ( 王永杰等，1 9 9 8 ) ；王银善等从棉田中分离出一株降解对硫 磷能力较强的黄杆菌胁v d 6 口c 招一咖s p p 3 2 ，该菌还可降解甲基对硫磷，水胺硫磷等 ( 王银善等，1 9 8 5 ) ；施国涵等从土壤中分离出青霉属，芽枝霉属，毛霉属，曲霉属 等均能降解灭幼脉3 号，并研究了青霉属对灭幼脉3 号的降解机理和途径( 施国涵等， 1 9 9 5 ) ：肖华胜等从农药厂的污泥中分离到一株降解甲胺磷的假单胞菌丹p 甜如所d 胛嬲 s p w s s ，此菌在1 8 h 内将1 0 0 0m g l 的甲胺磷降解7 5 左右( 肖华胜等，1 9 9 5 ) ；李 淑彬等分离到一株能降解甲胺磷的曲霉m 2 ，在o 2 甲胺磷无机盐发酵液中，m a p 降解率达8 1 5 ( 李淑彬等，1 9 9 6 ) ；虞云龙等从农药厂的废水中分离出一株广谱的 农药降解菌y f l l ，被鉴定为产碱茵属( 彳切，咖刀p s ) 的一个未知种，可降解氰戊菊 酯，溴氰菊酯，氯氰菊酯，甲基对硫磷，对硫磷，杀螟松等多种农药( 虞云龙等，1 9 9 7 ) ； 王保军等系统地研究了门多萨假单胞a p “如聊d 刀砸m e n d o i u md r - 8 菌株对单甲眯的 降解代谢( 王保军等，1 9 9 8 ) ；刘玉焕等从农药厂的污泥中分离到一株能以乐果为唯 一碳源和能源的霉菌，经鉴定为曲霉l 8 ( 刘玉焕等，1 9 9 8 ) ；刘玉焕等还从长期受甲 胺磷污染的土壤中分离到一株华丽曲霉( 彳印p 曙f 刀姗d 阳玎f 螂) ，对甲胺磷具有较高的 降解活性，降解率最高可达8 3 ( 刘玉焕等，1 9 9 9 b ) ；仪美芹等从农药厂的活性污泥 中分离到3 株能以甲基对硫磷为碳源和能源生长的真菌，经鉴定一株为木霉菌 ( 丹f c 办d 沈m 口s p ) ，另2 株为链格袍菌( 彳抛，z 甜砌s p ) ，并对其降解特性进行了研究 ( 仪美芹等，2 0 0 0 ) 。 另外，在有机磷农药降解酶、高效有机磷农药降解基因工程菌的构建、固定化酶 等方面也做了一定的工作。从已经筛选得到的降解菌株黄杆菌属中克隆的对硫磷降解 酶基因和假单胞菌属中克隆出对硫磷的水解酶，并对酶的特性进行详细研究，目前己 经报道的与降解有关的酶有加氧酶、脱氢酶、偶氮还原酶和水解酶等，并且开展了降 解菌株降解酶定位的研究，如从，强v d 6 口c 饱，f 甜聊s p ( a t c c 2 7 5 5 1 ) 和n p “如朋d 门凇 疣m 加材，口m g 中得到的对硫磷水解酶基因a p d 可在其它革兰氏阴性宿主中有较好的表 达。研究者采用基因重组技术或原生质体融合技术，将表达高效降解农药的酶的基因 构建到表达载体中，获得工程菌，以提高具有降解作用的特定蛋白或酶的表达水平， 从而提高降解效率，扩大降解菌的降解谱和提高菌株对环境的适应性。王永杰等利用 原生质体转化构建有机磷农药降解工程菌，将降解有机磷农药甲胺磷、敌敌畏和对硫 7 磷的菌株地衣芽饱杆菌p 1 2 ( 优c ，化淞工 咖p 刀的朋括) 经溶菌酶处理获得原生质体， 其降解率比供体菌株明显提高( 王永杰等，1 9 9 9 ) 。闰艳春等将抗性尖音库蚊五带亚 种的抗有机磷农药基因克隆到质粒p m 。- 4 3 9 中，重组质粒中的酯酶基因已得到表达 ( 闰艳春等，2 0 0 1 ) 。 1 4 有机磷农药微生物降解菌株的富集和种类 1 4 1 有机磷农药微生物降解菌株的富集 可降解有机磷农药微生物的获得途径主要有：从受有机磷农药严重污染的土壤中 筛选分离具有降解有机磷农药特性的菌种，在此基础上进行诱变育种及构建工程菌。 这是目前采用最多的一种方法，一般是利用农药排污口及周围或长期使用某一种有机 磷农药的土壤，经富集培养，分离出可降解有机磷农药的高效菌株。另外，近年来定 向培育优良菌种也受到人们的关注，其方法就是在土壤中通过人为多次施药，培育出 可降解该有机磷农药的微生物。当再次施药时，经降解速率的测定，如发现有机磷农 药在该土壤中的降解速率快于未施药土壤，则可确定可降解该种有机磷农药的微生物 种群已被培育起来，尔后从中分离出高效菌株。 1 4 2 有机磷农药降解的微生物类型 目前人们已分离了许多可降解有机磷农药的微生物，这些微生物包括细菌、真菌、 放线菌和藻类。其中，细菌由于其生化的多种适应能力以及易诱发突变菌株，在降解 有机磷农药的微生物占重要地位( 虞云龙等，1 9 9 6 ；马瑛等，1 9 9 9 ) 。因此对细菌的 研究较为深入，真菌因其卓越的降解有机磷农药能力正逐渐引起重视，但总体上发展 不如细菌，而放线菌和藻类的研究则相对较少。表1 列出了几种主要有机磷农药的降 解微生物( 刘云焕等，2 0 0 5 ) 。 表l 对有机磷农药具有降解作用的微生物种类 i a b i e1m i c i o o r g a n i s m sd e g r a d i n go i g a n o p h o s p h a t e s 从表l 可以看出，一种有机磷农药可被多种微生物降解；同时，一种微生物也可 对多种有机磷农药进行降解。这体现了微生物种类的多样性以及某些微生物功能的多 样性，同时提示某些微生物可以应用于一种或多种农药的降解，而另外一些则只能用 于特定种类农药的降解。可以预见，随着有机磷农药新品种的不断涌现，新的污染问 题也将产生，新的可降解这些有机磷农药的微生物也将被人们发现和利用。 9 1 5 有机磷农药微生物降解途径、降解酶及降解基因 1 5 1 有机磷农药微生物降解的途径 微生物降解有机磷农药的作用方式可以分为二大类：一类是微生物直接作用于有 机磷农药，通过酶促反应降解农药，常见的微生物降解有机磷农药多属于此类；另一 类是通过微生物的活动改变了化学和物理的环境而间接作用于有机磷农药。一般有矿 化作用、共代谢作用、生物浓缩或累积作用和微生物对有机磷农药其他的间接作用( 张 素琴，2 0 0 6 ) 。矿化是将有机物完全无机化的过程，是与微生物生长( 包括分解代谢 和合成代谢) 相关的过程。被矿化的化合物作为微生物生长的基质和能源，但通常只 有部分有机物被用于合成菌体组成物质，其余部分形成代谢产物，如：c 0 2 、h 2 0 、 c h 4 等。共代谢作用是指微生物在有其可利用的碳源存在时，对原来不能利用的物质 也可分解代谢的现象。通常情况下，共代谢只能使有机物得到修饰或转化而不能使分 子完全分解。 1 5 2 有机磷农药降解酶 有机磷农药含有三个磷酯键，所以常被称为磷酸三酯。一般有机磷被分为两种类 型，一种是磷通过双键与氧结合( p = 0 ) ，如甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等；另一种是 磷通过双键与硫结合( p = s ) ，如对硫磷、甲基对硫磷、辛硫磷、水胺硫磷、毒死蜱 等( t r e n eh e ta j ，2 0 0 2 ) 。 1 5 2 1 有机磷农药降解酶的国外研究进展 有机磷农药降解酶( o r g a n o p h o s p h o r o u s a c e i dh y d r o l a s e ) 可降解有机磷农药分子， 破坏有机磷的磷酯键而使其脱毒。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基 不同，所以一种有机磷农药降解酶往往可降解多种有机磷农药。有机磷农药降解酶目 前已被公认为是消除农药残留的最有潜力的新方法。自1 9 7 4 年从假单胞杆菌中检测 出磷酸酯酶的活性，并发现其对对硫磷具有降解作用以来，进一步的研究表明目前已 经发现的农药降解微生物之所以能降解有机磷农药是因为它们分泌一种能水解磷酸 酯键的酶。m u l b 珂ww 等从3 株革兰氏阴性菌中提取到3 个对硫磷水解酶，分别测 定了分子量，并对酶学性质做了研究。这3 个酶分子量不同，对不同底物的作用也不 同( m u l b r yw w e ta 1 ，1 9 8 9 ) 。同年，d 哪a s 等纯化得到来源于假单胞菌的有机磷农 药降解酶，发现此酶是单体球蛋白，分子量为3 9 k d ，有一个锌离子，被巯基试剂抑制， 金属鳌合剂、e d t a 等可使其失活( d 姗a s dpe ta 1 ，1 9 8 9 ) 。1 9 9 1 年又从一株嗜盐 细菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶，分子量为6 0 k d ，可被m g 计和c 0 2 十激活， 对含磷氟键的有机磷化合物作用较好，对含磷氧键的有机磷化合物作用不好。1 9 9 3 年，c h e n gt 等从假单胞菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶，分子量为5 3 l ，最 佳p h 8 o ，最适温度为5 5 ，对含磷氟键和磷碳键的有机磷化合物作用较好( c h e n gt l o e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。m u 衄e c k edm 等分离到的有机磷农药降解酶对试验用的甲基对硫磷、 二嗦农、毒死蜱等7 种有机磷农药均能有效降解，在2 2 时降解效率比化学降解快 1 0 0 0 2 4 5 0