（微生物学专业论文）可控降解phb为单体及其发酵条件的探索研究.pdf

摘要 以实验室保藏的1 4 株可以降解p h b 的菌株为出发菌株，用纸层析法筛选出3 株菌 株，分别是青霉( p e n i c i l l i u ms p ) d s 9 7 0 1 0 2 、青霉( p e n i c i l l i u ms p ) d s 9 7 0 7 和青霉 ( p e n i c i l l i u ms p ) d s 9 7 1 3 a - 0 1 ，三株菌株均能将p h b 降解为p h b 单体即3 羟基丁酸。 本实验摸索了各菌株发酵液的处理方法，即将发酵液于4 ，1 2 0 0 0xg 离心3 0 m i n ， 除去菌丝体，然后抽滤( 抽滤膜3 4 p z n ) 除杂之后，用超滤膜( 截留分子量1 0 0 0 0 ) 超 滤，再用0 2 5 w n 的膜过滤后直接用于液相色谱分析。 用液相色谱法对发酵液中的3 羟基丁酸进行定量分析。摸索了液相色谱分析的最 佳条件：s h i m - - p a c kv p o d sc l s 柱( 1 5 0 l x 4 6 ) ；流动相为乙腈：纯水( v v ) = 1 5 ：8 5 ， p h = 2 8 ；紫外检测波长为2 1 0 n m ；进样量为2 0 | il ；流速为l m l m i n ：柱温l o 。 通过单因素考察初步了解菌株的营养需求条件，以碳源、氮源、磷源及培养基起始 p h 值为考察因素，设计一个四因素三水平的正交实验。确定三株菌株降解p h b 产生单体 的最佳培养条件，结论如下： i 青霉( p e n i c i l l i u ms p ) d s 9 7 0 1 0 2 的最佳发酵时间是7 天，对菌株降解p h b 产 生单体的影响因素按大小依次为：起始p h 、碳源、磷源和氮源。适用于青霉( p e n i c i l l i g l m s p ) d s 9 7 0 1 0 2 的最优培养基配方为：碳源浓度为o 7 s g l ，氮源浓度为0 5 9 l ，磷源 浓度为1 1 9 4 4 5 4 9 l ，起始p n 为5 5 。 2 青霉( p e n i c i l l i u ms p ) d s 9 7 0 7 的最佳发酵时间是7 天，对菌株降解p h b 产生 单体的影响因素按大小依次为：碳源、起始p h 、磷源和氮源。适用于青霉( p e n i c i l l i u ms p ) d s 9 7 0 7 的最优培养基配方为：碳源浓度为0 7 5 9 l ，氮源浓度为2 e e l ，磷源浓度 5 9 7 2 2 7 9 l ，起始p h 为5 5 。 3 青霉( p e n i c i l l i u ms p ) d s 9 7 1 3 a - 0 1 的最佳发酵时间是8 天，对菌株降解p h b 产 生单体的影响因素按大小依次为：碳源、起始p h 、氮源和磷源。适用于青霉( p e n i c i l l i u m s p ) d s 9 7 13 a - 0 1 的最优培养基配方为：碳源为0 7 5 9 l ，氮源浓度为i g 九，磷源浓度为 5 9 7 2 2 7 9 l ，培养基起始p h 为5 5 。 关键词：降解p h b 菌株；3 一羟基丁酸；正交实验；液相色谱 a b s t r a c t t h r e ef u n g u sh a v eb e e no b t a i n e df r o mf o u r t e e ns t r a i n sp r e s e r v e di nt h el a b o r a t o r yb y p a p e rc h r o m a t o g r a p h y ，r e s p e c t i v e l yi sp e n i c i l l i u ms p d s 9 7 0 1 - 0 2 ，p e n i c i l l i u ms p d s 9 7 0 7a n d p e n i c i l l i u ms p d s 9 7 1 3 a - 0 1 t h e yc a nd e g r a d ep h bg r a n u l e sa n dt h ea n dp r o d u c ti st h e m o n o m e r t h ec u l t u r em e d i u mw e r eh a r v e s t e db yc e n t r i f u g a t i o na l1 2 0 0 0 x ga n d40 cf o r3 0m i n a n ds e p a r a t e db yu l t r af i l u a t i o n , t h e nt h e yw e r ed i r e c t l ya n a l y z e db yh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y t h ec u l t u r em e d i u mw e r ea n a l y z e db yh i g h - p e r f o r m a a c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w i t has h i m - p a c kv p - o d sc l sc o l u m n ( 15 0 l + 4 6 、t h es e p a r a t i o nw a sc a r r i e do u tb ye l u t i o n s t a r tw 弛h 2 0 ( a d j u s t e da tp h2 8w i t hh c l ) a c e t o n i t r i l e ( 8 5 ：15 。v v ) a taf l o wr a t eo f1m l m i n - 1 t h ew a v e l e n g t hf o rd e t e c t i n ge l u a t e sw i l l s2 1 0n m ，t h et e m p e r a t u r ei s l 00 1 2 a c c o r d i n gt ot h er e s u l to fs i n g l ef a c t o rt e s t , a no r t h o g n n a le x p e r i m e n t ( f o u rf a c t o r sa n d t h r e el e v e l s ) w a sd e s i g n e d ；t h es t u d i e df a c t o r sa r ec o n c e n t r a t i o no fc a r b o n , n i t r o g e n , p h o s p h o r u s $ o u r c e ，a n di n i t i a lp ho f c u l t u r em e d i u m t h eo p t i m u mc o n d i t i o ni sa sf o l l o w s ： 1 t h ep e n i c i l l i u ms p d s 9 7 0 1 0 2 ：t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nt i m eo fp e n i c i l l i u ms p d s 9 7 0 1 0 2i s7d a y s t h eo p t i m u mc o n d i t i o ni s ：c a r b o ns o u r c ei so 7 5 矿。，n i t r o g e ns o u r c ei s o ，5 9 l ，p h o s p h o r u ss o u r c ei s1 1 9 4 4 5 4 # l ，a n di n i t i a lp ho f c u l t u r em e d i u l l li s5 5 2 t h ep e n i c i l l i u ms p d s 9 7 0 7 ：t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nt i m eo f p e n i c i l l i u ms p d s 9 7 0 7 i s7d a y s t h eo p t i m u mc o n d i t i o ni s ：c a r b o ns o u r c ei s0 7 5 9 l ，n i t r o g e ns o u r c ei s 2 9 l ， p h o s p h o r u ss o u r c , ei s5 9 7 2 2 7 9 l ，a n di n i t i a lp ho f c u l t u r em e d i u mi s5 5 3 t h ep e n i c i l l i u ms p d s 9 7 1 3 a - 0 1 ：t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nt i m eo fp e n i c i l l i u ms p d s 9 7 1 3 a - 0 1i s8d a y s t h eo p t i m u mc o n d i t i o ni s ：c a r b o ns o u r c ei so 7 5 9 l ，n i t r o g e ns o u r c e i sl g l ，p h o s p h o r u ss o u r c ei s5 9 7 2 2 7 9 l ，a n di n i t i a lp ho f c u l t u r em e d i u mi s5 5 k e yw o r d s ：3 - h y d r o x y b u t y m t e ；o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ；h i g a - p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ；f u n g u so f d e g r a d i n gp h b i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名；j 1 主识 日期：塑21 ：兰 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学 位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：奎j 至丝 日 期：应盟2 ：乡 指导教师签名：兰垒塑吐 日i i ：竺z ：芝 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：型! 壅查盘鱼：士 通讯地址； 电话：业：! ：翌! 步 邮编： 引言 2 0 世纪5 0 年代以来，随着石油化工的发展，塑料成为一类与生活息息相关的材料。 它广泛用于家电产品、汽车、家具、包装用品、农用薄膜等许多方面。它具有良好的成 型、成膜性、绝缘性、耐酸性、耐腐蚀性，低透气、透水性以及易于着色，外观鲜艳等 特点，它和钢材、木材、水泥并列为材料领域的四大支柱。到目前为止，世界塑料年产 量己达一亿两千万吨，我国每年产量也超过5 0 0 万吨。但其固有的不可降解性却使大量 的塑料废弃物对环境造成严重的污染，而且由于目前废弃塑料的回收利用率很低，又造 成资源的巨大浪费。据报道，每年倾入海洋的废塑料有数十万吨，陆地上的更是难以计 数，危害剧烈。生存环境的压力迫使人们探索可降解塑料替换石化合成塑料的可能性。 1 、可降解塑料的种类 可降解塑料分为光降解塑料、生物崩坏性塑料和完全生物降解塑料。 光降解塑料是在塑料中引入光增敏基团或加入光敏性物质，使其在吸收太阳紫外线 后引起光化学反应，从而使塑料大分子链断裂成为小分子。但是能降解为小分子化合 物进入生态循环的塑料只是极小部分，绝大部分塑料只是逐步崩解变为碎片或者粉末， 因而对生态环境带来更大的潜在危害。另外由于受紫外线强度、地理环境、季节气候等 因素的制约较大，降解速率很难控制，使其应用受到一定限制。 生物崩坏性塑料是一种不能完全生物降解塑料，通常是在通用塑料中混入一定量的 淀粉或脂肪族聚酯等具有生物降解性的物质嘲。主要优点是可使用通用塑料的加工工艺 和设备，从而降低生产成本。缺点是降解不完全，大部分聚烯烃无法降解，只是崩裂成 碎片残留在自然中难以回收处理。 完全生物降解塑料是一种具有优良的使用性能，废弃后可被环境微生物完全分解， 最终被无机化而成为自然界中碳素循环的一个组成部分的高分子材料，包括：天然高分 子材料( 如纤维素、木质素，淀粉等) 、化学合成高分子材料( 如聚乳酸、聚己内酯、 聚乙二醇等) 、微生物发酵合成高分子材料( 如聚羟基烷酸酯) 。其中，聚羟基烷酸酯( p h ) 具有高熔点、高结晶度及高分子量等性质，而且耐紫外线，不易引起炎症，生物相容性 好，完全不含重金属等有毒物质，是极“洁净”的塑料，因此成为替代石化合成塑料的 最有潜力的材料0 1 。其中p t t b 是聚羟基烷酸酯的典型代表。 2 、聚一b 一羟基丁酸酯( p h b ) 简介 2 1p h a 的结构 聚羟基链烷酯( p o l y h y d r o x y a l k a n o a t e ，p h a s ) 是一类微生物聚酯的简称。目前已 鉴定的p h a s 约有4 0 种，其通式( 见图1 ) 。其中n 一- - - 1 ，2 或3 ，但是大多数情况下n = 1 ，即3 一羟基烷酸( 3 一h a ) 。x 为循环链节数；r 则代表侧基，多为不同链长的正烷基， 也可以是支链的，不饱和的或带取代基的烷基。随r 基团、共聚单体、链的长短以及羟 基的位置( 如3 一，4 - ，5 - ) 而异可代表不同的p h a 。 根据单体的组成可将其分为3 类；第1 类为短链脂肪酸共聚体，含c 。一c 。单体，如 p h b ；第2 类为中链脂肪酸共聚体，含c 。一c 。单体，如p h 0 ；第3 类为两种或两种以上 的单体之间形成的共聚物，如p h b v 。 ro i i i - - - c i h h 2 书面o 于j n = l ，r = - - c h 3 ；p ( 3 i - i b ) r = - - c h 广c i 3 ：l , o n v ) r - 一( c h 2 ) z c h 3 ；p ( 3 h o ) n = 2 ，r = - - h i p f 4 h b ) r = - - c h i ；p ( 4 h v ) n = 3 。r h ih 5 h v ) 其它的r 基团有：c h - - c h 2 ，一( c h 2 ) 2 一c h c h 2 ， 一c h 2 ) 2 4 7 一c i - 2 b r ，c h 2 一c h ( c h g - - c 巩 一c h 2 - - c h ( c h 3 )c h 2 一c h 2 一c h 3 等 图1 各种p h a s 的分子结构 其中p h b ( p o l y 一3 _ h y d r o x y o b u t y r a t e ，聚3 一羟基丁酸酯) 是p h a s 的典型代表，即 n = 1 ，r 为甲基时，聚合物即聚羟基丁酸( p h b ) 。 2 2p h b 的理化性质 p h b 是细菌发酵而产生的一种胞内产物，它以颗粒状态存在于细胞中。为了应用 p h b ，首先必须发酵生产，既而从细胞内分离提取p h b 。纯净的p h b 通常为白色，其分 子量和聚合度随微生物种类、限制性碳源种类及浓度、培养条件、发酵时间、提取方法 等不同而异。一般在5 - 1 5 0 0 1 0 3 d a 之间( 表1 ) 。作为塑料用途的p h b ，最好具有至少 6 0 万以上的分子量。 若因培养条件与提取方法不当导致p h a 的分子量低于2 0 ，0 0 0 ，p h a 的热塑性能便 受到很大影响。p h a 作为一类聚合物，它们的物理性质既有通性，又因单体的多样性和 碳链的长短而有所差异。一般说来，p h a 的熔点及玻璃化温度随着脂肪酸链的增长而降 低。 纯净的p h b 是一种高度等规立构、硬而脆的晶体物质，其结晶度达8 0 ，熔点1 8 0 。c 左右“。1 。由表2 中p h b 与聚丙烯的比较可知，二者有很多相似之处，但p h b 比聚丙烯 更硬和脆，断裂伸长p h b 为6 ，聚丙烯为4 0 0 ，抗溶剂性也较聚丙烯差，但却有聚 丙烯所不具备的优良的抗紫外辐射性嗍。 2 p 哪分子结构的高度立体规整性，决定了p h b 分子的特殊溶解性。p h b 不溶于水、 甲醇、乙醇、丙酮、醚、己烷、稀释无机酸等，部分溶于二氧六环、甲苯、辛醇、吡啶， 而溶于氯仿、二氧乙烷、二氯乙酸、三氟乙醇、二甲基甲酸胺、茨酮、三油酸甘油酯、 冰醋酸等。但由于p h b 的化学结构简单规整，因而性脆，应用范围受到限制。 表1 不同菌株中获得的p h b 的分子量 2 3p t t b 的生理作用 p h a 是细菌胞内的碳和能源的储备物，它对细菌适应外界环境的变化及维持其生存 具有重要的意义”。有些细菌胞内的p h a 还可以减缓细胞内重要成分一l n a 和蛋白质在 饥饿条件下的降解，从而可以增加细菌对不利生存环境的抵抗能力嗍。另外在某些芽孢 杆菌属中，尽管孢子的形成并不必需p h b ，但p h b 可以作为孢子形成时的能源和碳源从 而增加这些菌的生存机会。此外，p 邶还可以为某些固氮菌属的包囊形成提供必要的碳 和能源。 近年来发现p h b 也存在于原核生物和真核生物的膜中。在原核生物中，它存在于原 生质膜中。1 ；而在真核生物中，则在线粒体和微体膜中的比例为最多。相比于胞内的高 分子量的聚合物，存在于膜上的p h b 分子较小，只有1 0 0 - - 2 0 0 个单体，对这种小分子 p h b 的研究表明，它可能起着膜上的离子通道的作用“”。最近，在人的血细胞中也发现 较多的这种小分子p h b “。这对于利用p h b 来包裹药物进行定向定量释放以及p h b 在医 疗方面的应用提供了理论上的依据“。 2 4p h b 颗粒体 在相差显微镜下可观察到p h b 在细胞内是以内含物( 即颗粒体，肉眼观察似亮小体， 直径1 0 0 - - 5 0 0 n m ) 形式储存，可占细胞干重高达9 0 “”吖“1 。胞内p h b ( 即天然p h a 颗 粒) 处于一种无定形状态，有很大的流动性，分布无规律”1 。天然p h b 颗粒具有一层由 蛋白质和磷脂构成的表面层，该表面层对物理或化学胁迫敏感。当p h b 颗粒被分离到细 胞外时，这层表面层被破坏，p h b 趋向有规律的排列，聚合体结晶并采用一种有序的螺 旋结构“6 卜“”。 3 p h b 的合成 3 1 合成p h b 的主要微生物 1 9 2 5 年法国巴斯德研究所的l e m o i g n e 首先在巨大芽孢杆菌( g a c i l l u s m e g a t e r i u m ) 中发现p h b 颗粒“”，并于1 9 2 7 年首次将p h b 颗粒从细胞中分离出来。能产生p h a 的微 生物分布较广，包括光能和化能自养及异养菌，总计9 0 多个属中有3 0 0 余种微生物。 目前研究较多的微生物有：产碱杆菌属( a l c a l i g e n e s ) “”，假单胞菌属( p s e u d o n o m a s ) ，甲基营养菌( m e t h y l o t r p h y s ) 啪卜蚴，固氮菌属( a z o t o b a c t e r ) 嘲和红螺菌属 ( r h o d o s p i r i l u m ) 。“，以及基因工程菌ec o l i 。”叫“等。表3 列出了产生p h b 的部分 细菌属名。 根据培养条件的不同，一般将p h b 合成菌分为两大类型：第一类是需要以n 、p 、m g 、 0 或s 等基本元素为营养限制因子方能大量合成p h b 的细菌”1 ，如罗氏真养产碱菌杆菌、 甲基营养型单细胞菌和其它许多细菌；第二类是细菌合成p h b 过程中不需要营养限制因 子，而是在菌体生长过程中合成并积累p h b 。如棕色固氮菌突变株和带有真养产碱杆菌 p h a 合成操纵子的重组大肠杆菌h 3 i 】。 3 2 细菌发酵合成p h i l 英国i c i 公司经过1 5 年的努力，率先于1 9 8 2 年采用真养产碱杆菌小批量生产出商 品名为b i o p o l 的生物可降解塑料3 ，根据p h b 生物合成机制，用微生物生产p h b 一般 采用两阶段培养法，即先利用碳和氮，快速增殖菌体，然后在有限氮源的情况下合成聚 酯。l a f f e r 用氢细菌和真养产碱菌在c 0 。，h 。，n n ，p 0 4 “的无机盐培养基中生长，细胞量 随时间延长而增加，当n n 耗尽时，蛋白质合成停止，p h b 合成开始，4 0 小时后p h b 积 累量达菌体干重的7 0 以上。 4 表3 能合成p i i b 的微生物 微生物生产的聚酯是可以完全被微生物胞外酶分解利用的热塑性塑料，如果产品价 格能与合成塑料相当，那么生物降解性塑料将有很大的发展。目前限制商用p h b 成功生 产的因素之一便是生产所需碳源的成本，据计算，生产一吨p h b 需3 吨葡萄糖，用不经 提纯的糖来生产p h b ，可以降低成本。但如果用分离了的甜菜糖蜜培养，聚酯生成量明 显减少。甜菜糖蜜中含有8 1 8 4 ( w w ) 干物质( 其中5 0 5 2 是蔗糖) ，1 0 2 7 含氮化合物，9 1 0 无氮化合物，i i 1 2 灰分。真养产碱菌的突变株可以利用麦芽 提取物、玉米浆及没提取糖的甜菜和甘蔗糖蜜生产聚酯，可能是未分离的糖蜜中含有可 促进p h b 生产的附加因子。所以可以用糖生产的废糖液作为附加成分( 而非主要底物) 来提高p h b 产量。 3 3 构建基因工程菌合成p h b 目前引入真养产碱p h b 合成酶基因的重组大肠杆菌是最成功的基因工程菌。由于基 因工程菌具有生长迅速、培养基原料来源广，可利用廉价原料和废弃物来大量产生p h b ， 从而降低生产成本等突出优点，受到人们的关注。1 9 8 7 年，d e n n i s 成功地从a r u t r o p h u s 中克隆到合成p h b 基因，并转入ec o i l 中。他们还发现一种重组晟c o i l 突变株，细胞 比正常细菌细胞大1 0 倍。虽然p h b 产量平均较低，只有约7 0 左右，但ec o i l 突变 株可以直接利用各种碳源，如葡萄糖，蔗糖、乳糖、木糖等，选择廉价的底物，且易培 养，进步降低了成本。i c l 公司在1 9 8 9 年利用d e n n i s 组建的工程菌生产的p h b 占菌 5 体干重的8 0 以上。为了降低提取成本，许多国家相继投入了大量的人力和财力。比 较有代表的是奥地利维也纳大学在组建工程大肠杆菌的同时引入热敏噬菌体溶解基 因，使细菌易裂解释放p h b ，这一成果的最大特点是可降低提取成本，为推向市场打下 基础。 3 4 利用转基因植物生产p h b 在生枝动胶菌和真养产碱杆菌中，b 一酮硫解酶基因( p h b a ) 和依赖n a d p h 的乙酰 乙酰c o a 还原酶基因( p h b b ) 紧密相连。用真养产碱杆菌h 1 6 负向突变株互补方法确定， p h b c 基因编码p h b 合成途径中的第三个酶一一p 噶合成酶，三个基因的顺序 p h b c p h b a p h b b ，它们有一个共同启动予位于上游。 1 9 9 2 年美国科学家首次进行了植物生产p h b 的尝试：将c a m v 3 5 s 启动子控制的 a r u t r o p h u sp h b 合成途径中的p h b b 、p h b c 导入拟南芥菜中，并利用植物本身的酮硫 裂解酶合成了一定量的p h b ，颗粒大小、形状与细菌中相似。转基因植株虽然p h b 合 成量很少，但其生长却严重受阻。p h b 颗粒在胞质、液泡甚至核内出现，但在质体内不 存在。s o m e r v i l l e s 小组于1 9 9 4 年改进了策略，将p h b 定位于质体“o “，质体中富含 乙酰c o a ，而且质体内可容纳大量淀粉，暗示着同样可贮存大量的p h b 。他们分别在p h b b 、 p h b a 、p h b c 基因上连入一段编码豌豆叶绿体r u b i s c o 小亚基转移肽的d n a 片断，将表 达产物定位于质体，通过杂交手段将三个基因在同一株拟南芥菜中表达，结果p h b 累计 量高达干重的1 4 ，而且转基因植株发育正常。 3 5p h b 的合成途径 微生物合成p h b ，可以说是微生物脂类物质代谢的一部分。多聚羟基烷酸的代谢与 其它脂质，如脂肪、磷脂等的代谢密切相关，但代谢步骤与途径在共同基础上又有所不 同，最主要的区别步骤是羟基化与多聚体合成。纵观各种p h a 产生菌合成多羟基烷酸的 代谢，我们看到p h b 产生菌中，一些以碳水化合物作为基质，一些以脂肪或脂肪酸作为 基质，而另一些则以烷烃，醇类等作为碳与能源物质，其合成p h a 的代谢途径会有很大 的区别。但是也有相同与相似的规律，即均遵循酯类代谢的程序，先形成酰基化合物， 进行羟基化，最后聚合物为大分子聚合物。其中研究得最透彻的是p h b 的合成。 p h b 的合成途径”1 主要有三步：1 、由b 一酮硫裂解酶催化乙酰c o a 生成乙酰乙酰c o a ； 2 、乙酰乙酰c o a 在依赖n a d p h 的乙酰乙酰c o a 还原酶的作用下被还原成d ( 一) 一3 一羟丁 酰c o a ，最后聚合生成p h b 。3 、在真养产碱杆菌( a e u t r o p h u s ) 中乙酰乙酰c o a 在依赖 n a d h 的乙酰乙酰c o a 还原酶的催化下形成l ( + ) - 3 - 羟丁酰c o a ，然后被两个烯酰水合化 酶作用转化为d 一型异构体，最后聚合生成p h b 。 用于p h b 生物合成的碳源有糖类，有机酸，乙醇和二氧化碳等多种含碳化合物，这 些碳源在细胞内通过中间途径转化为乙酰c o a 。在微生物细胞内乙酰c o a 积累过剩时将 转变成p h b 。0 p p e o p l e s 等人在对许多细菌的研究中发现，由乙酰c o a 合成p h b 是通 过三酶合成途径，三酶即1 3 一酮硫解酶、依赖n a d p h 的乙酰c o a 还原酶和p h b 合成酶。 当碳、氮丰富时，微生物正处于旺盛生长期，乙酰c o a 优先进入t c a 循环，用于产生能 量及合成氨基酸，结果游离出大量辅酶a ，后者抑制6 一酮硫解酶活性，阻碍了p h b 得 6 生物合成。而当氮被限制时，蛋白质合成停止，细菌生长也停止，t c a 循环中的产物过 剩，乙酰c o a 量增加，游离的辅酶a 下降，b 一酮硫解酶活性显现出来，p h b 合成开始。 4 、p h b 的降解 p h b 生物降解分为胞内p h b 降解和胞外p h b 降解。胞内降解是合成细菌自身内源贮 存物的活性降解( 转移) ，促胞内p h b 降解的酶是胞内p h b 解聚酶。相反的，胞外降解 是非必需合成微生物分泌胞外p h b 解聚酶来利用外源性聚合体。胞外聚合体的来源是合 成细胞死亡及溶解后释放的p h b 。 4 1p h i l 的胞内降解 4 1 1 胞内p 船颗粒的结构和特征 胞内p h b 颗粒是非晶态的且表面有一层由蛋白和磷脂构成的表面层“1 ，该表面 层可通过加入化学物质如溶剂、清洁剂、碱而被破坏或去掉，物理胁迫如反复冻融或 反复离心同样可导致胞内p h a 颗粒变性嘲。小心破碎细胞( 弗氏压碎器或酯解) 之后通 过密度梯度离心纯化颗粒可避免p h b 变性。 颗粒表面层的蛋白的主要片段由相对小的两亲性聚肽构成，据推测该聚肽位于非水 溶性聚合体核心与亲水性胞质之间，具有稳定结构的功能，该结构蛋白被称作p h a i n s ， 与p h b 颗粒有高亲和性“”，p h a i n s 也参与p h a 合成和降解的调节“。表面层还含有一 些与聚合体合成( p h b 合酶) 及聚合体降解( 胞内p h b 解聚酶) 有关的蛋白。 4 1 2 胞内p h b 解聚酶的分析 胞内p h b 解聚酶对自然的非晶态形式的聚合物具有专一性，而胞外p h b 非此酶的底 物。获得非晶态p h b 的最好办法是纯化自然状态的p h b 颗粒。研究发现，生枝动胶菌、 食油假单胞菌、真养产碱菌的胞内p h b 颗粒均含有一种重要的内源性p h b 解聚酶可吸附 颗粒体表面。因此，在合适条件下胞内p h b 颗粒会缓慢的自溶“。但最近的研究表明， 可从重组有p t l b 生物合成基因的大肠杆菌菌株中分离p h b 颗粒。因为大肠杆菌没有任何 p h b 解聚酶基因，所以重组大肠杆菌的胞内p h b 颗粒没有任何内源性自溶活性“3 1 。 另外一种获得非晶态p h b 的方法是将p h b 、氯仿与水在清洁剂( s d s 、胆酸酯、油 酸酯) 存在下乳化，然后蒸发去除溶剂制成p h b 乳液1 。得到的p h b 乳液( 人工p m ) 可保持非晶态很长时间而且是一种许多胞内p h b 解聚酶和部分胞外p h b 解聚酶的合适底 物。但是，这种p h b 乳液具有不含p h a i n s 蛋白的人工表面层。而这些活性蛋白对聚合 体的降解性有很大影响，因此人工颗粒的解聚酶活性无法与天然p h a 颗粒相比。 胞内p h i l 解聚酶底物还可以通过在表面活性剂( 如油酸酯) 存在下通过脂酶或蛋白 酶分离p h a 颗粒来获得“”。但是目前为止，人工颗粒决定的胞内p h a 解聚酶活性的生理 关联还未确定。 胞内p h b 解聚酶活性可由以下方法测定：( 1 ) 比浊法，即在缓冲液中光密度值的减 少：( 2 ) 滴定法，即p h 值下降的无缓冲液水环境中为保持恒定的p h 值所加入的n a o h 量。比浊法实行起来快速、简易且能在微量滴定读数器中自动测量，但它对实验错误如 7 颗粒体的人工结合，光密度值的改变、由于颗粒体直径在反应中的变化引起的表面区域 变化等敏感，不能直接将光密度值减少程度与被水解的酯键数目联系起来。滴定法比较 复杂、费时且需要在蒸馏水中施行( 由于酶稳定性的问题) ，但它可提供被水解酯键数 目的定量数据。由3 h b 脱氢酶或高压液相层析获得产物如3 h b 或3 h b 寡聚体的方法可行， 但大量寡聚体难溶于水且不能定量测定。由于3 h a 寡聚体通常对热、酸、碱敏感，除非 实行了合适的控制寡聚体稳定性的方法，否则反应混合物无法被中止。 4 1 3 胞内p h b 解聚酶的生化及分子生物学性质 对胞内p h b 降解的生化研究由m e r r i c k 和d o u d o r o f f 首次完成。从深红红螺菌胞 内纯化出p h b 解聚酶。从巨大孢杆菌胞内分离的p h b 颗粒被用作解聚酶实验的底物1 。 深红红螺菌胞内的解聚酶，它由一条3 5 k d a 的多肽构成，其最适p h 为9 ，最适温度为 5 0 。此酶对胞外p h b 无活性，但有对硝基酰酯无脂酶、蛋白酶、酯酶活性。深红红螺 菌胞内p h b 解聚酶的克隆基因的序列分析表明该酶与其胞外解聚酶具有高同源性。 从真养产碱菌分离的胞内p h b 颗粒自溶速率相比深红红螺菌粗提物的水解速率低 两个数量级，胞内p h b 解聚酶活性的最适p h 值为7 。目前真养产碱菌的胞内p h b 解聚 酶的d n a 序列已报道“1 。d n a 推导的氨基酸序列( 4 7 3 k d a ) 不含脂酶序列，且与深红 红螺菌内的p h b 解聚酶无相似性。胞内p h b 解聚酶基因敲除变异体自溶活性降低。结论 是该基因部分负责于p h b 转移，而真养产碱菌中存在其它目前还未知的解聚酶同工酶 【4 3 o 目前，已发现脱氮副球菌胞内p h b 解聚酶基因与p h b 合成酶基因p h a c 相邻但方位 相反啪1 。杂合基因表达产物可水解人工蛋白酶及油酸酯处理的p h b 颗粒。d n a 推导的氨 基酸序列与深红红螺菌的胞内p h b 解聚酶无相似性，但与真养产碱菌的胞内p h b 解聚酶 具有高度相似性。 4 2p h b 的胞外降解 胞外降解有两种机制，一种是在无菌条件下水解机制，特别是在碱性条件下。这种 机制对于p h a 在医疗方面的应用( 如作为药物的缓适载体，手术缝线等) 特别重要。另 一种是在自然环境中的酶降解机制。影响胞外p h b 降解的因素较多，包括环境类型，温 度，微生物种群及活力，塑料制品的状态等。通常情况下，p h b 厌氧降解比有氧降解速 率快嘲，y d o i 等哪! 认为在一定范围内p h b 的降解速度与温度正相关，其降解分为两个 阶段：第一阶段，分子量下降；第二阶段，在分子量下降至1 3 0 0 0 后开始腐蚀。高海军 等。2 1 认为p h b 膜越薄，降解速率越高。本实验室的研究表明p h b 的降解首先发生在p h b 表面的非晶部分，当密度低，松散的非晶体部分降解后，p h b 结晶表面形成很多的自由 基端，从而导致p h b 的结晶表面形成非晶过渡层，p h b 结晶逐渐被破坏直至完全降解。 因而p h b 膜的结晶温度高时结晶规整性好，相应的降解速率低”。 4 2 1 胞外p h a 降解菌株 能利用p h b 作为能源的微生物，能在以p h b 作为唯一碳源的培养基中富集。在一定 实验条件下，这种方法能在短时间内富集微生物种类，但这些微生物不一定是自然界中 r 降解p h b 最高效的。一种更适合评估p h b 降解菌株的方法是将生态系统中提取的物质( 比 如活性污泥) 稀释后涂平板，该平板表面铺有一层胞外p h b 颗粒制成的不透明表层。菌 株首先分泌胞外p h b 解聚酶，该酶降解p h b 为水溶性产物，其特征是在菌落周围出现明 显的透明圈。这种方法可在需氧，厌氧或摇瓶条件下进行以选择需氧型、厌氧型或微需 氧型微生物。 遗憾的是仅有部分短链p h a ( p h a s c l ) 如p h b 能制成变性颗粒的乳浊液。许多其他的 p 眦如中等链p l i a ( p 眦。) 形成似胶状聚集体而不能直接运用透明圈法。含有染料的p h a n 的无机盐琼脂平板已成功运用于降解细菌的分离。 各种生态环境如土壤、污泥、堆肥、海水等广泛分布有可降解胞外p h b 的微生物。 最早关于p h b 降解的研究是s c h l e g e l 学院的c h o w d h u r y 于1 9 6 3 年进行的刚，他分离到 一株高效降解p h b 的假单胞菌，遗憾的是该菌株未能得到妥善的保存。之后研究者从环 境中筛选到很多株能降解p h b 的细菌呻卜嘲并进行了深入的研究。p 船降解菌株可根据其 降解聚酯的种类不同而区分。描述过的大多数细菌只能专一性降解p h 或p h a 。刚。但 是有些细菌显现出降解聚酯的广泛性，其可利用广泛的聚酯，包括p m 。及p h a 。此类 细菌可合成不止一种p i a 解聚酶，该解聚酶也可根据底物是p h a 。或p h a 。而区别。 相比之下，对于能降解p f f b 的真菌的研究比较缺乏，而事实上土壤中真菌的生物量 超过细菌并且降解速度快于细菌，它们很可能在降解p h b 的过程中担任重要角色，就如 它们在土壤系统中对于有机物分解占据主导地位一样。因此，对于p h b 降解真菌的研究 正日益得到重视。目前分离到的9 5 种p h b 降解真菌主要是无鞭毛类( a m a s t i g o m y c o t a ) + ”，其所占比例高达9 7 ，其中，担子菌( b a s i d i o m y c o t a ) 、半知菌( d e u t e r o m y c o t a ) 、 子囊菌( a s c o m y c o t i n a ) 、接合菌( z y g o m y c o t a ) 分别占4 8 ，2 7 ，1 9 ，2 ，这 说明高等真菌是环境中p h b 降解菌株的主要组成部分。但是到目前为止，还未能分离到 能降解p h a 。的真菌。本实验室从污泥中分离到1 6 株p h b 降解真菌，经鉴定其中1 4 株 为青霉，1 株为曲霉，一株为毛霉”。 4 2 2 胞外p h a 解聚酶的生化特征 微生物分泌胞外p h b 解聚酶来利用外源性聚合体，酶对r 构型的3 h b 聚酯具有专一 性，其以内式作用于羟基端的第二、三个酯键叫，酶促降解的终产物为仅含单体或单 体、二聚体的混合物或寡聚体的混合物。 许多细菌的p h b 解聚酶己被纯化和鉴定( 细节见表3 ) 。研究最深入的p h a 降解细 菌是勒氏假单胞菌。它属于b 一亚基型蛋白细菌。它在p h a 降解细菌中是独特的，因为 至少7 种胞外p h a 解聚酶( p h a z l 至p h a z 7 ) ，其中6 种可降解胞外p h a ，另外一种胞外 p h a 解聚酶对非晶态p h a 具有专一性，在p h a 水解作用中两种或两种以上的p h a 解聚酶 之间互相合作，它们针对不同链长的分子有不同的底物专一性和k 值。降解菌株中的一 种聚合物水解酶具有几种同工酶，此性质在降解聚合物如纤维素、几丁质中也具有。 而自从1 9 9 1 年b r u c a t o 从绳状青霉( p e n i c i l l i u m u n i c u l o s i l i ba t c c 9 6 4 4 ) 中纯 化到第一个真菌p h b 解聚酶以来”1 ，有1 4 种真菌p h b 解聚酶1 ”被纯化( 细节见表4 ) 。 9 表4 真菌p t t b 解聚酶的生化特征 多数p h b 解聚酶具有以下特征：( 1 ) 相对分子质量较小( 小于7 0 k d a ，大多数的p h a 解聚酶的相对分子质量为3 0 一5 0 i ( d a ) ，并且大部分的解聚酶仅由一条多肽链构成；( 2 ) 稳定性在不同的条件下( 如：p h 、温度、离子强度等) 都比较高；( 3 ) 属于丝氨酸水解 酶家族，会被丝氨酸水解抑制物如二异丙基氟磷酸( d f p ) 或磺酰基衍生物所抑制；( 4 ) 对二硫苏糖醇( d t t ) 敏感，表明活性部位有二硫键的存在，它在酶形成三级结构中起 重要作用；( 5 ) 就目前所知多数酶不与阴离子交换剂结合但与疏水性物质有很强的亲和 力，因此许多纯化方案都包括疏水性层析步骤。 勒氏假单胞菌和真菌的p h b 解聚酶糖基化，含有n 一乙酰葡萄糖胺和葡萄糖。虽然 糖基化作用并不对酶的活性起主要作用，但它能提高胞外酶对高温和其他微生物蛋白酶 水解作用的抵抗能力m 1 。在没有水的条件下( 如在有机溶剂中) p h a 解聚酶能催化相反 的化学反应( 如酯的合成作用) “”。 5 、降解产物一- - p h b 单体 5 1p h b 单体的性质 p h b 单体即3 一羟基丁酸，其分子式为c 。h 8 0 。，分子量为1 0 4 1 0 。3 - 羟基丁酸具有旋 光性。羟基正丁酸的外消旋混合物可以通过相应的马钱子碱盐和番本鳖碱盐分离出具有 光学旋光性的对映体。 1 0 羟基正丁酸的三种异构体都溶予水、乙醇、乙醚和一些普通有机溶剂。在干馏时容 易分解。( 击j ) - 3 - 羟基丁酸( 外消旋) 是单斜晶系的晶体或是具有吸湿性的浆状物， 能随蒸汽挥发m 。 p t i b 是一种能源和碳源贮存复合物，能被许多细菌合成并在细胞中累积，由于微生 物p h b 生物合成酶的立体特异性，p h b 中的3 羟基丁酸均是( r ) 一( 一) 一构型。最近在 发酵技术上的改进允许p h b 产物在高产的同时提高浓度，同时也使( r ) 一( 一) - 3 羟基 丁酸的经济生产成为可能性。 p h b 水解后得到3 一羟基丁酸单体，可作为有机合成的原料，制备手性衍生物。3 一 羟基丁酸有两种功能团，羟基和羧基，这个分子第3 碳原子是手性中心，存在两种光学 异构体，( r ) 一( 一) 一构型和( s ) 一( 一) 一构型。( r ) 一( 一) - 3 羟基丁酸可被用来作合 成碳青霉烯的起始原料，碳青霉烯在b 一内酰胺抗生素中显示了显著的保守性。同时， ( r ) 一( 一) 一3 羟基丁酸可作为合成许多精密化学物质的手性构建体，因为它有许多优 点，包括容易修饰其功能团和易引进新的手性中心。羟基丁酸的物理性质见表5 。 表5羟基丁酸的物理性质 已报道有机酸的测定方法有酶法、分光光度计法、荧光法、气象色谱法和离子交换 色谱法、离子排斥色谱和反相分配色谱等高效液相色谱法盯7 1 。对p h b 单体的分析方法， 国外主要有酶法、分光光度计法、气相色谱法以及液相色谱法等。文献臼8 1 中对p h b 降解 产物中的单体和二聚体等用液相色谱法分离检测，本实验在此基础上，改进液相色谱条 件，从而定性定量分析p h b 单体。 6 、本论文的工作目的 目前，关于p h b 的研究已成为国内外生物材料