（微生物学专业论文）微生物发酵制氢系统的研究.pdf

厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。 本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明 确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：奄以杯 铂叼年6 月歹日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 保密() ，在年解密后使用本授权书。 不保密( ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名 导师签名 期：刎年 期：溯年 6 只孓e t 名月y - 日 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 摘要 利用微生物以自然界中极为丰富的纤维素类秸秆为底物进行生物制氢，对 开发新能源、降低环境污染、实现经济的可持续发展战略有重要意义。 以产酸克雷伯氏菌( k l e b s i e l l ao x y t o c a ) h p l 为产氢菌株，以稻草粉为产氢 底物，进行同步糖化发酵( s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n ， s s f ) 产氢。对影响同步糖化发酵产氢的单因子进行试验，选取对产氢影响较大 的因子：温度、p h 、纤维素酶用量进行l 。( 3 3 ) 正交试验。结果表明同步糖化发酵 产氢的最佳条件为：温度4 0 ，p h6 5 ，纤维素酶用量为2 0f p a u g 稻草粉， 摇床转速1 0 0r m i n ，发酵时间4 2h 。在该条件下的最大氢产量为1 1 0 6m l g 稻草粉。进行了1 0l 放大发酵产氢试验，最大氢产量为1 2 2 3m l g 稻草粉。 与分步糖化发酵( s e p a r a t eh y d r o l y s i sa n df e r m e n t a t i o n ，s h f ) 产氢相比，氢产量 提高3 4 4 。研究表明利用同步糖化发酵工艺可提高生物制氢的产量。 对产酸克雷伯氏菌( k l e b s i e l l ao x y t o c a ) h p l 和荚膜红假单胞菌 ( r h o d o p s e u d o m o n ac a p s u l a t a ) c n l 混合发酵产氢进行了研究。实验对影响混合发 酵产氢的因素进行了研究，结果表明：混合发酵最适光照强度为4 0 0 0l u x ，荚 膜红假单胞菌( r h o d o p s e u d o m o n ac a p s u l a t a ) c n l 最佳接种量为2 0 ，最适起始 p h 为7 5 ，最适氮源为蛋白胨( 3g l ) ，谷氨酸钠次之。加入氨盐会抑制放氢， 但可以缩短光合产氢的停滞期。产氢实验须在厌氧条件下进行，即使浓度为3 的氧浓度也会影响放氢。在最适条件下，混合发酵氢产率为4 0m o lh 。m o l ( c h ：0 ) 。，氢转化率为6 6 7 。 以同步糖化发酵制氢的废液为底物进行混合发酵制氢。同步糖化发酵制氢的 废液中含有机酸类( 丁酸2 5 5g l ，乙酸0 5 1g l ) 和残余糖类( 3 1g l ) 可 以被荚膜红假单胞菌( r h o d o p s e u d o m o n ac a p s u l a t a ) c n l 和产酸克雷伯氏菌 ( k l e b s i e l l ao x y t o c a ) h p l 利用。氢产量为9 2 0 m l h ：l 培养基( 同步糖化发酵 制氢的废液) 。因此，以稻草粉为底物，经过同步糖化发酵制氢和混合发酵制氢 后稻草粉的最终产氢率为1 4 0 7m l h ：g 稻草粉。 生物质发酵制氢废水含有大量的产酸克雷伯氏菌( k l e b s i e l l ao x y t o c a ) h p l 和 荚膜红假单胞菌( r h o d o p s e u d o m o n ac a p s u l a t a ) c n l 菌体。实验对壳聚糖作为絮凝 剂处理发酵制氢废水以进行菌体蛋白的收集和废水处理进行了研究，考察了p h 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 值、壳聚糖用量和絮凝温度等对絮凝效果的影响，结果显示：在p h 4 5 ，壳聚糖 用量6 0m g l ，絮凝温度4 0 时，除菌率和c o d 去除率分别达到9 2 1 ，4 0 ， 并改善了过滤效果，在与絮凝剂1 3 0 的复合絮凝试验，除菌率可以达到9 4 1 。 关键词：同步糖化发酵；混合发酵；生物制氢；壳聚糖 2 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 a b s t r a c t b i o m a s sc a nb ed e g r a d e db ym i c r o b ei n t os u g a rw h i c hc a ns u b s e q u e n t l yb e c o n v e r t e di n t oe n e r g ys o u r c es u c ha sh y d r o g e n s u c hap r o c e s si ss i g n i f i c a n tw h e n a p p l i e dt op u to f fe n e r g ys o u r c ec r i s i s ，d e b a t ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o na n d r e a l i z et h e s t r a t e g yo fs u s t a i n a b l ee c o n o m y h y d r o g e np r o d u c t i o nf r o mr i c es t r a wb ys i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n d f e r m e n t a t i o n ( ss f ) w a ss t u d i e du s i n gt h ek l e b s i e l l ao x y t o c ah p 1i nt h i sr e p o r t t h e e x p e r i m e n t so fb a t c hf e r m e n th y d r o g e np r o d u c t i o nw e r ec a r r i e do u ti n6 0 0 一m ls e r u m b o t t l e s s i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s f o rh y d r o g e np r o d u c t i o nw e r e ：p h 6 5 ，f e r m e n tt e m p e r a t u r e4 0 c ，c e l l u l o s ed o s e2 0 f p a u gr i c es t r a w ，s h a k er a t e10 0 r m i na n df e r m e n tt i m e4 2h t h em a x i m u mh 2 p r o d u c t i o n ( 110 6m l gr i c es t r a w ) w a so b t a i n e du n d e rt h ea b o v ec o n d i t i o n s t h e e n l a r g ee x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e d o u ti na10 - lb i o r e a c t o r ，am a x i m u mh 2 p r o d u c t i o no f12 2 3m l gr i c es t r a ww a sa c h i e v e d t h eh 2p r o d u c t i o ni n c r e a s e db y 3 4 4 c o m p a r e dw i t ht h es e p a r a t e dh y d r o l y s i sa n df e r m e n t a t i o nh y d r o g e np r o d u c t i o n t h i sr e s e a r c hi n d i c a t e dap e r f e c ta p p l i c a t i o no fss fi nb i o h y d r o g e np r o d u c t i o nf r o m c e l l u l o s em a t e r i a l h y d r o g e np r o d u c t i o nb yam i x e dc u l t u r eo fr c a p s u l a t ac n 1a n dko x y t o c a h p1w a si n v e s t i g a t e d t h ee x p e r i m e n t so fb a t c hf e r m e n th y d r o g e np r o d u c t i o nw e r e c a r r i e do u ti n14 0 一m ls e r u mb o t t l e sw h i c hw e r ef i l l e dw i t ha r g o n ( 删t h eo p t i m a l c o n d i t i o n sf o rh y d r o g e np r o d u c t i o nw e r e ：i n i t i a lp h7 5 ，l i g h ti n t e n s i t y4 0 0 0 1 u x ， r h o d o p s e u d o m o n ac a p s u l a t ac n 1i n c u l a t i o nv o l u m e2 0 ，3g lp e p t o n ea sn i t r o g e n r e s o u r c ea n dt h es o d i u mg l u t a m a t es e c o n d a r y t h es t a s i s s t a g ew a se v i d e n t l y s h o r t e n e dw h e na m m o n i a t ew e r ea d d e da sn i t r o g e ns o u r c e ，b u tt h ey i e l do fh 2 p r o d u c t i o n d e c r e a s e d t h ea n a e r o b i c a t m o s p h e r e i s n e c e s s a r y f o r h y d r o g e n p r o d u c t i o n ，e v e n3 o x y g e nc a nd e c r e a s et h ep r o d u c t i o no fh y d r o g e n u n d e rt h e o p t i m a lc o n d i t i o n st h em a x i m u mh ep r o d u c t i o nw a so b t a i n e da s4 0m o lh 2 m o l ( c h 2 0 ) 6w i t hah ey i e l do f6 6 7 t h el i q u i dw a s t eo fs s fi n c l u d e sl o t so fo r g a n i ca c i d s ( b u t y r i ca c i d2 5 5g l ， 3 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 a c e t i ca c i d0 5 1 l ) a n ds u g e r ( 3 1 l ) w h i c hc a nb eu s e db yr h c a p s u l a t ec n la n d ko x y t o c ah p1 u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm i x e dc u l t u r e ，t h ea m o u n to f h y d r o g e np r o d u c e db yt h ew a s t el i q u i do fs s fw a s9 2 0m lh 2 l t h et o t a lh e p r o d u c t i o nw a s14 0 7m l h 2 gr i c es t r a wb y t h ep r o c e s so fs s fa n dm i x e dc u l t u r e 。 t h e l i q u i dw a s t ef r o mb i o h y h r o g e nc o n t a i n ss c p ( s i n l ec e l lp r o t e i n ) w h i c hc a nb e r e c y c l e d i nt h i sr e s e a r c h ，c h i t o s a nh a sb e e nu s e df o rr e c e i v i n gb a c t e r i u mf r o m w a s t e w a t e r t h er e s u l ts h o w e dm a tt h ef rw a s9 2 1 ，a n dc o d4 0 ，w h e nt h e c o n d i t i o n sw e r ep h4 5 c h i t o s a nd o s a g e6 0 m g 1a n d4 0 。c u n d e rt h e o p t i m a l c o n d i t i o n st h ef i l t r a t i o ns p e e do ft h ef l o c c u l a t e ds a m p l ew a si m p r o v e dd r a m a t i c a l l y w h e nt h ec h i t o s a na n dt h ef l o c c u l a n to f13 0w e r eu s e dt o g e t h e r , t h ef rc a nr e a c h 9 4 1 k e yw o r d ：s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n ( s s f ) ；m i x e dc u l t u r e ； b i o h y d r o g e n ；c h i t o s a n 4 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 1 前言 随着社会经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，能源消费总量也迅速 增加，能源问题已经成为影响世界经济发展的最大问题 1 1 能源发展的现状、存在的问题和对策 1 1 1 化石燃料日益枯竭，能源需求高度成长 化石燃料煤炭、石油与天然气，合计占全球现在使用能源总量的8 5 以 上。按目前消耗速度，石油可用5 0 年，天然气可用6 0 年，煤炭可用2 0 0 年n 1 。 能源消耗与能源供给间的缺口将逐年加大。据估算，2 l 世纪化石燃料中有的将 被开采殆尽，有的因开采成本高以及开发使用导致的一系列环境问题而失去开采 价值，化石燃料终将耗尽是无可争辩的事实口1 国际能源机构( i e a ) 2 0 0 4 年公布了新版世界能源预测，对2 0 3 0 年前的能 源需求、使用进行了预测，指出未来能源需求将继续保持增长，化石类燃料将占主 导。该报告称2 0 0 0 - 2 0 3 0 年间，全球一次能源每年需求增幅为1 7 ，到2 0 3 0 年 时年需求将达到1 5 3 亿吨原油( 折合) ，而目前全球能源消费总量为9 0 亿吨原油 ( 折合) 。能源需求增长的9 0 为化石类燃料。未来全球石油每年需求增幅为1 6 ， 将由2 0 0 0 年的7 5 0 0 万桶天增至2 0 3 0 年的1 2 亿桶天，其中的7 5 将用于 满足交通运输需求。天然气需求增长最快，天然气需求将翻一番，在能源需求中的 份额将从目前的2 3 增至2 8 ，未来将有大量的电厂使用天然气作燃料。煤炭需求 也会增加，但比石油和天然气的增幅要小。中国已成为世界上的第二大一次能源 消费国，随着经济的不断发展，能源需求将继续增长，且需进口大量石油和天然气 资源。但是石油等能源的价格一直在上升，目前每桶石油已经到了7 0 美元。 1 1 2 化石燃料引起严重污染，生态环境遭到破坏 化石能源的使用中产生大量的二氧化碳、二氧化硫、氮氧化合物等是造成环 境恶化的直接原因口1 。科学家们长期跟踪调查的结果表明目前全球气候正在变 暖，引起全球气候变暖的直接原因是温室气体的大量排放。据统计全球每年排入 大气中的二氧化碳大约1 4 5 亿吨。全球气候变暖将导致地球海平面变化，温带北 移，引发一系列社会经济乃至政治外交问题。此外，中国、欧洲、北美世界三大 酸雨区的形成，则归因于二氧化硫、氮氧化合物的排放。随着环境的破坏，地球 上的生物正在加速灭绝，p o u n d s 等h 1 在2 0 0 4 年1 月出版自然杂志称，全球变 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 暖将导致地球生物分布和数量发生改变，如果温度继续上升许多生物将灭绝。在 半个世纪后，约有1 0 0 万个物种从地球上消失。化石燃料的污染，生态环境的破 坏也使人类的生存受到威胁。不少大中城市的空气污浊，在世界1 0 大空气污染 最严重城市中，中国占5 个，其中包括北京。据国内外环境经济学专家分析，在 全国范围内每年因大气污染超过国家标准而过早死亡的人数达1 5 2 0 万。 1 1 3 能源对策一开发新能源 社会经济日益发展，能源需求越来越大，而地球上的化石燃料是有限的。除 了提高能源利用率，节约能源，寻找无污染的可替代新能源是非常必要的。“可 再生能源和“可持续发展”的“新能源正是由此而诞生并被列入世界各国重 要议题。新能源包括太阳能、生物质能、氢能、核能和风能等。其中生物质能、 氢能因其是储量丰富的清洁能源，越来越受到人们的重视。 生物质能是太阳能以化学能形式贮存在生物中的一种能量形式，是可再生能 源，它来源于植物的光合作用。地球上的植物进行光合作用所消耗的能量，占太 阳照射到地球总辐射量的0 2 。所占比例不大，但绝对值惊人：光合作用消费 的能量是目前人类能源消费总量的4 0 倍，生物质能是一个巨大的能源。就纤维 素类生物质而言，我国农村可供利用的农作物秸秆达5 - - - , 6 亿吨，相当于2 亿多吨 标准煤。此外还有林产加工废料约为3 0 0 0 万吨、1 0 0 0 万吨左右的甘蔗渣哺1 。目 前世界各国正逐步采用如下方法利用生物质能3 ： ( 1 ) 热化学转换法，获得木 炭、焦油和可燃气体等品位高的能源产品；( 2 ) 生物化学转换法，主要指生物 质在微生物的发酵作用下，生成沼气、酒精等能源产品； ( 3 ) 利用油料植物所 产生的生物油；( 4 ) 把生物质压制成成型状燃料( 如块型、棒型燃料) ，以便集 中利用和提高热效率。利用生物质能可以减少燃烧产生的c 0 。的净排放，同时由 于其所含n 和s 很低，在利用生物质能时s o x 和n o x 的排放量也要远小于化石燃 料，因此生物质能的利用已成为新能源开发的一个重要方向口引。 氢能是一种极为优越的新能源，将会成为2 1 世纪最理想的能源，其主要优点 有】：( 1 ) 燃烧热值高：每千克氢燃烧后能放出1 4 2 3 5 千焦的热量，约为汽油的3 倍，酒精的3 9 倍( 2 ) 清洁无污染：燃烧的产物是水，对环境无任何污染。( 3 ) 适用范围广：贮氢燃料电池既可用于汽车、飞机、宇宙飞船，又可用于其他场合 供能。( 4 ) 贮电的技术经济性能有可能超过其他同类技术；转换为动力的热效率 6 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 比常规化石燃料高3 0 - - 6 0 ( 5 ) 适用管道输送，可以和天然气共用输送系统， 且输送成本低、损失小、优于输电等。氢能作为一种清洁能源，完全符合可持续 发展战略的要求。近年来其开发与利用技术在工业化国家中得到高度重视，各国 纷纷投入大量的人力资源来开展研究工作n 州5 1 。在日本，由能源部主持的“太阳 能计划”，确立的最终目标是建立一个世界范围的能源网络，以实现对氢的有效 生产、运输和利用，该计划从1 9 9 3 年至u 2 0 2 0 年横跨2 8 个年头；北欧国家如冰岛、 丹麦等已在筹划建立国家氢能系统、加拿大利用丰富的水力资源电解水制氢、美 国则利用太阳能制氢。 1 2 生物制氢 生物质能总量是巨大的，但是生物质的燃烧热值不高，无法适应现代的能源 供应体系，将生物质能转变为热值很高的氢能，可以较好的解决这一缺陷。生物 制氢因此得到人们的重视，生物制氢是在温和的条件下，以可再生的生物质为原 料，利用产氢微生物代谢活动来制取氢的一项生物工程技术，其生产过程清洁、 节能，且不消耗化石燃料。生物制氢包括暗发酵制氢和光发酵制氢n6 j 。利用微生 物制取氢气这一课题已经研究了几十年。进入9 0 年代，环境污染和“温室效应” 使生物制氢成为国际界热衷探索和研究课题之一，被认为是妥善解决能源与环境 矛盾，促进经济与环境的协调发展的“绿色”技术，越来越多的科学家投身并致 力于生物制氢技术的研究开发及应用。目前，生物制氢己作为氢能开发前沿技术 被提到议事日程。日本、德国、美国给予了空前重视，成立了专门机构，建立并 启动了生物制氢的发展规划，以期通过其基础性和应用性研究，在2 1 世纪中叶使 该技术实现商业化。我国的生物制氢的研究也在蓬勃发展中。目前，国际上的生 物制氢研究己从对现象的认识转向生物工艺技术的研究开发阶段。 1 2 1 传统的制氢方式 目前传统的制氢方式主要为物理化学方法。目前世界上生产的氢气，9 6 是 由天然的碳氢化合物一天然气、煤、石油产品中提取的。传统的制氢工艺方法 主要有水电解法、烃类水蒸汽转化法、煤气化法、重油部分氧化法和甲醇制氢法 等呻1 。传统的制氢方法都有一个不足之处，需要消耗大量的能量或化石燃料，易 造成二次污染，而且生产成本普遍较高。 1 2 1 1 水电解法制氢 7 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 电解水方法制氢在1 9 0 0 年发明，是目前应用较广且比较成熟的方法之一。水 在电能的作用下分解成氢气和氧气，是氢与氧燃烧生成水的逆过程，因此只要提 供一定形式一定的能量，则可使水分解成氢气和氧气。其中工艺过程简单，无污 染，但消耗电量大，因此其应用受到一定的限制。目前电解水的工艺设备均在不 断的改进，但电解水制氢能耗仍然很高。 1 2 1 2 烃类水蒸汽转化法 烃类水蒸汽转化制氢法是目前世界上应用最普遍的制氢方法，是由巴登苯胺 公司发明并加以利用的，由i c i 公司首先实现工业化。烃类蒸汽转化制氢过程分 为转化和变换两个阶段。烃类转化过程在5 0 0 8 5 0 列管式变温催化剂床层内进 行，由烃与水蒸汽反应生成一氧化碳与氢气。转化气中一氧化碳在催化剂作用下 与水蒸汽进一步反应变换到氢气与二氧化碳。通常8 7 的氢气由转化过程产生， 其余1 3 的氢气通过变换过程产生。烃类水蒸汽重整制氢反应是强吸热反应，反 应时需外部供热。热效率较低，反应温度较高，反应过程中水过量，能耗较高， 造成资源的浪费。 1 2 1 3 煤气化制氢 煤气化制氢曾经是主要的制氢方法。随着石油工业的兴起，特别是天然气 蒸汽转化制氢方法的出现，煤气化制氢技术呈现逐步减缓发展态势。煤气化制氢 主要包括三个过程：造气反应、水煤气变换反应、氢的纯化和压缩。 1 2 1 4 重油部分氧化法制氢 重油是炼油过程的残余物，市场价值曾经不高，因而用来制氢一度显示出成 本优势。近年来，重油的用途逐步拓宽，特别是石油价格不断攀升，重油制氢成 本优势逐步消失，甚至在成本上( 与其它制氢过程相比) 处于劣势。重油部分氧 化制氢包括碳氢化合物与氧气、水蒸汽反应生成氢气和碳氧化物。 1 2 1 5 甲醇制氢法 利用甲醇制氢有三条途径：甲醇分解制氢甲醇水蒸汽制氢和甲醇部分氧化制 氢。甲醇水蒸汽转化制氢由于氢收率高，其产物的氢气组成可接近7 5 ，能量利 用合理，过程控制简单，便于工业操作，得到了更多的应用。 1 2 2 光合细菌制氢的研究进展 光合细菌是能进行光合作用的一类细菌，它在地球上最早出现的具有原始光 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 能合成体系的原核生物，属于水圈微生物的一种。光合细菌分布广泛，通常的 光合细菌是指绿细菌和紫细菌，一般以紫色非硫细菌和紫色硫细菌最为常见，在 分类地位上光合细菌属于细菌门真细菌纲红螺菌目。这一目的微生物能在厌氧条 件下进行光合作用，且不释放氧气n7 1 。细胞中含有细菌叶绿素和多种类胡萝卜素。 在1 9 4 9 年g e s t 和k a m e n 首先观察到深红红螺菌以有机物为供氢体的光合产氢现 象，此菌经过一段培养后可持续产氢。在此以后，光合细菌的光照放氢已从对现 象认识角度转向获取洁净能源一氢能角度来进行研究和开发。 1 2 2 1 光合细菌制氢的研究概况 从1 9 4 9 年g e s t 和k a m e n 首先观察到深红红螺菌进行光合产氢外，迄今为止， 已研究报道的菌株类群包括有r h o d o s p i r i l l u m , r h o d o b a c t e r , r h o d o p s e u d o m o n a s , c h r o m at i u r n , r h o d o m i c r o b i u m 和e e t ot h i o r h o d o s p i r i a 属的 不同菌株。目前，光合放氢菌株的选育，不仅仅局限于筛选不同的光合细菌，利 用传统遗传诱变、选择培养技术、遗传工程技术改造产氢菌株和构建多功能基因 工程菌是未来发展的方向。w i l l i s o n n 8 1 化学诱变肋c a p s u l a t ab 。，菌株筛选到 的膜结合氢酶缺陷株，生长迅速，产氢量明显提高，变异株在l 一苹果酸、d l 一苹 果酸和d 一苹果酸中的产氢量分别比野生型菌株提高1 0 一2 0 ，2 0 一5 0 和7 0 。 h u s t a d e d 鲫筛选获得的肋s p h a e r o i d e sp h b 缺陷株在乙酸基质中的产氢量比野生 型有大幅度提高。j a h n 乜们插入诱变r b c a p s u l a t ab , o 的h u p l 基因，这种变异株在 限氮光异养生长时，产氢量是野生株的1 倍以上。 随着光合制氢的深入研究，各种实用的光合细菌培养放氢的技术也陆续出 现。固定化技术、连续培养技术和混合培养技术等都被应用于产氢研究中。 ( 1 ) 固定化技术：研究表明固定化技术能提高产氢能力和提高系统的稳定 性，并延长产氢时间。例女n s a s i k a l a 乜等用海藻酸钠固定化肋s p h a e r o i d e s 后， 以酿酒废水为底物进行连续培养方式光合制氢，得到3 0 9 4 m l h 。l 废水的转化率。 刘双江乜2 1 等用海藻酸钠固定r h o d o p s e u d o m o n a ss p h 菌株进行了豆制品废水产氢 研究，结果表明高浓度有机废水的平均产氢速率和化学需氧量( c o d ) 去除率均高 于低浓度有机废水。但是固定化技术也有其局限性，固定化细胞在培养时存在与 培养基接触的障碍，同时海藻酸钠等的固定化成本较高。 ( 2 ) 混合发酵( m i x e df e r m e n t a t i o n ) ：通常是指采用二种或二种以上的微 9 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 生物进行发酵的技术。在自然界很多生物过程不是由单一菌株所完成，必须依靠2 种或多种微生物共同完成。光合细菌可与多种生物组建形成良好微生态产氢体系， 使其在转化可再生生物质资源( 纤维素和有机废水) 生产氢能方面具有显著优势。 y o k i o 比朝等利用c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m y f i r h o d o b a c t e rs p m - 1 9 混合培养使淀粉 产氢效率比单一菌株高出2 - 3 个数量级0 d o m 口4 3 等利用肋c a p s u at a 野生型和吸 氢酶缺陷( 肌矿) 变异株分别和纤维素降解菌c e l i u l o m o n a ss p a t c c 2 1 3 9 9 共培养 进行了纤维素产氢研究，野生型产氢量只有1 2 - - 4 3 m o l m o l 葡萄糖，而变异株产 氢量达4 6 - 6 2 m o l m o l 葡萄糖。 1 2 2 2 光合细菌的产氢机制 光合细菌产氢机制主要分为两大类：暗发酵产氢机制和光合产氢机制。如果 有光照，在厌氧或微氧条件下，光合细菌会以培养质中的碳源为氢供体，通过光 反应中心与固氮酶的协同作用( 非环式光合磷酸化) ，同化n 2 并释放h 2 ；如果 是黑暗条件下，通过类似严格厌氧菌或兼性厌氧菌的代谢途径，将有机物分解代 谢，多余的能量用于氢酶将h + 还原为h 2 乜弘2 7 3 。 ( i ) 光合产氢机制：光合产氢的特点是通过光合作用将光能转化为电能( 产 生电子) ，并通过电子传递作用产生a t p ，为细胞生理代谢供给最基本的保障。 固氮光合细菌在光合细菌能进行不产氧的光合作用( 细菌式的非环式光合磷酸化 作用) 。其过程为光合细菌光捕获复合体上的细菌叶绿素b c h l 和类胡萝卜素吸收 光子后，其能量传送到光合反应中心，从而产生一个高能电子e ，由于p s b 只具有 光合系统( p s ) ，所以该高能电子经环式磷酸化产生a t p ，也可经非环式磷酸化产 生少量a t p 和n a d ( p ) h 2 。光合细菌的固氮酶，利用光合磷酸化产生的a t p 和还原 性物质提供的电子( 由还原型铁氧还蛋白传送来的) ，将质子还原成氢气。光合细 菌的固氮酶，利用光合磷酸化产生的a t p 及n a d ( p ) h 2 所提供的h + 和e - ，并没有完全 将n 2 还原成n h 3 ，而是有一部分e - 在氢酶的协同作用下将h + 还原为h 2 ，在正常情况 下光合细菌固氮和产氢同步进行瞳5 2 9 l 。 1 0 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 图1 1 光合细菌的光合放氢途经 p s i ：光合反应中心r c 、l h ：光合色素复合体；b c h h 细菌叶绿素；b p h e ： 细菌脱镁叶绿素；c o q ：泛醌：c y t b c ：细菌叶绿素b 或c f i g 1 - 1p a t h w a yo fh 2p h o t o p r o d u c t i o no fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a 如图1 - 1 所示光合产氢的关键酶为固氮酶。固氮酶结构通常由两部分组成：( 1 ) 固分子氮酶( 钼铁蛋白或组分) ，约为2 4 0 k d ，为四聚体；( 2 ) 固分子氮酶还原酶( 铁 蛋白或组分) ，6 0 k d ，由两个相同的亚基组成心9 1 固氮酶是由铁蛋白与钼铁蛋白以 2 ：l 的比例组成的，二者都含有铁原子和硫原子，且其中硫原子在酸性条件下能以 h ：s 的形式释放。氮源是影响固氮酶放氢活性的主要因素。在有n 。等底物存在时， 固氮酶进行n 。的还原反应：n 。+ 1 2 a t p + 6 e = 2 n h 。+ 1 2 ( a d p + p i ) ，在无n 。等合适底物时， 固氮酶行使固氮放氢功能：2 h + + 4 a t p + 2 e = h ：+ 4 ( a d p + p i ) ，以n h 4 + 为氮源时，不产生 也，n h 4 + 抑带i j p s b 固氮酶合成，n h 4 + 能降低p s b 的能量水平，因n 旷对光合磷酸化有解 偶联的作用，直接干扰a t p 产生系统，同化n h 4 + 也需a t p 和还原力，一些易分解产生 n h 4 + 的氨基酸( 莎i j a l a ，s e r ) 对p s b 产氢亦有抑制作用船8 1 ( 2 ) 暗发酵产氢机制：在1 9 4 9 年，g e s t 发现适应了甲酸环境的 r h o d o s p i r l l l u r u b r u m 能够黑暗产生c 0 ：和h ：，以后研究又发现红螺菌科 ( r h o d o s p i r i l l a c e a e ) 中的某些菌株例如尼s p h a e r o i d e s 、兄 r u b r u m 、尼 p a l u s t r i s 、b i a s t o c h l o r iv i r i d i s 以及zr o s e o p e r s i c i n a 均可在黑暗厌氧条件 下以葡糖、有机酸、醇类产生h 。和c o ：，吴永强研究也发现兄s p h a e r o i d e s 黑暗发酵 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 休止细胞在暗处有较高的放氢活性，铵和n ：并不抑制放氢活性，但使放氢总量减 少；c 0 抑制发酵休止细胞的氢，2 0 c 0 几乎完全抑制放氢，这些实验数据均证明了 黑暗条件下的产氢不是由固氮酶催化，而是由氢酶催化口0 1 。研究证实，黑暗厌氧 发酵产氢机制更相似于严格厌氧细菌，是由丙酮酸一甲酸氢解酶( f h l ) 代谢丙酮 酸，f h l ( 甲酸氢解酶系统) 的活性相似于ec o l i ，利用有机废弃物中大量的碳水化 合物黑暗产氢，其技术工艺上要比光合产氢更简单，但产氢效率较低。 光合细菌暗发酵的关键酶为氢酶。氢酶在光合细菌中所起到的作用是利用氢 气作为还原剂固定c 0 2 ，或者催化重新吸收固氮酶所产生的氢气，或者发酵有机 底物时产生氢气释放过剩的还原力。氢酶分为可逆性氢酶和不可逆性氢酶两种。 可逆性氢酶既可吸氢又可放氢，不可逆性氢酶则只能吸收氢气。在黑暗条件下， 光合细菌可通过可逆性氢酶，产生氢气。对于光合细菌而言，虽然膜结合态氢酶 可催化可逆反应，但其主要行使吸氢功能，其吸氢活性是其放氢活性的1 0 0 倍， 因此可通过对氢酶活性的抑制而相应地提高产氢量。所以目前有研究者通过对光 合细菌吸氢酶基因的缺失来提高光合放氢的效率。本实验室敲除了ev i n o s u m 膜结合态氢酶基因，对ev i n o s u m 膜结合态氢酶缺失突变株么删行了放氢特性 分析，发现么臃暗发酵条件下放氢总量比出发菌株提高了6 2 3 。 1 2 2 3 光合细菌的应用 光合细菌是一种营养价值高且组份较全的微生物，广泛分布在海洋、湖泊、 水田、污泥等各个角落，能充分利用光能和各种有机物为其营养源进行自身的营 养繁殖。在不同的自然环境下，光合细菌具有多种不同的功能在自然界的碳、氮、 硫循环中起着重要作用。由于光合细菌独特的生理功能和菌体内所含的丰富营养 以及在环境及人类生活各方面的广泛应用，受到了水产、环境和微生物学界的广 泛重视。 ( 1 ) 光合细菌在水产、禽畜养殖中的应用 光合细菌营养丰富。细胞干物质中蛋白质含量高达6 0 以上，比目前生产的单 细胞蛋白酵母的含量高。与牛奶、鸡蛋蛋白相比，其蛋白质氨基酸组成齐全，因而 被认为是一种优质蛋白源。光合细菌还含有多种维生素，尤其是b 族维生素极为 丰富，v b 。：、叶酸、泛酸、生物素的含量远高于酵母。此外，还含有大量的类胡萝 卜素、辅酶q 等生理活性物质b 。因此，光合细菌具有很高的营养价值，在水产和 1 2 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 畜禽养殖上有着很高的应用价值。光合细菌经常作为动物饲料的添加剂，可显著 的提高动物的存活率、增长率及增强抗病力，用于禽畜饲养，可迅速增重，进而提 高产量，并且肉质优良、减少疾病，同时还可以减少粪臭，优化环境。另外在水产 养殖中光合细菌还可以净化水质，增加溶氧，提高养殖密度。总结起来光合细菌 在养殖业的应用有以下六大特性，即清污、营养、杀菌促生长、高效安全口2 | 。 ( 2 ) 光合细菌在种植业中的应用 现代化农业生产中使用大量的化学肥料和化学农药，残留肥料使土壤盐化、 结板严重，肥力衰竭。“有机肥料和”生物农药 受到重视，光合细菌已被证 明既是一种优质的有机肥料，又能增强植物的抗病能力。光合细菌可作为底肥、 或以拌种和叶面喷施等方式应用。可用于水稻，蔬菜等农作物的种植，可以促进 土壤中有益生物的生长，抑制有害生物的生长，提高土壤的固氮能力，增强作物 的抗病能力，增加产量，提高作物的品质口1 j 。 ( 3 ) 光合细菌在污水处理等环保中的应用 人们发现污水在自然的净化过程中，水中微生物群落出现生长演替的现象， 即一般异养微生物首先大量繁殖，随之是光合细菌的大量出现，最后是藻类和浮 游植物的大量生长。因而考虑到以人工方法大量增加光合细菌就可以加速水质的 净化。现在出现的应用光合细菌处理高浓度有机废水( 简称p s b 法) 首先在日本兴 起，近来我国及世界其他国家也正在研究推广中。光合细菌中的红螺菌科细菌能 大量利用有机物如有机酸和芳香族类，并有固定c 0 。和n ：、脱氮、同化h ：s 和分 解有毒物质等许多机能，更能在厌氧或好氧的不同条件下生长良好。另外光合细 菌处理污水设备规模小、动力消耗低、投资费用少、易管理、受季节影响小、在 1 0 4 0 c 温度范围内均可处理；产生的菌体可综合利用，在养殖业与种植业中作 为饲料或肥料口朝。因此光合细菌处理法应是目前环保治理的一个最经济、最有效 的手段。 ( 4 ) 光合细菌在食品、化妆品、医药保健业中的应用 随着人们对光合细菌的深入研究，光合细菌的应用范围也越来越广，尤其是 它在人类保健食品方面的作用备受关注。1 9 9 2 年全美保健食品中有6 5 ) j h 有光 合细菌。光合细菌富含类胡萝卜素，为重要的微生物来源的天然红色素。该色素 无毒，色彩鲜艳、亮泽，并具防水性，因而很适用于食品、化妆品等工业中作为着 1 3 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 色剂，在医学业中也具广泛应用前景。利用光合细菌发酵生产类胡萝i - 素的研究 已普遍引起重视。光合细菌细胞中富含的b 族维生素及活性物质也成为提取天然 药物的良好素材之一，光合细菌微生态制剂因此诞生。 ( 5 ) 光合细菌在能源开发( 制氢) 方面的应用 光合细菌除能同时进行光合作用和固氮作用外，还能产生氢气。氢作为一种 理想而无污染的未来能源日益受到人们的关注。生物制氢是开发新能源的一个方 向，欧美、日本等均在研究和开发生物制氢技术。我国近几年也有这方面的报道。 光合细菌制氢具有转化效率高，产氢稳定，产氢纯度高等特点，光合制氢正在蓬 勃发展中。 目前在许多方面的应用研究，还只能说处在初级阶段，还有大量的、深入的 研究工作要做。但是，目前的研究已显示出光合细菌作为重要的微生物资源，其 开发应用的前景是广阔的，必将具有不可替代的应用市场，在人类活动中必将发 挥越来越大的作用。利用具有广泛用途的光合细菌制取氢气，将对生物质发酵制 氢的发展起到巨大的推动作用。 1 2 3 暗发酵生物产氢研究进展 利用光合细菌制氢是一个非常理想的过程，但工业化生产设备和光源等诸多 问题制约了光合产氢技术的发展。厌氧发酵过程采用传统的发酵工艺进行产氢菌 厌氧发酵，相对于前者在许多方面表现出更多的优越性口4 。3 朝：发酵产氢菌种的产 氢速率高于光合产氢菌种，而且发酵产氢细菌的生长速率较快；发酵法生物制氢 无需光源，不但可以实现持续稳定产氢，而且反应装置的设计、操作及管理简单方 便；发酵生物制氢设备的反应容积可达到足够大，从而可以从规模上提高单台设 备的产氢量；可生物降解的工农业有机废料都可能成为发酵法生物制氢的原料， 来源广泛且成本低廉：兼性的发酵产氢细菌更易于保存和运输。所以目前发酵法 生物制氢技术比光合生物制氢技术发展更快，已经实现规模化工业化生产。 1 2 3 1 暗发酵生物产氢研究进展 目前，国内外发酵法生物制氢技术的主要研究成果主要集中在分离和筛选高 效产氢菌种、混合菌种产氢技术、活性污泥产氢等几个方面。 分离和筛选高效产氢菌种一直以来都是发酵产氢的核心工作，多年来的研究 发现，产氢菌种主要包括梭菌属( c l o s t i d i u m ) 、类芽孢菌属( p a e n i b a c i l l u s ) 、 1 4 厦门大学硕士论文：微生物发酵制氢系统的研究 肠杆菌科( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 、巨型球菌属( m e g a s p h a e r a ) 、韦荣氏球菌 属( v e i l o n e a ) 、互养球菌属( s y n t r o p h o c o c c u s ) 、醋弧菌属( a c e t i v i b r i o ) 、