（动物学专业论文）贝类嗅觉基因的鉴定与同源性研究.pdf

摘要 摘要 嗅觉是动物对挥发性物质的感受过程。嗅质分子、嗅质结合蛋白以及嗅质受体是完 成嗅觉感受最初阶段的三个要素。嗅质分子般为小分子挥发性物质，需要先与嗅质结 合蛋白结合以助溶，再与受体结合，通过与其他视觉等类似的过程在嗅觉神经元中引起 电信号。该电信号传至中枢神经系统，产生嗅觉。嗅质受体编码基因数目庞大，其假基 因化程度与物种生存对嗅觉的依赖程度存在一定关系。 本实验以实验室培养的贝类模式动物m 玩a s p e r s a 成体为研究材料，应用s m a r t c d n al i b r a r yc o n s t r u c t i o n 技术，通过提取总r n a ，反转录合成c d n a ，l d p c r 扩增 c d n a ，筛选，插入片段至载体a , t r i p l e x 2 ，再经体外包装，构建了该模式动物的c d n a 文库，经平板培养及蓝白斑筛选检测，未扩增文库滴度达到1 2 2 x 1 0 6 p f u m l ，扩增文库 滴度达到5 6 1 0 9 p f u m l ，重组率达到9 6 4 3 以上，通过c d n a 文库，克隆，分离并 测序了与嗅质受体相关的基因，再与其他已知嗅质受体一起构建系统发育树，推测其嗅 觉基因在整个嗅觉基因演化过程中的进化方向与进化距离。 关键词嗅觉嗅质受体假基因化软体动物s m a r t 技术c d n a 文库 a b s t r a c t a b s t r a c t t h eo l f a c t i o ni st h ep r o c e s si nw h i c ha na n i m a lp e r c e i v e st h ev o l a t i l es u b s t a n c e s o d o r a n t , o d o r a n tb i n d i n gp r o t e i na n do d o r a n tr e c e p t o ra r ee s s e n t i a li nt h ei n i t i a l l yp r o c e s so ft h e s e n s a t i o n o d o r a n t ，u s u a l l yv o l a t i l e sw i t l ll o wm o l e c u l a rw e i g h t ，b i n d so d o r a n tb i n d i n g p r o t e i nb e f o r ec o m p l e xw i t hr e c e p t o r , t h e na r o u s e st h ee l e c t r o n i cs i g n a la si nt h ep r o c e s so f v i s i o n t h eo l f a c t i o ni sf o r m e da f t e rt h ee l e c t r o n i cs i g n a li st r a n s f e r r e dt ot h ec n s t h e m e m b e r so fo d o r a n tr e c e p t o r - c o d i n gg e n e sf o r mt h el a r g e s tg e n ef a m i l ya sk n o w n t h e a n i m a l ss u r v i v a lr e l i e sl e s so nt h eo l f a c t o r ya n da c c o r d i n g l yp s e u d o g e n i z a t i o ni n c r e a s e s ic o n s t r u c t e dae d n a l i b r a r yo f t h ed o m e s t i cs n a i lw i t hc l o n t e c hs m a r te d n a l i b r a r y c o n s t r u c t i o nk i t w i t ht h et o t a lr n ae x t r a c t e du s i n gt h ei n v i t r o g e nt r i z o l ，f i r s t - s t r a n de d n a s y n t h e s i z e d ，a n dw i t hf i r s t - s t r a n dc d n aa m p l i f i e dw i t hl o n gd i s t a n c ep o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( l d p c r ) ，t h ed se d n aw a sd i g e s t e db ys f iia n df r a c t i o n a t e db yc h r o m a s p i n - 4 0 0c o l u m n ，b e f o r el i g a t e dt ol t r i p l e x 2v e c t o ra n dp a c k a g e d t i t e r i n ga n db l u e w h i t e t e s t ss h o w e dt h et i t t e ro ft h eu n a m p l i f i e da n dt h ea m p l i f i e dw e r e1 2 2 10 0p f u m la n d5 6 10 yp f u m l ，r e s p e c t i v e l y t h er e c o m b i n a n tp e r c e n t a g er e a c h e d9 6 4 3 f r o mt h ee d n a l i b r a r yc o n s t r u c t e d ，ic l o n e dr a n d o m l ys e l e c t e dg e n e si nw h i c hs e v e r a lw e r et h o u g h tt ob e m o s th o m o l o g i c a l 、以t l lt h o s ec o n f i r m e do rp r e d i c t e do l f a c t o r yg e n e s t h e i rp o s s i b l ef u n c t i o n w a si n d i c a t e db yt h ew e l ln e s t i n gi n t h ee v o l u t i o n a r yp h y l o g r a m sw i t ho l f a c t o r yg e n e s t e r m i n a l sf r o mp l a n t s ，n e m a t o d e s ，i n s e c t s ，a n ds o m ev e r t e b r a t e s k e yw o r d s o d o r a n t o d o r a n tr e c e p t o r p s e u d o g e n e m o l l u s c as m a r te d n a l i b r a r y h 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名：j 晕上b 一 日期：名坦罕_ 年选月耻日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密母o ( 请在以上相应方格内打“) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为谳唉面硅囚西刁煳同灞j 垒并院 的学位论文，是我个人在导师( 昊娠) 指导并与导师合作下取得的研究成果， 研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：呈 捌l 日期：砰年卫妥月斗日 作者签名：j 绰毕l 一 导师签名：一一呈唉广一 日期：畔钆上月斗日 日期：衅年哆月珥一日 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 嗅觉基因的研究背景 嗅觉是化学感受( c h e m o s e n s a t i o n ) 的一个重要方面。化学感受的对象有挥发性的、 水溶性的化学物质。这样的化学物质包括气味分子( o d o r a n t 嗅质) 、性外激素和味质。 在气味感受过程( 见图1 ) ，疏水性的嗅质首先与嗅质结合蛋白( o d o r a n tb i n d i n gp r o t e i n s ， o b p s ) 结合，之后嗅质与嗅质受体( o d o r a n tr e c e p t o r s ，o r s ) 作用，后者为具有7 段c c 螺旋的跨膜蛋白质，并且在细胞质一侧与g 蛋白偶联，在细胞膜外侧与嗅质受体结合后， 内侧g 蛋白随后激活腺苷酸环化酶，促使环腺苷酸水平升高，打开环核苷酸门控离子通 道，无选择地通透阳离子，产生动作电位，该电信号沿神经通路传导至传导途径到达中 枢神经系统，引起对气味的感受。嗅觉为动物个体提供了一个通过挥发性物质分子与外 界环境( 同种的异性个体、其他动物个体以及非动物的生物或非生物对象) 之间建立联 系的途径，藉此完成交配、取食、避开天敌、定位、识别有毒物质等行为。 c l 。 图l 嗅觉感受神经元应答示意图( 脊椎动物一嗅毛) ( b a r r yw a c h e ，2 0 0 5 ) f i g 1t h eo d o r a n t s i g n a lt m n s d u c t i o ni nt h eo l f a c t o r yr e c e p t o ri i 吼l r o n 河北大学理学硕士学何沦文 1 1 1气味分子 气味分子的结构差别很大。实际上，任何分子量小于3 0 0 4 0 0 d a 的强挥发性物质都 可能是气味分子，而不管其结构或性质如何。哺乳动物的嗅质结合蛋白的发现始于配体 结合法。研究者在牛鼻腔嗅觉粘膜和其他哺乳动物检测到一种能够在低检测阈值下固 定吡嗪( 2 一异丁基一3 一甲氧基吡嗪，2 - i s o b u t y l 3 一m e t o x y p y r a z i n e ) 。几种常见的嗅质分子可 以用于嗅质结合蛋白与嗅质结合的特异性的研究，并将亲和常数与气味反应强度联系起 来。与牛嗅质结合蛋白( b o b p s ) 和猪嗅质结合蛋白( p o b p s ) 亲和力最高的嗅质分子， 解离常数在o 1 1 l x m ，包括杂环衍生物，如烷基取代的吡嗪、噻唑、帖类物质及其衍生 物。这样的嗅质有：薄荷醇、麝香草酚、分子量适中的脂肪醇和醛类等等。亲和力较差 的嗅质有：环状帖类物质( 如樟脑与其类似物) 和极性分子( 如短链脂肪酸) 。不同的 嗅质结合蛋白可选择性地结合并携带嗅质分子【l 】。 嗅质的分子结构及其与之相配的嗅质受体已经有许多报道，嗅质和受体种类繁多， o r 可以与能识别多种抗原分子的免疫球蛋白类比。耶鲁大学医学院的研究人员搜集了 嗅觉有关的嗅质受体和嗅质分子，并放到在线数据库方便研究者使用 ( h t t p ：s e n s e l a b m e d y a l e e d u ) ，分为“o r d b ”( o r 数据库) 、“o d o r d b ”( 嗅质数据库) 和“o d o r m a p d b ”( 嗅质图数据库) 。其中，在“o d o r d b ”汇集了2 1 2 种嗅质的结构，通过 网络界面也可以检索得到其中的4 5 种嗅质所能结合的嗅质受体的氨基酸序列和编码基 因序列( g e n b a n k 收录号及文献) 。 1 1 2 嗅质结合蛋白 昆虫的嗅感器( o l f a c t o r ys e n s i l l u m ) 的典型特征是一个或几个感觉神经元的树突浸 没于感受器的淋巴液中，淋巴液充塞于表皮层壁之内的空间。这部分淋巴液与血淋巴分 离，化学组成也与之相异。昆虫嗅质与性外激素需要穿过感觉器的淋巴液才能达到神经 元质膜，与定位于质膜的受体结合。脊椎动物的稠密的嗅觉粘液与淋巴液对应。无论是 脊椎还是无脊椎动物，都有高浓度的可溶性低分子量蛋白存在，此即嗅质结合蛋白。昆 虫的嗅质结合蛋白又分为性外激素结合蛋白p b p s ( p h e r o m o n e - b i n d i n gp r o t e i n s ) 和一般 嗅质结合蛋白g o b p s ( g e n e r a lo d o r a n t - b i n d i n gp r o t e i n s ) 。p b p s 可以特异地结合昆虫性外 激素，灵敏度高，g o b p s 能够更广泛的结合嗅质分子，如特异性较低的植物挥发物。 昆虫的第一个嗅质结合蛋白是利用放射性标记的性外激素【( e ，z ) 6 ，1 1 一h e x a d e c a d i e n y l 第1 章绪论 a c e t a t e 作为探针，进行配体结合实验，从多音天蛾( a n t h e r a e ap o l y p h e m u s ) 触角的粗 提液分离得到的。通过同样的方法，从脊椎动物的鼻腔粘膜中分离得到嗅质结合蛋白。 用放射性标记的吡嗪已经验证了与嗅质结合蛋白的结合特性1 2 。 脊椎动物的嗅质结合蛋白属于脂笼蛋白( 1 i p o c a l i n ) 超家族，尽管在氨基酸序列上 相似度较低，但是在高级结构上都具有一个由8 段p 折叠形成的桶状结构组成的非极性 空腔- - 笼”，该结构可以与疏水分子结合。大鼠的嗅质结合蛋白结合特性研究表明，三 类嗅质结合蛋白可分别与不同的化学嗅质分子结合，说明嗅质结合蛋白或许在嗅质分子 识别过程也发挥一定作用。 牛嗅质结合蛋白是一种二聚体脂笼蛋白，在呼吸与嗅觉的鼻腔粘膜中大量存在。质 谱、1 8 a 分辨率x 射线晶体成像和荧光技术揭示，天然存在的牛嗅质结合蛋白结合有 1 辛烯一3 一醇的外消旋物。这种挥发性物质是牛呼出气体的一种典型成分，也是人及其他 动物身体散发的一种常见物质。1 辛烯3 醇同时也可作为极强的气味诱捕剂用于捕杀某 些昆虫，例如按蚊( a n o p h e l e sp l a s m o d i u m ) 和采采蝇( g l o s s i n at r y p a n o s o m a ) 。寄生性 昆虫通过辛烯醇定位反刍类动物，而反刍类动物可以借助于牛嗅质结合蛋白结合并清除 部分通过呼吸道上皮的辛烯醇来减少所吸引的昆虫的数量。猪嗅质结合蛋白的结构的研 究显示，配体需要是高度疏水的1 6 0 2 0 0 d a 的分子结合于桶状空腔【3 l 。 1 1 3 嗅质受体的编码基因及蛋白质结构 嗅质受体属于数目庞大的g 蛋白偶联受体( g p r o t o n c o u p l e dr e c e p t o r ，g p c r ) 家 族。哺乳动物的嗅质受体定位于鼻腔上皮细胞长有纤毛的嗅觉感受神经元。嗅质受体编 码基因为种类多样的多基因家族，脊椎动物中，圆口纲、硬骨鱼类、两栖类、鸟类、哺 乳类、果蝇和线虫的嗅质受体编码基因已经被克隆。可能不同动物的嗅质受体由g 蛋白 偶联受体独立演化出现【4 1 。 脊椎动物的嗅质受体分子种类的多寡决定其对嗅质的识别能力。嗅质受体分子为具 有7 段跨膜0 【螺旋( 7 t m ) 的g 蛋白偶联受体，跨膜q 一螺旋段之间由环所打断，三段 环位于质膜内侧，三段环位于质膜外侧。第二和第六段跨膜段之间形成嗅质分子结合“口 袋”，但是不同的嗅质受体序列同源性很低。哺乳动物的嗅质受体序列之间的序列的一 致性在4 5 8 0 之间。通常情况下，嗅质受体氨基酸序列达8 0 一致性则被归为一个亚 家族。 河北人学理学硕十侮论文 陆生脊椎动物嗅质受体编码基因数目众多。脊椎动物大约有1 0 0 0 个嗅质受体，能 识别多达1 1 1 种配体，嗅质受体基因家族是仅次于免疫系统编码基因的第二大家族，但 是嗅质受体基因存在程度不同的假基因化，造成不能表达。据估计，在大鼠基因组中有 5 0 0 1 0 0 0 个有功能的编码基因，鱼类可能只有1 0 0 个基因为有功能嗅质受体编码基因【5 1 。 哺乳动物嗅觉感受由解剖上和功能上不同的两部分来进行。主要嗅觉上皮细胞 ( m a i no l f a c t o r ye p i t h e l i u m ，m o e ) 和犁鼻器( v o m e r o n a s a lo r g a n ，v n o ) 。性外激素激发 犁鼻器并引发一系列特征性的先天生殖与社会行为，并引起神经内分泌反应【6 l 。 电生理记录表明，单个嗅质受体神经元( o r d o rr e c e p t o rn e u r o n ，o r n ) 可以对3 1 0 种嗅质分子做出响应。虽然每种嗅质受体神经元只能表达一种嗅质受体，但是嗅质受体 的结合嗅质特异性却非一对一关系，如同脊椎动物血液中的抗体。对于一种抗原分子， 可以有多种抗体识别抗原分子不同的抗原表位( e p i t o p e ) 。同理，或许能被一种嗅质受 体识别的嗅质是化学结构上具有某种共同特征化合物。由于嗅质受体编码基因在异源表 达上有困难，人们对嗅质受体的了解不够深入。h e i n zb r e e r 等人借助于杆状病毒载体在 s f 9 细胞中表达了一有功能的嗅质受体【5 1 ，但是，通过测量第二信使的合成情况，发现 表达产物的对嗅质铃兰醛( 1 i l l i a l ) 和新铃兰醛( 1 y r a l ) 响应较轻微，且在低浓度下即饱 和，因此此表达系统可能并不可靠，将已克隆的嗅质受体与嗅质配体配对难度则更大。 通过筛选线虫化学感受突变体，得到引诱剂双乙酰感受缺陷品系。线虫双乙酰化学 信号过程需要成对的两套化学感受神经元来进行，即a w a 细胞。线虫与脊椎动物不同， 每个嗅觉细胞表达几种受体，可以对多种嗅质做出响应。例如，a w a 神经元还可以感 知吡嗪和噻唑化合物。一株双乙酰感受虫体为单基因突变所致( o d r - 1 0 ) ，定位于x 染 色体。o d r - 1 0 编码一个3 3 9 氨基酸残基的蛋白质。 对o d r - l o 进行疏水残基分布分析，预测具有7 段跨膜区段，应该为一个g 蛋白偶 联受体。秀丽线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 的o d r - l o 与脊椎动物的嗅质受体只有很低 的序列一致性。预测的第三个胞内环比哺乳动物嗅质受体对应环( 17 个氨基酸残基) 长 一倍，此环状结构正是g 蛋白偶联时的作用部位。多数g 蛋白偶联受体( 包括哺乳动 物嗅质受体) 不含内含子，而o d r - 1 0 具有内含子序列。可能会与线虫嗅质受体编码基 因的表达调控以及变位拼接造成额外的嗅质受体有关。突变的o d 卜1 0 仅在第三跨膜段 t y r 替换为h i s ，引起完全不能感受双乙酰，而对吡嗪和噻唑的感受不受影响。如果将携 带正常o d r - 1 0 基因的粘粒载体注射进突变体，表型可以被恢复；而正常线虫如果删除 一4 第1 章绪论 o d r - 1 0 即会出现双乙酰不敏感表型。该基因的表达被定位于a w a 细胞的感觉纤毛上。 如果将o d r - l o 置于o d r - 3 启动子的驱动之下，o d r - 1 0 会在a 、张和a w c 神经元( 原来 对双乙酰不敏感) 中表达，说明o d r - 1 0 可以赋予a w c 神经元新的化学感受敏感性【7 1 。 果蝇也存在每个嗅质受体神经元表达两种嗅质受体分子的情况。果蝇的全部嗅觉器 官作了受体神经元图，发现某类神经元上表达了两个有功能受体。果蝇具有两对嗅觉 器官：触角和小颚须，其表面覆盖有嗅器，小颚须有6 0 条。通过生理手段分析果蝇对 嗅质响应揭示，6 0 个小颚须感器可以分为三类：p b l 、p b 2 和p b 3 。每种感器具有两个 神经元：p b l 感器具有p b l a 和p b l b 神经元，p b 2 具有p b 2 a 和p b 2 b ；p b 3 具有p b 3 a 和p b 3 b 神经元。上述6 种嗅质受体神经元都表现出不同的嗅质敏感性。嗅质受体神经 元将轴突投射向脑触角叶( a n t e n n a ll o b eo f t h eb r a i n ) ，在此处终止于椭球状单元：小球 ( g l o m e r u l i ) 。小颚须的简单性使之适合于完整的受体基因的分子细胞分析【8 【9 】。 嗅觉器官的嗅质受体基因被发现不久，人们就发现有些嗅质受体基因主要或者只在 哺乳动物精子细胞鞭毛的中段表达。人们认为精子的化学受体可能与精子成熟和趋化性 ( c h e m o t a x i s ) 有关，例如有可能在此作用下，精子循着由卵子或雌性生殖道分泌的引 诱剂的浓度梯度游向卵子以进行受精作用。例如h o r l 7 - 4 就是这样的嗅质受体基因，可 被铃兰花香中的组分波洁洪醛( b o u r g e o n a l ) 在极低的浓度( - l o 娟m ) 下激发，引起胞内 c a 2 + 浓度升高。小鼠也有一个类似的基因m o r 2 3 。 1 1 4 嗅质受体的进化 1 9 9 1 年，l i n d ab u c k 和r i c h a r d a x d 首先在大鼠中获得嗅质受体家族基因。这项奠 基性的工作打开了嗅觉机理研究的大门。因此上述二人获得了2 0 0 4 年度诺贝尔生理或 医学奖。近十几年来，在多个物种中发现嗅质受体基因，更由于基因组计划的开展使人 们有可能鉴定出一些物种的全部嗅质受体基因并探讨其进化关系( 见图2 ) 。 人基因组中有大约1 0 0 0 嗅质受体基因，分散存在于5 0 个染色体位点，并且组织成 基因簇。大约6 5 的基因发生了有害突变( 失去功能) ，即发生假基因化 ( p s e u d o g e n i z a t i o n ) ，导致只有大约3 0 0 - - 3 5 0 个基因有功能。嗅质受体基因以两种类存在： 类型i ( 和鱼类与水溶性嗅质结合受体相对应) 和类型i i ( 能和挥发性嗅质结合) 。实际 上，人类基因组的测序表明，全部嗅质受体基因起源于位于1 1 号染色体的类型i 嗅质 受体基因簇。该簇基因首先复制到1 1 号染色体的另一个位置，随后演化出位于1 号染 河北人学理学硕十学位论文 色体的类型l i 基因簇。在这个新的位置，嗅质受体基因通过多轮复制在整个基因组内扩 增形成了今天的嗅质受体基因库( o rr e p e r t o i r e ) 。 憾e 立矗釜釜三三主量王量曼强翌釜蕊妻羔 _ = 蕊趁匕z 图2 嗅质受体基因进化动态示意图( 绿色表示正常无损的基因；红色表示假基冈；箭头方向表 示基因转录方向) ( b a r r yw a c h e ，2 0 0 5 ) f i 9 2c h e m o s e n s o r yr e c e p t o rg e n ef a m i l i e sa r ee v o l v i n gd y n a m i c a l l y a ：基因在三个物种间是一到一的垂直同源，其功能可能相同； b ：一个物种的一个基因可能在其他物种中有多个等价基因，复制后序列的改变可能让新的拷贝 具有识别新嗅质的能力； c ：基因经过失活突变，成为假基因； d ：一个物种的一个或多个基因，在另一物种中缺失。 也许人嗅质受体基因的大量假基因化与灵长目动物的人化过程( h o m i n i z a t i o n ) 有关。 比如，新世界猴的假基因化水平仅与小鼠相当，但是旧世界猴假基因化达到大约3 0 ， 猿类嗅质受体假基因化水平更高( 一4 5 ) ，最终人类达到最高的假基因化水平( 一6 5 ) ， 表现出假基因化加速的特征。但是新世界猴中的吼猴与旧世界猴具有相当的假基因，有 意思的是同时它也是新世界猴中唯一具有与旧世界猴一样的三色视力的种。对猿类和恒 河短尾猴的5 0 个嗅质受体的垂直同源基因的分析表明，人嗅质受体基因积累的不利突 变使之假基因速率比其他灵长类快四倍，使假基因数量是其他灵长类的两倍，这可能与 人类的生存对嗅觉的依赖大大低于其他灵长类所致。 小鼠的生存对气味的依赖远大于人，小鼠属于嗅觉敏感动物。嗅质受体基因的组织 形式与人相仿。基因组内各个基因簇水平同源，应为复制进化而来。小鼠基因组中有1 5 0 0 个嗅质受体基因( 人只有近1 0 0 0 个) ，只有2 0 假基因化，因此小鼠有功能的嗅质受体 基因为人的3 倍。 第1 章绪论 狗的不同品种由一个共同祖先经驯化和选育分化而来( 大约发生于1 万一1 万5 千年 前) 。狗嗅觉高度灵敏，可被训练用于许多搜寻场合。狗和小鼠为什么比人嗅觉灵敏尚 未最后定论，但有几点有助于帮助我们理解狗的嗅觉上皮细胞面积比人的大( 大约为 人的2 0 倍) ，因此嗅觉神经元的数目与密度皆较人多；参与嗅觉功能的脑组织( 如嗅 球) 较大；有功能的嗅质受体数目多。基因组搜索表明，犬类嗅质受体基因库包括1 3 0 0 个成员，在基因组的组织形式与人及小鼠类似，只有1 2 1 8 的为假基因。可以分为3 0 0 个亚类，因此数目尽管少于小鼠，但多态性更高。或许人类长期对狗的选育( 包括对嗅 觉特征的选育) 是造成基因高多态性的一个主要原因【1 0 l 。 表1 部分嗅质受体基因族中基因与假基因的数量( b a r r yw a c h e ，2 0 0 5 ) t a b l e ln u m b e ro f g e n e sa n dp s e u d o g e n e si ns e l e c t e do d o r a n tr e c e p t o rg e n ef a m i l i e s 幸线虫的大部分化学感受g p c r 被认为是嗅、味觉的联合受体，在更高级的生物中，这两种感觉 7 河北大学理9 硕 ：学位论文 受体是分离的，但在简单生命体中是很难分开的o 1 1 5g 蛋白 典型的g 蛋白是由三个不同的亚基组成：0 【( 4 5 4 7 k d ) 、1 3 ( 3 5 k d ) 和丫( 7 9 k d ) 。 a 亚基可以与g t p 或g d p 结合，具有g t p a s e 活性，完整的g 蛋白在核苷酸部位结合 g d p 时处于失活状态。当g 蛋白与配体结合后使a 亚基上的g d p 迅速交换为g t p ，而 与g t p 结合后，使g a 与g p 丫解离，前者与效应分子结合( 如嗅觉感受中为腺苷酸环 化酶) ，并激活效应分子，促使合成第二信使( 如c a m p ) ；g a 本身所具有的g t p a s e 水 解活性最终使g t p 水解成g d p ，从效应分子上解离之后与g 所结合成失活状态。 1 1 6 神经中枢的嗅觉过程 1 1 6 1 化学感受器的结构 脊椎动物中，硬骨鱼的化学感受系统要比高等脊椎动物( 如哺乳动物) 简单。鱼类 的嗅质通过水传播，而非空气。同一种化学刺激常常既可被“嗅”到，也可被“尝”到。嗅 觉系统附件，如梨鼻器和辅嗅球( a c c e s s o r y o l f a c t o r y b u l b ) ，并不存在于鱼类，首先出现 于四足动物。嗅觉上皮细胞也不如哺乳动物分层程度高。上皮细胞包括至少两类嗅质受 体神经元：有纤毛和微绒毛神经元，可能对不同类别的嗅质分子做出响应。嗅质受体神 经元集束成一或二束神经束，哺乳动物则集成大量嗅觉纤维。嗅球分层不明显，但仍能 区分出嗅觉神经层、小球层、僧帽丛蔟( t u f t e d ) 细胞层以及包含颗粒神经元核心区。 小球层不能不能被n i s s l 染色法( n i s s ls t a i n i n g ) 所显示，但能通过标记传入神经元轴突 的末端分支发现。而且，并非所有嗅质受体神经元组织在小球中。一部分轴突终止于非 小球丛( a g l o m e r u l a rp l e x u s ) ，该丛包含较小未良好分离的末端特化结构。不存在介导短 程侧抑制( s h o r tr a n g el a t e r a li n h i b i t i o n ) 的外小球神经元( p e r i g l o m e r u l a rn e u r o n s ) 。象所 有脊椎动物一样( 哺乳动物除外) ，僧帽( m i t m l ) 细胞的初级树突与几个小球相连，次 级树突缺失【2 2 】【2 3 1 。 黑腹果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 具有两个嗅觉器官：触角和小颚须， 其中各 有约1 2 0 0 和1 2 0 个嗅质受体神经元。嗅质受体神经元形成感器区室，又分为形态上 不同的三种主要类型：锥形、腔锥状以及毛状。每个感器大多具有4 个嗅质受体神经元 的树突【2 4 】。 第1 章绪论 1 1 6 2 嗅质编码( o d o rc o d i n g ) 嗅质信息首先被嗅质受体神经元捕获。嗅质受体神经元随后做出一些列响应，如产 生动作电位，该电位反应信号的性质、强度以及刺激的时间结构。嗅质受体神经元的动 作电位激发大脑中的二级神经元。无论是哺乳动物还是昆虫，不同的嗅质受体表达于 不同嗅质受体神经元。按照果蝇嗅质响应谱( o d o rr e s p o n s es p e c t r u m ) ，果蝇嗅质受体 神经元可以被分成几个子类。通过广泛的电生理实验，从锥形感器鉴定出1 8 个功能类 型的嗅质受体神经元，在8 种类型的感受器中它们以固定组合出现。上述嗅质受体神经 元对嗅质表现出多种响应：不但它们的嗅质响应谱各异，而且它们可起激活或者抑制作 用，其响应动态也不一样【2 5 】。 在中枢神经系统，局部解剖组织特征非常常见，如果需要维持长期记忆，要求这种 组织形式稳定。嗅觉神经元自身未被系统地按嗅质分子的特异性进行组织。在某种程度 上，对某种分子的识别是通过：每个嗅觉神经元只表达一种类型的嗅质受体。嗅质受体 基因的表达本来就存在等位基因失活调控，某顺式作用元件指导许多连锁嗅质受体编码 基因中任一个表达。嗅质受体神经元局部解剖作图表明，表达同一种嗅质受体的神经元 轴突投射于嗅球的同一个部位。因此，表达同一种受体的神经元汇聚于一个嗅小球处。 这种空间的组织形式为两侧对称。但是嗅觉神经元处于动态更新之中，与上述发现矛盾。 嗅觉神经元的不断再生的特征使上述空间组织形式难以稳定，因此给嗅觉的长时记忆带 来困难。因为，嗅质受体的表达是随机的，如何保证处于一个嗅小球的神经元表达一样 的嗅质受体? 或者，是不是表达了不同的嗅质受体后，会重新导向其他嗅小球? 或者， 嗅觉投射是否也像视觉感知那样为硬连接( h a r d w i r i n g ) 呢? 嗅质受体和嗅球的局部组织解剖及追踪技术研究表明，不同的嗅觉上皮区域与嗅球 局部具不同解剖学特征的区域相联系。2 脱氧葡萄糖( 2 d g ) 摄取或c f o s 表达法分析 表明，嗅球中的嗅觉活动发生于嗅小球内的离散区域1 2 6 1 。 1 2 贝类嗅觉基因的研究背景 相比较于其他无脊椎动物和脊椎动物，软体动物的嗅觉系统很少被研究。仅描述过 陆生贝类的嗅觉系统的形态结构【2 7 1 ，至今，嗅觉系统的神经网络和分子组成研究仍然比 较少( j 釜2 0 0 4 年止未见研鳅2 8 1 ) 。 陆生贝类中也有嗅质结合蛋白【2 8 】，但陆生贝类嗅觉感受神经元( o l f a c t o r ys e n s o r y 河北大学理学硕十学f _ 7 ：论文 n e u r o n ， o s n ) 中表达的蛋白质，与脊椎动物的嗅觉标记蛋白质( o l f a c t o r ym a r k e r p r o t e i n s ，o m p s ) 共有许多鲜明的特征。与脊椎动物的嗅觉标记蛋白质一样，它缺少内 含子，其全部序列相当于开放阅读框【2 9 1 ，这是在其他嗅觉感受蛋白质( 如嗅质受体和 嗅质结合蛋白) 中都具有的一个相同的特征。事实上，这有可能是化学感受蛋白质的一 个特有特征，表明可能存在一种共同的祖先蛋白质。陆生贝类的类嗅觉标记蛋白质蛋白 质包含1 5 5 个氨基酸，而脊椎动物嗅觉标记蛋白质蛋白质的大小从1 5 5 个氨基酸( 鱼) 到 1 6 3 个氨基酸( 哺乳动物) 2 8 】。 陆生贝类的类嗅觉标记蛋白质蛋白质仅在嗅觉感受神经元中表达，而在其他组织中 未表达，这种陆生贝类蛋白质的特异性与选择性也正是嗅觉标记蛋白质的两大特征，我们 据此认为，陆生贝类中类嗅觉标记蛋白质蛋白的存在，证明在不同种类不同进化历史中， 该蛋白的系统发生与功能是非常保守的【2 引。 第2 章实验设各与材料 第2 章实验设备与试剂 2 1设备 h h 2 型数显恒温水浴锅( 金坛市华峰仪器厂) ；4 5 0 d 人工气候箱( 宁波赛福科学 仪器公司) ；t g l 1 6 b 型台式离心机( 上海安厅科学仪器厂) ；1 0 1 a 1 b 型电热恒温 鼓风干燥箱( 上海安亭实验设备有限公司) ；m g 2 5 + 型基因扩增仪( 杭州郎基科学仪器 有限公司) ；b s l1 0 s 型分析天平( 北京赛多利斯仪器系统有限公司) ；d y y - 5 型稳压稳 流电泳仪( 北京市六一仪器厂) ；3 1 a 型电泳槽( 北京市六一仪器厂) ；y x q s g 4 1 2 8 0 型手提式压力蒸汽灭菌器( 上海华线医用核子有限公司) ；k j 2 5 b c 型机器烧烤微波 炉；7 8 1 a 型磁力加热搅拌器( 杭州仪表电机厂) ；b d b c 2 5 8 h 型电冰柜( 星星集团 有限公司) ；0 5 1 a l 、l o t l 、2 0 1 a l 、1 0 0 i t l 、2 0 0 1 l l 、1 0 0 0 _ t l 取液器( e p p e n d o r f ) 。 2 2 试剂 s m a r tc d n al i b r a r yc o n s t r u c t i o nk i t ( c l o n t e c h ) ，p a c k a g e n el a m b d ad n a p a c k a g i n gs y s t e m ( p r o m e g a ) ，e xt a q ( t a k a r a ) ，m a r kl a m b d ad n a e c 0 9 11a n d10 0 b p d n al a d d e rp l u s ( f e r m e n t a s ) e n z y m ee c o ria n dh i n di i i ( f e r m e n t a s ) ，浓盐酸( h c l ) ( 中国医药公司北京采购站) ；蔗糖：天津市华东试剂厂；氯仿( c h c l 3 ) ：天津市四通化 工厂；乙二胺四乙酸二钠盐( e d t a ) 国产分析纯；氯化钠( n a c l ) ：天津市华东试剂厂； 乙酸：北京市华新试剂厂；矿物油( m i n e r a lo i l ) ：上海生物工程有限公司；苯酚：天津 灏洋生物制品科技有限责任公司；琼脂糖：上海生物工程有限公司；溴化乙锭( e b ) ： 北京北方伟业发展有限公司；无水乙醇及冰醋酸：国产分析纯；t r i z o l ( i n v i t r o g e n ) ，2 0 m m e d t a ，t a e 电泳液( 5 0 贮存液，使用国产药品自配) 。 河北大学理学硕十学位论文 第3 章研究方案 3 1材料 本实验计划s m a r t 技术建立贝类嗅觉相关基因的文库，所取实验材料为贝类散大 蜗牛胁溉a s p e r s a 成体的触角。 3 2c d n a 文库构建方法 3 2 1总r n a 的提取 l ，切取贝类触角约o 1g ，迅速置于装有0 4m lt r i z o l 的匀浆器中，充分研磨，将 匀浆液移至无r n a 酶的离心管中，再用o 3m lt r i z o l 冲洗匀浆器，也将洗液移至同一 离心管中； 2 ，将离心管在室温下放置5m i n ，然后在4 下，1 0 ，0 0 0 g 离心1 0m i n ，取上清 至新的离心管中； 3 ，加o 5m l 氯仿，手动混匀，在室温下放置3m i n 后，4 ，1 2 ，0 0 0 g ，离心1 5m i n ， 取上清至新离心管中； 4 ，再加0 5m l t r i z o l 后，重复步骤2 ； 5 ，然后，重复步骤3 两次； 6 ，加o 5m l 异丙醇，混匀，在室温下放置1 0m i n ； 7 ，在4 下，1 0 ，0 0 0 g 离心1 0 m i n ，弃上清，留沉淀； 8 ，加1m l7 5 乙醇洗沉淀，然后7 ，2 0 0 g 离心5m i n ，弃上清； 9 ，气干沉淀，加5 0 此超纯水溶解沉淀。 3 2 2 第一链c d n a 的合成 1 ，按照c d n al i b r a r yc o n s t r u c t i o nk i t 的指导步骤， 在o 5m l 新灭菌离心管添加下列试剂： 3i t lr n a ， 1 l x ls m a r t i vo l i g o n u c l e o t i d e ， 1l x lc d si i i 3 p c rp r i m e r ， 离心管中共计5 “l 反应体系； 第3 章研究方案 2 ，将溶液充分混匀后，离心2s ， 3 ，再将反应体系置于7 2 水浴锅中，孵育2r a i n ； 4 ，再将离心管置于冰上冷却2r a i n ； 5 ，短暂离心溶液，将试剂集中于离心管底部， 再加入： 2 斗l 5 f i r s t - s t a n db u f f e r ， l 肛ld t t ( 2 0m m ) ， 1 “ld n t p ( 1 0 r a m ) ， 1 肛lm m l vr e v e r s et r a n s e r i p t a s e ， 此时，反应体系共计1 0 “l ； 6 ，离心5s 后，置反应体系于4 2 水浴1h ，逆转录合成e d n a 第一链； 7 ，置于冰上终止反应，2 0 存放合成的单链e d n a 。 3 2 3 第二链c d n a 的合成 本实验采用l d p c r 法，使用t a k a r ae xt a q ，按试剂盒提供的步骤合成双链 c d n a 。 1 ，在一个无菌的离心管中加入以下试剂： 2 此单链e d n a ， 7 5 此纯水， 1 0 “l1 0 p c r b u f f e r ， 8p ld n t pm i x ， 2 “l 5 7 p c rp r i m e r ， 2 | i l c d si i i 3 p c rp r i m e r ， 1l a le x t a q ， 共1 0 0 此反应体系； 2 ，轻轻地混匀，并短暂离心溶液； 3 ，预热p c r 仪至9 5 p c r 循环条件为： 9 5 1m i n 一1 3 河北大学理学硕十学佗论文 再9 5 2 0s ， 6 8 8m i n ，共3 0 个循环， 4 ，p c r 结束后，取5 斗l 反应产物，用1 1 琼脂糖凝胶电泳检测双链c d n a 质量； 5 ，p c r 产物置于2 0 冰箱中冻存备用。 3 2 4c d n a 包装前的处理 首先用蛋白酶k 进行消化，操作如下： 1 ，在o 5m l 无菌离心管中加入 5 0p ld se d n a ， 2 “l 蛋白酶k ( 2 0p p l ) ， 混匀，离心溶液； 2 ，4 5 水浴2 0m i n 后，再加5 0p l 去离子水； 3 ，加1 0 0 此苯酚：氯仿：异戊醇溶液( , 2 5 ：2 4 ：1 ，v ) ， 转速离心5m i n ，取上清至新的无菌0 5m l 离心管中； 4 ，重复步骤3 ； 5 ，加2 6 0 “l 室温放置的9 5 乙醇， 1 0 l3 m 醋酸钠， 1 3p l 糖原( 2 0 p g “l ) ， 然后混匀溶液； 6 ，再以1 4 ，0 0 0r p m 的转速离心2 0 m i r a 7 ，小心去除上清水相，加7 9 “l 去离子水重新溶解沉淀， 供下一步反应。 将上步所得溶液再用s 6i 酶过夜处理， l ，在0 5m l 无菌离心管中加入： 7 9 “l d se d n a ， 1 0 止 1 0 s f iib u f f e r ， 1 0 儿 s f iie n z y m e ， 1g l 1 0 0 b