（植物学专业论文）长春花生物碱合成的化学调节、基因克隆及组培的研究.pdf

摘要 摘要 长春花是次生代谢研究中一种重要的模式植物。长春花能生产多种重要的 药用成分，其中双吲哚生物碱长春碱和长春新碱是抗肿瘤药物，单吲哚生物碱 阿玛碱和蛇根碱是高效降压药。 四十年来，人们一直研究用长春花细胞培养来生产这些药用成分或它们的 合成f j 体长春质碱和文多灵，并且发现诱导子在细胞培养中可以作为一个重要 的调节因子来促进次生代谢产物的生成。因此，本论文中用代号为n a e 1 8 的化 学物质对正常的细胞系和e m s 诱导的细胞系分别进行作用，研究结果表明，这 种化学物质可以提高生物碱阿玛碱的含量。 目前，通过遗传操作来提高长春花的次生代谢产物的研究也越来越多。 本文摸索了长春花再生的系统，用愈伤组织进行再生已经有了一定的突破， 但是重复性不是很好。文中对转基因受体材料进行了选择，包括秋水仙碱及绿 色愈伤组织的培养。秋水仙碱已经成功地诱导了四倍体。这些工作为遗传操作 在长春花中的应用奠定了基础。 最后，本文通过r t - p c r 克隆了长春花吲哚生物碱合成的两个关键基因s 驴、 d a t 的c d n a 全长序列，并通过与g e n b a n k 的序列比对发现序列是一致的，可以 进一步进行长春花过表达载体的构建。 关键词：长春花生物碱悬浮培养细胞诱导子植株再生基因克隆 a b s t r a c t a b s t r a c t c a t h a r a n t h u sr o s e u si sa l li m p o r t a n tm o d e lp l a n ti nt h er e s e a c ho fs e c o n d a r y m e t a b o l i s m c a t h a r a n t h u sr o s e u sp l a n t sp r o d u c em a n yp h a r m a c e u t i c a l l yi m p o r t a n t i n d o l ea l k a l o i d s ，o fw h i c ht h eb i s i n d o l ea l k a l o i d sv i n b l a s t i n ea n dv i n c r i s t i n ea r e a n t i n e o p l a s t i cm e d i c i n e sa n dt h em o n o i n d o l ea l k a l o i d sa j m a l i c i n ea n ds e r p e n t i n e r e a r ea n t i h y p e r t e n s i o nd r u g s c a t h a r a n t h u sr o s e u sc e l lc u l t u r e sh a v eb e e ns t u d i e df o rp r o d u c i n gm e d i c i n e so r p r e c u r s o r sc a t h a r a n t h i n ea n dv i n d o l i n ef o ra l m o s t f o u rd e c a d e s e l i c i t o ra sa n e f f e c t i v er e g u l a t o r yf a c t o rh a sb e e nw i d e l yu s e di np l a n tc e l lc u l t u r es i n c ei tc a n p r o m o t ep l a n tc e l l c u l t u r e st oa c c u m u l a t es e c o n d a r ym e t a b o l t e s ，f o re x a m p l e , a l k a l o i d s i nt h i st h e s i s ，w ef o u n dt h a tt h ec h e m i c a ln a m e dn a e 18c o u l dp r o m o t e t h et h ea c c u m u l a t i o no fa j m a l i c i n ei nb o t hn o r m a ls u s p e n s i o nc e l l sa n de m si n d u t e d s u s p e n s i o nc e l l s a tp r e s e n t ，t h er e s e a c ho fp r o m o t i n gt h ea c c u m u l a t i o no fa l k a l o i d si n c a t h a r a n t h u sr o s e u st h r o u g hg e n e t i cm a n i p u l a t i o ni sm o r ea n dm o r e w eh a v et r i e dt oe s t a b l i s har e g e n e r a t i o ns y s t e mf r o mt i s s u ec u l t u r e ，b u tf o u n di t i sn o te a s y i nt h i st h e s i sal o to fe f f o r t sh a v eb e e nm a d et oo p t i m i z et h i ss y s t e m w e a l s om u t a t e dp l a n t sb yc o l c h i c i n ea n do b t a i n e da u t o t e r t r a p l o i d si nc a t h a r a n t h u s r o s e u s ，b e c i d e s ，w ei n v e s t i g a t e dt h ec u l t u r em e d i u mt og e tg r e e nt i s s u e s a l lo ft h e s e w o r kw o u l dp r o v i d es o l i df o u n d a t i o nf o rg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nr e s e a r c h a tl a s t ，w ec l o n e dt h ec d n ao ft w og e n e s ，s t ra n dd a t ，e n c o d i n gk e ye t i z y m e so f i n d o l ea l k a l o i db i o s y n t h e s i si nc a t h a r a n t h u sr o s e u s t h ec d n as e q u e n c e sa r e i d e n t i f i e dt ob ei d e n t i c a lt ot h es e q u e n c e sd e p o s i t e di ng e n b a n k t h e s ew i l lb eu s e d t oc o n s t r u c to v e r e x p r e s s i n gv e c t o r sf o rg e n e t i cm a n i p u l a t i o ni nc a t h a r a n t h u sr o s e u s k e y w o r d s ：a l k a l o i d si nc a t h a r a n t h u s r o s e u s ，s u s p e n s i o nc e l l s ，e l i c i t o r , r e g e n e r a t i o ns y s t e m ，g e n e sc l o n i n g i i 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的e i j 届u 本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：刁葱矗 m 了年月归 经指导教师同意j 本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： i 1 v 巩e l | 、夕 、一 ? 彳 第一章引言 第一章引言 第一节长春花药用成分的研究 1 1 1 长春花生物碱的主要结构类型 2 0 世纪5 0 年代以来，人们逐渐发现长春花 c a t h a r a n t h u sr o s e u s ( l ) gd o n 内含1 3 0 多种吲哚生物碱，其中多数具有生物活性，如文多灵( v i n d o l i n e ) 、阿 玛碱( a j m a l i c i n e ) 、长春质碱( c a t h a r a n t h i n e ) 、蛇根碱( s e r p e n t i n e ) 、长春碱 ( v i n b l a s t i n e ) 、长春新碱( v i n c r i s t i n e ) 等【l 】。其中长春碱和长春新碱是目前应用 最广泛的天然植物抗肿瘤药物，可用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤、急性 白血病、绒毛上皮细胞癌等疾病，其硫酸盐已广泛应用于临床【2 3 】；阿玛碱可用 于治疗高血压、心率不齐等疾病；蛇根碱为镇痛药；而长春质碱不仅具有抗菌 止血、利尿、降血糖等作用，而且它还是抗癌药物长春碱、长春新碱等的合成 前体【4 】。因此长春花具有很高的药用开发价值。 长春花吲哚生物碱主要有两种结构类型：单吲哚型生物碱如文多灵、长春 质碱，阿玛碱、蛇根碱和双吲哚型生物碱如长春新碱、长春碱【5 j ( 见图1 1 ) 。具 有抗癌作用的吲哚生物碱都是双吲哚型生物碱，它们的抗癌活性与细胞微管蛋 白结合的高亲和力有关。 阿玛碱蛇根碱 长春碱 第一章引言 妊番翩i 1 1 2 药理作用的研究 图1 1 长春花吲哚生物碱 支孚爽 从长春花分离的生物碱，多具有抗肿瘤作用，其中长春碱、长春新碱最具 有价值。两者化学结构极相似，但抗瘤谱不尽相同，两药间无交叉抗药性。长 春碱主要用于治疗何杰金氏病、绒毛上皮细胞癌，疗效出现较快；长春新碱对 何杰金氏病的疗效较长春碱低，而对恶性淋巴肿瘤和急性淋巴性白血病缓解作 用较强，特别对于儿童急性白血病之效力与可的松、抗代谢药物相当，但停药 后通常3 星期内可使病情变重，因此治疗持续时间应尽可能长。长春新碱与氨 甲喋呤、巯喋呤、强的松合用效果更好【6 】。此类药物的抗肿瘤原理现在尚未完全 阐明，与一般烷化剂及抗代谢物不同，有人认为这些生物碱能降低d n a 与r n a 及蛋白质的合成，抑制细胞有丝分裂。一般认为，这些药物阻滞微管蛋白凝聚 成微管，并使细胞内微管迅速解体，阻碍纺锤丝的形成，使细胞的有丝分裂在 中期终止，因此它们是细胞周期依赖性抗有丝分裂药物。也有人认为长春碱的 作用如一个阳离子与多种蛋白产生沉淀，与c a 2 + 相似【6 】。最近h a l e rs 等【1 7 】报道： 在体内长春碱和长春新碱发挥抗癌作用的机制之一是通过诱导b e l 2 蛋白的抗凋 亡活性，最终导致细胞凋亡。另外，阿玛碱、蛇根碱是高效降压药。国外民间 用长春花叶及植物治疗糖尿病，从中分离的文多灵、长春质碱和环氧长春碱均 有不同程度的降血糖作用。并且文多灵、长春质碱还是降血脂药，也是合成抗 癌药物长春碱的前体【s j 。 2 第一章引言 第二节长春花吲哚生物碱代谢途径的研究 1 2 1 长春花吲哚生物碱代谢途径 过去的2 0 年中，人们对长春花生物碱的代谢途径进行了广泛的研究，目前 已基本了解( 见图1 2 ) 。长春花含有1 2 0 多种类萜吲哚生物碱t i a s ( t e r p e n o i di n d o l e a l k a l o i d s ) ，所有t i a s 都是由中间化合物异胡豆苷( s t r i c t o s i d i n e ) 转化而来的。 异胡豆苷的合成则与莽草酸途径和质体的m e p ( p l a s t i d i c2 c m e t h y l d e r y t h r i t o l 4 - p h o s p h a t e ) 途径有判9 1 。由莽草酸途径合成的色氨酸经色氨酸脱羧酶( t r y p t o p h a n d e c a r b o x y l a s e ，t d c ) 脱羧生成色胺；经m e p 途径合成的栊牛儿醇在栊牛儿醇1 0 羟化酶( g e r a n i o l10 - h y d r o x y l a s e ，g 1o h ) 和细胞色素p 4 5 0 还原酶( c y t o e h r o m e p 4 5 0r e d u c t a s e ，c p r ) 催化下生成1 0 ，羟基栊牛儿醇，然后经多步反应生成裂环马 钱子( 1 0 9 a n i n ) ，经裂环马钱子苷合酶( s e c o l o g a n i ns y n t h a s e ) 催化形成裂环马钱子 苷( s e c o l o g a n i n ) 。色胺和裂环马钱子苷在异胡豆苷合酶( s t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ， s t r ) 催化下偶合成异胡豆苷。异胡豆苷是多种t i a s 合成的共同前体，由异胡豆 苷p d 糖苷酶( s t r i c t o s i d i n ep d g l u c o s i d a s e ，s g d ) 催化脱去葡萄糖，生成去糖 苷基异胡豆苷( c a t h e n a m i n e ) ，由c a t h e n a m i n e 分支形成长春质碱、阿玛碱、它波宁 ( t a b e r s o n i n e ) 以及蛇根碱、洛克新碱( 1 0 c h n e r i c i n e ) 、e c h i t o v e n i n e 、h o r h a m e r i c i n e 等单吲哚生物碱【1 0 , 1 1 】。 它波宁是文多灵的合成前体。文多灵合成的途径已基本清楚，它波宁经依 赖于细胞色素p 4 5 0 的单氧化酶t 1 6 h ( t a b e r s o n i n e1 6 h y d r o x y l a s e ，t 1 6 h ) 氧化生 成1 6 羟基它波宁( 1 6 h y d r o x yt a b e r s o n i n e ) 。后者经1 6 o h 氧位甲基转移酶 ( 1 6 o h o m e t h y l t r a n s f e r a s e ，1 6 - o ho m t ) 催化形成1 6 甲氧基它波宁，然后可 能是由一种水合酶催化形成1 6 甲氧基2 ，3 二氢它波宁，后者再由n 甲基转移酶 ( n m e t h y l t r a n s f e r a s e ，n m t ) 催化形成脱乙酰氧文多灵，脱乙酰氧文多灵一4 羟化酶 ( d e s a c e t o x y v i n d o l i n e4 - h y d r o x y l a s e ，d 4 h ) 催化脱乙酰氧文多灵形成脱乙酰文多 灵，最后由脱乙酰文多灵1 7 o 一乙酰转移酶( d e a c e t y l v i n d 0 1 i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e ， d a t ) 催化，形成文多灵。文多灵与长春质碱合成长春碱，长春新碱等双吲哚生 物碱。 到目前为止，a s 、g 1 0 h 、t d c 、s t r 、d 4 h 和d a t 已经进行了分离纯化。 3 第一章引言 1 2 2 长春花吲哚生物碱代谢途径的细胞定位 文多灵生物合成的关键酶的分布可以明确说明吲哚生物碱的复杂的区室 化分布。文多灵的合成涉及至少七个不同的亚细胞区域 1 2 1 ；f l ：i t d c 催化的由色 氨酸到色胺的过程发生在细胞质中1 0 , 1 3 】；然后色胺会穿过液泡膜进入液泡中，在 液泡中e h s t r 催化色胺和裂环马钱子苷偶联形成异胡豆苷1 4 】；s g d 催化异胡豆苷 莽革百魅金径( 吲哚途径) 查耳酮 工a s ( 质嫩) 令5 氯基苯甲酸 ： + 像酸 质傩中的i v l e p 途径 5 一磷酸脱至瓦木糖 i 慧 ii i e c s 5 一磷酸甲基禾酮糖赤藓糖醇( 1 怔p ) i 黑 糖午，j l 醇 l c p rg 1 0 h ( 前瀚包膜) 1 0 毒丕基特jl 醇 ；l 毗g o ( ；蘅包厕 裂环马钱子 t d c ( 细胞质) 汀啦泡)i 鼠s 色艘1 一裂环马钱子苷 i 异荫豆苷 ls g d ( 内质网) 去i 目亭旨基畀胡豆苷 i c a t 穷赢a 喇n e 图1 2 长春花吲哚生物碱合成途径简图 ( 图中粗体的基因表示已经被克隆，括号中注明了关键酶的细胞定位) 4 第一章引言 的去糖基化反应，体内定位实验表明s g d 位于内质网中【1 5 】；g 1 0 h 结合于前液泡 膜上【1 6 】；t 1 6 h 也定位于内质网【1 7 】；n m t 被证明与类囊体膜结合【1 0 , 1 8 】；文多灵合 成的最后两步分别由d 4 h 和d a t 催化，其催化的反应在细胞质中进行 1 0 , 1 9 】；文多 灵可能随后又会被运输回液泡，因为催化文多灵生成长春碱的非特异性过氧化 物酶定位在液泡中l 2 0 1 。可见中间体在细胞内的运输是很频繁的，但对其调控机 制知之甚少。综上，吲哚生物碱的代谢途径主要集中在叶绿体、细胞质、内质 网以及液泡中。这种区室化分布有效地将有毒的生物碱及中间体与细胞质隔开， 还可通过额外的调节水平和反馈抑制调控代谢速率，除此之外，还可以使关键 酶在各自的微环境中达到最适的活性。( 见图1 3 ) 图1 3 长春花吲哚生物碱合成途径在细胞中的定位简图( 参考文献 2 1 】) 1 2 3 长春花吲哚生物碱代谢途径的组织定位 长春花叶片中含有长春质碱、文多灵、长春碱和长春新碱，而根中只有长 春质碱、阿玛碱、蛇根碱，没有长春碱和长春新碱。合成长春碱的前体文多灵 主要在叶片中形成。在叶片的表皮细胞中先合成色胺和裂环马钱子，在一系列 酶的催化下形成1 6 甲氧基它波宁，然后可能再将这些中间产物运输到叶片的叶 肉细胞，形成1 6 一甲氧基2 ，3 - 二氢它波宁，后者进入叶子的异细胞( i d i o b l a s tc e l l ) ， 第一章引言 乳汁细胞( 1 a t i c i f e r c e l l ) 后进一步形成文多灵【2 2 1 。吲哚生物碱的分布与关键酶的 分布有一定的关烈2 3 1 。t d c 矛i s t r 主要分布在长春花的叶、茎表皮和花芽的表皮 中，以及在根尖分生组织周围的表皮原及皮层细胞中2 4 ，2 5 1 ，而d 4 h 和d a t 分布在 叶片、茎及花芽的乳汁细胞和异细胞中。t 1 6 h 只存在于不暴露在空气中的器官 田 1 7 】 ：七 o 第三节长春花吲哚生物碱代谢途径相关酶基因的克隆和表达调控 1 3 1 相关酶基因的克隆和表达研究 1 9 8 9 年，d el u c a 等人首先克隆了t d e 基因，此后不断克隆了d x s 、a s 、e p r 、 g l o h 、s t r 、s g d 、s l s 、t 1 6 h 、d 4 h 、d a t 等基因。对于其余的n m t 、o m t 等基因， d e t h i e r m 和c a c a c es 等人也相继进行了克隆的努力，但是由于酶的不稳定，至 今尚未克隆出来( 见图1 3 ) 。在这些基因中，最具有研究潜力的基因是类萜途 径的关键基因如g l o h 、s i s ，因为能够为长春花悬浮细胞提供前体裂环马钱子或 裂环马钱子苷而促进生物碱的积烈2 6 , 27 1 。砒、s t r 、g l o h 、s g d 是长春花植株及悬 浮细胞培养中起主要作用的关键酶，它们是目前研究最深入的酶和基斟2 1 1 。 但是，在长春花关键酶基因过表达的研究当中，只是检测到中间产物的积累提 高，在长期的培养过程中很少检测到所期望得到的吲哚生物碱。h o n g 等人发现 t d c 的活性与色氨酸的含量有关，而a s 是色氨酸合成途径的限速酶。a s 有a 和 b 两个亚基。色氨酸会直接反馈抑制a s 的活性。试验证明通过编码a s 的c 和 b 两个亚基的基因的过表达可以提高t d c 的活性，然而只是提高色胺的含量， 没有提高吲哚生物碱的含型3 2 j 。 最近，有研究表明，在不同长春花的品系及突变系中，s 护基因的表达与吲 哚生物碱的含量是成正比的【3 引，而与t d c 的活性相关性不大，由此可以推钡, un j i 哚生物碱的积累与类萜途径的相关性更强些。 1 3 2 转录因子的研究 对于涉及多个基因表达的植物次生代谢，同时增强多个基因的协同表达是提 高次生代谢物产量所必需的。次生代谢途径中多个酶基因的协同表达与这些基 6 第一章引言 因调控序列中相同或相似的顺式作用元件受到相同的转录因子或调节基因的作 用有关【3 引。因此，增强这些关键酶的基因的转录因子基因或调节基因的表达， 是实现增强多个基因协同表达的可行途径。已分离了多种有关次生代谢基因表 达的调节基因或转录因子基因，如从长春花中分离了o r c a ( 茉莉酸诱导型的 a p 区域转录因子) 3 5 , 3 6 】。在o r c a 的克隆与过表达的研究中，发现在j a 的诱导 下，促进了一些生物碱的关键酶基因的表达，然而只有在饲喂裂环马钱子下， 、才会提高生物碱的积累，原因可能是o r c a 无法影响与其他的调节子相关的基 因的表达【3 7 , 3 8 】。最近，p a u w 等人研究发现一种锌指蛋白家族z c t l 、 z c t 2 、 z c t 3 ，它们可以与t d c 、s t r 的启动子结合，实验证明它与真菌诱导子的诱导 有判3 9 】。l e m e n a g e r d 等人纯化并克隆了与长春花生物碱积累有关的一种蛋白 c r p s ，它可能与生物碱积累途径的信号传导有关【4 。用s t r 的启动子的g b o x 做为诱饵，用酵母单杂交系统从长春花的c d n a 文库中分离出b h l h 转录因子， 相关的蛋白c r m y c l 在酵母中可以特异的结合到g b o x 上，在长春花悬浮细胞 中c r m y c lm r n a 的水平可以被真菌诱导子和j a 诱导，因此推断c r m y c l 可 能是对这些信号发生响应的基因表达的调节子】。n i c o l a s 从长春花中e d n a 文 库中通过p c r 分离出两个e d n a 片断c r r r 2 和c r r r 3 ，c r r r 3 编码1 8 8 个氨 基酸，可在长春花根中表达，在长春花的悬浮细胞中加入玉米素后，它的表达 可瞬时提高，由此推断c r r r 3 蛋白可能与细胞分裂素提高生物碱含量的机制有 羊 4 2 】 lo 第四节提高长春花吲哚生物碱含量的研究 1 4 1 完整植株 长春花原产于非洲东部，逐渐分布在世界各地，尤其在热带和亚热带地区。 近年印度的研究者对其进行了简单的分类：一类为不同的花期和花色的观赏型 的长春花，如p a c i f i e a ；一类为用于医药用途的长春花，如n i r m a l 、p r a b a l 、d h a w a l 。 在不同品种的长春花中，吲哚生物碱的含量也是有差异的。用于医药用途的 n i r m a l 、p r a b a l 、d h a w a l 三个品种的吲哚生物碱的含量均高于观赏型的品种 p a c i f i c a 。而p r a b a l 的叶片中的长春质碱、文多灵、长春碱、长春新碱、根中的 蛇根碱的含量是n i r m a l 、p r a b a l 、d h a w a l 三个品种中最高的，而d h a w a l 的根中 7 第一章引言 的阿玛碱的含量是最高的【2 3 】。 在我国长春花主产于海南、广东、广西、云南等地，有专家认为，海南生 长的长春花药用价值最高，原因是地域的栽培条件有益于生物碱的积累。因此， 自上个世纪7 0 8 0 年代起，广东、福建药商长期收购海南文昌附近的野生长春花， 晒干后作为基础原料出口到德国、日本等国家。 野生型的长春花的花冠为粉红色或紫红色，此外，尚有变种白长春花 c a t h a r a n t h u sr o s e u s ( l ) gd o nv a t a l b u s ( s w e e t ) gd o n 】，黄长春花 c a t h a r a n t h u s r o s e u s ( l ) gd o nv a t f l a v u s ( t s i a n g ) m e t c a l f l ，形态与本种相似，仅花的颜色不同， 前者花白色，后者花黄色，其药用价值相同。近年，云南有报道：昆明有较珍 贵的蓝色长春花园艺品种，亦可药用【4 3 1 。 1 4 2 通过组织培养和细胞培养手段生产长春花吲哚生物碱 l o y o l a v a r g a s 等人用生长调节剂诱导三年生的长春花的细胞系得到绿色的 愈伤组织。作者进一步的研究发现在白色和绿色的愈伤组织中同时检测到长春 新碱和长春碱。而绿色的愈伤组织中的生物碱的含量是白色愈伤组织的两倍左 右。而在没有生长素的前提下，3 m g l 的6 - b a 不仅可以提高愈伤组织中的叶绿 素的含量，。而且还可以提高双吲哚生物碱的含量l 4 4 】。长春花愈伤组织的生长条 件对于生物碱的含量起关键的作用。m o r r i s 等人用三种不同的培养基( b 5 、m s 、 z e n k ) 诱导叶片得到愈伤组织，同时作者还将材料分别光下和暗下进行培养。 结果显示愈伤组织的颜色、形态和生物碱的含量各有不同。只有在z e n k 培养基 诱导的愈伤组织中同时检测到长春质碱、文多灵、阿玛碱和蛇根碱。而蛇根碱 只在暗下培养中检测到【4 5 j 。 王宁宁等人用根癌农杆菌c 5 8 转化长春花愈伤组织获得冠瘿组织。实验表 明，冠瘿组织与愈伤组织相比，在细胞产量、吲哚总碱及阿玛碱含量等方面都 有很强的优势一酬。 用农杆菌( t i 或硒) 感染后的激素不依赖型细胞系和毛状根，都发现了能 形成文多灵的系。 近几年，利用悬浮培养细胞系来提高生物碱的含量，特别是长春碱和长春 新碱的含量的研究越来越多。然而，长春花的细胞系存在着异质化的问题，即 细胞系中既有可生成高产量生物碱的细胞又有不生成生物碱的细胞。所以研究 8 第一章引言 者用紫外线，或具放射性的射线等诱变手段来扩大细胞系的遗传资源【4 7 1 。 研究表明，愈伤组织或悬浮培养细胞都能合成单吲哚生物碱长春质碱、阿 玛碱和蛇根碱，有少数报道指出，也能合成文多灵【4 8 1 。1 9 9 7 年，b a r r yr 等人 报道，他们用农杆菌侵染长春花叶圆片，得到了3 个能在无激素培养基上生长 的转化细胞系【4 9 1 ，这些细胞系在6 年的培养时间中，都能合成长春质碱、阿玛 碱和文多灵，而且其中的c r a 2 8 1 s 细胞系能够形成畸形苗，同时积累文多灵的 能力远远高于长春质碱和阿玛碱。这就说明用悬浮细胞生产双吲哚生物碱是有 可能的。 1 4 3 控制栽培条件 1 4 3 1 光 在光下，在未分化的组织( 如：愈伤组织、悬浮细胞) 的生物碱的含量是 不足和不稳定的，而在大田中光线更是难以控制。1 w a s e 等人建立了一个新的研 究提高长春花生物碱的系统，即用完整离体叶片进行液体培养，添加合适配比 的激素、合适的渗透势、较弱的光线、葡萄糖浓度为1 0 l 、叶片中的阿玛碱及 蛇根碱的含量提高了1 0 倍 5 0 】。 1 4 3 2 环境因子 a b d o l z a d e h 等人用不同浓度的氮源处理长春花植株，来研究它的生物产量 和生物碱的积累，在施加l l m m 的硝酸铵时长春碱与长春新碱的产量达到最高， 而生物产量的提高与生物碱的积累没有直接关系【5 ，而进一步研究表明改变长 春花幼苗的氮源可以提高过氧化酶的活性，而且还能提高叶片和根中的生物碱 的含量【5 2 】。改变培养基中的矿物元素镁和锰的含量，也可以达到提高生物碱的 含量的目的【5 3 】。e 1 m e r g a w i 等人改变长春花植株的灌溉频率和施加水杨酸的浓 度来提高长春新碱的积累，发现每隔三天灌溉一次和施加3 m m 的水杨酸时，长 春新碱的积累最高【钏。而用不同配比0 2 与c 0 2 处理悬浮培养的长春花细胞，发 现最佳配比( 5 0 0 2 + 0 0 3 c 0 2 ) 能使细胞外的阿玛碱的含量达到最耐5 5 1 。 1 4 3 3 信号小分子 x u m a o j u n 等人用不同浓度的n o 的供体硝普纳为原料作用长春花的悬浮 细胞，发现0 5 m m o l l 和1 0 0 m m o l l 的硝普纳可以促进长春碱的合成，而且发 9 第一章引言 现n o 的作用是依赖于茉莉酸的，他发现用真菌诱导子处理后，会产生n o 这种 信号分子【5 6 】，而n o 是通过依赖于蛋白激酶的信号途径来影响长春花细胞的生 物碱合成途径的【57 1 。p a u w 等人研究表明，r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) 可能是真 菌诱导子诱导生物碱关键酶表达的第二信使。真菌诱导子可以促进r o s 的产生， 而r o s 依赖于蛋白质磷酸化和钙离子的浓度。然而，r o s 的产生对于真菌诱导 子诱导生物碱关键酶表达不是必需的 5 8 1 。 1 4 3 4 化学物质 在细胞悬浮液中添加镉元素后，能够提高细胞内和细胞外的阿玛碱的产量， 而镉元素能够提高t d c 的转录水平 ”】。用聚乙二醇提高长春花悬浮细胞的渗透 势能够提高阿玛碱的产量【6 。m o r e n o v a l e n z u e l a 等人通过用胞内和胞外的钙通 道的抑制剂来诱导长春花的毛状根来提高吲哚生物碱的积累及分泌【6 1 1 。j a l e e l 等 人用一种三唑杀真菌剂三泰芬( t r i a d i m e f o n ) 处理长春花植株，发现能提高植株中 的阿玛碱的含量【6 2 | 。 1 4 3 5 植原体 f a v a l i 等人表明，被苜蓿变叶病植原体侵染的长春花植株与正常的植株相 比，长春碱、长春新碱、文多灵和蛇根碱的含量均有所提高【6 3 1 。c h o i 等人用核 磁共振光谱分析来研究植原体侵染长春花叶片后的代谢反应，发现马钱酸 ( 1 0 9 a n i ca c i d ) 、裂环马钱子苷和文多灵的含量有所提高畔】。 1 4 3 6 植物生长物质 p a p o n 等以长春花的悬浮细胞为实验材料发现细胞分裂素与乙烯可以促进 生物碱的生物合成，而且能提高相关基因如g l o h 的表达【6 5 1 。e 1 s a y e d 等人用不 同的植物生长调节剂来处理长春花幼苗，发现茉莉酸甲酯( m e j a ) 可以提高所有 的生物碱的含量，乙烯、脱落酸能提高阿玛碱、蛇根碱、它波宁和文多灵，水 杨酸可提高蛇根碱和它波宁的含量，提高浓度后可提高文多灵的积累。赤霉素 几乎不影响生物碱的水平m 】。r a m e s hk 等人用不同配比的l 蚣和b a 处理长春 花的丛生芽，发现i a a ( 1 1 4 2 p m ) 和b a ( 2 2 2 肛m ) 使丛生芽积累的阿玛碱最高， i a a ( 2 8 5 i - t m ) 和b a ( 8 9 0 l t m ) 使丛生芽分泌到培养基的阿玛碱最高。而丛生芽中 的阿玛碱的含量比一年生的叶片中高2 4 倍 6 1 7 1 。l e e p a r s o n s 等人发现当茉莉酸 ( j a ) 处理长春花细胞培养时，阿玛碱的含量与其处理的时间与浓度有关。本实验 1 0 第一章引言 室研究发现外源的a b a 、乙烯利和a s a 处理的长春花细胞生物产量变化不大， 但吲哚生物碱含量却有明显提高。其中，2 m g l 的a b a 对吲哚生物碱的的诱导 效果最好，与对照相比，吲哚总碱含量增加了1 倍，其中阿玛碱含量增加了5 0 ，而长春质碱含量增加了2 倍多【6 8 】。 1 4 3 7 饲喂前体物质 g a v i r a j 等人用不同的前体物质及有机化合物来饲喂长春花的毛状根，发现 生物碱合成的最关键的f j 体是裂环马钱子苷而不是色胺，这就说明了类萜途径 是生物碱合成的关键途径。而通过饲喂苯巴比妥和琥珀酸也能提高生物碱产量， 说明g 1 0 h 和非甲羟戊酸途径在生物碱合成途径中的重要性 6 9 1 。p e e b l e s 等人发 现在过表达邻氨基苯甲酸合成酶( a n t h r a n i l a t es y n t h a s e ，a s ) 的0 【亚基时，饲喂脱氧 木酮糖，h o r h a m m e r i c i n e 的含量增加1 2 5 ，而饲喂裂环马钱子( 1 0 9 a n i n ) 时使 长春碱的含量增加4 5 ；在过表达a s 的0 【亚基和b 亚基时，饲喂马钱子素时 长春碱增加2 6 ，阿玛碱增加8 4 ，洛柯辛碱( 1 0 c h n e r i c i n e ) 增加1 19 ，它波 宁增加2 2 5 。表明，生物碱的前体的饲喂对于生物碱的含量是重要的因素【_ 7 0 1 。 1 4 3 8 诱导子 用真菌诱导子处理长春花培养细胞能诱导色胺和长春质碱( c a t h a r a n t h i n e ) 的 积累 7 1 1 ，并使t d c 、s t r 和s g d 基因转录增强【7 2 1 。真菌诱导子还能诱导j a 的 形成 1 7 3 】。m e j a 能诱导长春花幼苗中t d c 、s t r 、d 4 h 和d a t 的活性，并使文 多灵含量增加。可见j a 可能是环境作用于次生代谢的信号分子【7 4 7 5 】。j a 激活 t i a 合成基因的过程是通过o r c a ( o c t a d e c a n o i d r e s p o n s i v ec a n t h a r a n t h u s a p 2 e r f d o m a i n ) 转录因子来实现的7 6 ，7 7 1 。现己分离出两个与t i a s 合成有关的 转录因子：o r c a 2 和o r c a 3 ，m e j a 和诱导子能诱导o r c a 2 表达，并且o r c a 2 能特异地结合于s t r 启动子区起反式激活作用【7 3 1 。z h a o 等分别用2 5 0m m 的甘 露醇和4 lk c l 处理长春花致密愈伤组织系( c o m p a c tc a l l u sc l u s t e r , c c c ) ，结果 c c c 生产出比对照高4 - - - , 5 倍的阿玛碱，并发现四甲基溴化铵能使长春花c c c 的阿玛碱和长春质碱产量显著升高【7 8 1 。本实验室张向飞分别用来源于镰刀菌和 黑曲霉的真菌诱导子处理长春花细胞，结果发现：镰刀菌诱导子对长春质碱的 诱导效果最好，最佳处理时间1 6 h ，最适剂量为5 m l ，可使长春质碱的含量比对 照组提高2 8 倍【嘣j 。 第一章引言 第五节长春花吲哚生物碱合成途径的遗传操作 1 5 1 长春花吲哚生物碱合成关键酶的基因工程的研究 过表达j 护基因的细胞系中蛇根碱、阿玛碱、长春质碱、它波宁的含量确实 提高了【7 9 ，尽管结果还是不够稳定【8 0 1 。因此，高水平的异胡豆苷对于提高生物 碱含量还是起关键作用的，而异胡豆苷的积累依赖于s t r 的活性及向转基因细 胞系饲喂裂环马钱子的含量【7 9 】。w h i t m e r 等人研究表明长春花稳定的s t r 基因和 t d c 基因的转基因的细胞系经过长期培养以后，生物碱积累的相关酶的活性降低 【8 0 1 。原因可能是，在长期的培养中，生物碱本身或中间产物的毒性使细胞系的 筛选能力及繁殖能力降低。而有其他研究者也表明在生物碱合成关键酶转基因 研究中遇到了这样的问题【8 1 , 8 2 】。l i ，q i u r o n g 等人把t d c 定位在烟草的叶绿体 中进行过表达，结果检测到植株中的色胺的含量确实提高了，但是叶片出现了 坏死的现象 8 2 】。而a o y a g i 等人研究出一个避免了毒害而又提高了吲哚生物碱的 含量的方法，即用富含糖醛酸的藻酸盐制作了人工细胞壁来包裹长春花的原生 质体。用3 0 m m 的c a c l 2 处理原生质体，在1 5 天后，原生质体破壁并再生，把 生物碱释放到培养基中，结果提高了色胺、阿玛碱和长春质碱的含量【s 3 1 。 据报道，在转基因的研究中利用诱导性启动子可达到提高吲哚生物碱的目 的 3 0 】。h u g h e s 等人研究表明在长春花毛状根中，用肾上腺素诱导的启动子来促 进胁基因的表达，诱导后的毛状根所含的蛇根碱是诱导前的1 2 9 8 3 】。h o n g 等人通过拟南芥中反抑制的a s 的0 【亚基，a s 的p 亚基和t d c 在长春花毛状根 中的过表达中，利用了肾上腺素诱导的启动子，阿玛碱、它波宁及洛柯辛碱 ( 1 0 c h n e r i c i n e ) 的含量随着肾上腺素的作用浓度及时间的提高而提高幽】。 综上所述，过表达限速步骤的关键酶的基因在提高生物碱含量的研究中收 效是明显的。但是仍然存在一些问题，如产量的不稳定。而用诱导性启动子来 控制关键基因的表达，从而使转基因植物积累更多的吲哚生物碱也许是目前最 好的策略峭川。 1 5 2 长春花吲哚生物碱合成关键酶的转录因子基因工程的研究 信号转导途径控制着次生代谢的关键基因的表达。所以通过转录因子的遗 1 2 第一章引言 传操作可以促进或抑制次生代谢产物的合成。所以在长春花中利用转录因子的 遗传操作来提高吲哚生物碱是具有可行性的口。转录因子o r c a 可以与s t r 的 启动子结合，而且与茉莉酸诱导s t r 、t d c 的表达从而提高生物碱的含量有关 3 6 1 。在长春花的细胞系中过表达o r c a 3 可以提高a s a 、t d c 、c p r 、s t r 、d 4 h 的表 达，而且饲喂裂环马钱子下，与对照相比可以提高三倍的生物碱的含量【3 引。利 用转录因子进行遗传操作可以同时调节多个基因，从而解决了同时过表达多个 基因的困难。但是，存在的问题是转录因子调节的目标基因太多而造成效率降 低，所以通过转录因子的遗传操作来提高长春花吲哚生物碱含量的研究还将进 一步的深入。 h e i k o 等人用c d n a a f l p 对长春花转录组进行大规模全面、系统的分析。 目前，通过查找4 1 7 个基因标签的e x p r e s s i o np r o f i l e s 与1 7 8 个代谢途径的 a c c u m u l a t i o n p r o f i l e s 的相关性，从而绘制了基因一基因与基因一代谢物的网络 图。这些网络图表明不同的类萜吲哚生物碱的生物合成支路与不同的其他的代 谢途径受不同的激素调节。通过这些网络图我们可以挑选与类萜吲哚生物碱的 生物合成相关的基因和代谢物。这就为更好的理解长春花的次生代谢打下基础， 并且提高了重要药用植物的代谢物基因工程的应用潜力【8 6 | 。 1 5 3 长春花吲哚生物碱合成的基因工程中不同遗传转化方法的应用 1 5 3 1 根癌农杆菌 根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 的t i 质粒( t u m o r i n d u c t i o np l a s m i d ) 是 迄今为止少数能携带外源d n a 插入植物细胞染色体上的细菌质粒，在已获得的 近2 0 0 种转基因植物中约8 0 是由t i 质粒转化完成的。 在长春花中，c a n e l 等人首先用根癌农杆菌遗传转化的方法在长春花悬浮细 胞中过表达胁和s 7 9 】。而w h i t m e r 等人也同样利用根癌农杆菌侵染长春花幼 苗的叶片从而得到转基因的悬浮细胞而进行t d c 过表达的研究【8 0 1 。最近，一个被 称为三重转化系统的遗传转化方法成功的在长春花及其它九种植物中得到了应 用。用带有v i 佑突变基因( v i 们n 5 4 d ) 的三元载体转化根癌农杆菌( l b a 4 4 0 4 0 ) 后，将长春花的悬浮细胞与其共培养四天，发现转化效率有了明显的提甜3 6 】。 第一章引言 1 5 3 2 发根农杆菌 近来，