（微生物学专业论文）灰色链霉菌rx17产β14n6o二乙酰胞壁质酶基因的克隆、表达和耐酸性分子改造.pdf

山东大学博士学位论文 缩略词表 a b b r i v i a t i o n s 1 4 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名孓：塑丰 日期：2 咝! f ! ? ! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 一一7 ，1 论文作者签名： i 重：墅虱 导师签名：e l 期：兰坚：= ! ! 垄 山东大学博士学位论文 摘要 在添加了变形链球菌的双层平板上，筛选到一株高产溶菌酶的灰色链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sg r i s e u s ) r x - 1 7 ，经过c ms e p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换层析以后 得到两个p 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶组分，通过g e n b a n k 数据库中已知的由球 孢链霉菌所产生的p 1 ，4 - n ，6 - o 一二乙酰胞壁质酶m 1 序列进行比对，找出同该酶 同源性最高的5 0 个序列，而后对这5 0 个序列进行比对，找出b 1 ，4 n ，6 o 二乙 酰胞壁质酶最保守的两个短氨基酸序列，同时根据链霉菌基因组碱基构成的特点 使用互联网引物设计程序设计了c o d e h o p ( c o n s e n s u s d e g e n e r a t eh y b r i d o l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r s ) 引物，并成功克隆出了p - 1 ，4 - n ，6 一o 二乙酰胞壁质酶i 也 保守区基因序列，进而通过t a i lp c r 扩增出了全长基因序列。对b 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶i 也在大肠杆菌中进行了表达，分别使用了p e t - 2 8 a ( + ) 、p b v 2 2 0 、 p g e x 4 t 1 、p m a l - c 2 e 以及p e t - 2 6 b ( + ) 等表达质粒，以及b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 、 r o s e t t a ( d e 3 ) 、r o s e t t a g 删t m ( d e 3 ) 等宿主菌，结果表明，在p e t - 2 8 a ( + ) 、p b v 2 2 0 中进行表达，无论使用哪种宿主菌，通过任何方法都无法检测到生物活性亦无法 通过s d s p a g e 检测到明显的蛋白条带，这说明目的蛋白没有表达，可能是由 于p 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶本身对于大肠杆菌是一种毒性蛋白，因此抑制了 酶的表达。使用p g e x 4 t - 1 进行融合表达，通过s d s p a g e 发现能够得到大量 的表达，然而表达产物以错误折叠无生物活性的包涵体形式存在于细胞内，仅有 少量可溶性表达，将可溶性部分通过g s tb i n dr e s i n 进行分离纯化，并经过凝血 酶切割，仍然无法得到具有生物活性的表达产物，这可能是因为可溶性表达的蛋 白量过少或者蛋白是错误折叠的无活性分子。使用p m a l c 2 e 融合表达载体成 功表达出可溶性的p 1 ，4 一n ，6 一o 一二乙酰胞壁质酶，经过a m y l o s er e s i n 纯化并用 肠激酶切除融合标签以后能够得到具有生物活性的酶蛋白。通过测定发现重组酶 r 2 最适作用p h 同由灰色链霉菌所产的野生型p 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶r 2 8 山东大学博士学位论文 相同，均为7 0 左右，最适作用温度约为5 0 c ，较野生型3 - 1 ，4 _ n ，6 - 0 - - - 7 , 酰胞 壁质酶i 也低，然而在3 7 。c 的酶活却比野生型酶有明显提高。使用p e t - 2 6 b ( + ) 质粒在b l 2 l ( d e 3 ) p l y s s 能得到少量在周质空间表达的有生物活性的酶蛋白，但 是通过s d s p a g e 和比浊法都无法检测到酶活，仅能通过诱导表达后大肠杆菌 宿主菌发生自身降解以及琼脂平板扩散法检测到活性，这可以作为后续突变中的 筛选方法。 由于b 1 ，4 - n ，6 。o 一二乙酰胞壁质酶具有水解变形链球菌的能力，同时对于龋 齿的防治具有较好的效果，因此具有潜在的应用价值。然而口腔中的微酸性环境 却不利于酶作用的充分发挥，为了能够提高酶分子在微酸性条件下的活性，需要 对酶进行耐酸性的改造。根据已知的天蓝色链霉菌所产的c e l l o s y l 的晶体结构， 确定了酶的活性中心位于9 - a s p 、9 8 a s p 和1 0 0 g l u ，因此选取了在空间结构中 靠近活性中心氨基酸同时又不参与任何底物结合于催化反应的1 8 3 g i n 作为定点 突变的对象，突变的结果表明将其突变为g l u ，最适作用p h 发生了酸移，而将 其突变为a l a ，最适作用p h 未发生改变，将其突变为l y s 以后，酶活完全丧失。 另外由于6 2 t y r 和1 3 8 f y r 同样位于活性中心区域附近，同时保守性较高，因此 又对酶的1 3 8 t y r 和6 2 t y r 再加上1 8 3 一g l n 进行了三点饱和突变，结果表明在选 取的2 0 0 个饱和突变体中大多数酶活丧失，在酶活仍存留的突变体中仅有5 个发 生了最适作用p h 酸移，大部分最适p h 没有发生改变。经过测序表明，6 2 位t y r 和1 3 8 位t y r 的突变对于改变酶的最适作用p h 方面没有太大影响，t y r 突变为 多种氨基酸仅对酶的空间结构发生了影响，而1 8 3 位g i n 的突变则影响了酶的最 适作用p h ，在获得的5 个最适作用p h 酸移的突变体中有4 个g i n 均突变为酸 性氨基酸，还有一个突变为s e t ，同定点突变的结果是一致的。这说明突变后的 酸性氨基酸能够提供质子，从而影响活性中心区域氨基酸的解离，使得酶的活性 中心氨基酸p i c a 值发生改变，最终导致最适作用p h 发生变化。 对灰色链霉菌r x 1 7 基因组中另一个b 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶组分r 5 也进行了克隆。在已经得到的c o d e h o p 引物5 末端添加抑制序列的方法设计 出同源抑制p c r 的引物h r p p ( h o m o l o g o u sr e s t r a i n tp c rp r i m e r ) ，并进行了同 9 山东大学博士学位论文 源抑制p c r 扩增出了其保守区域，进而通过附lp c r 得到其基因全长。r 5 基 因全长8 2 5 b p ，经过比对，r 2 基因同r 5 基因同源性为7 9 ， r 5 基因翻译成的 蛋白序列经过s i g n a l p 服务器分析为典型分泌型蛋白。通过构建的进化树分析表 明，r 2 和r 5 两种酶蛋白的亲缘性较远，同一个菌株所产的同一种类型的酶却有 着较大的差距。按照信号肽预测软件的结果，对p 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶r 5 的成熟肽基因使用p m a l c 2 e 进行了表达，最终得到具有活性的表达产物。重 组b 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶r 5 的最适作用p h 为7 0 ，最适作用温度为7 0 。 关键词：p 1 ，4 - n ，6 - o - 二乙酰胞壁质酶；蛋白质工程；克隆与表达；定点突变； 饱和突变 1 0 山东大学博士学位论文 a b s t r a c t a s t r e p t o m y c e sg r i s e u sr x - 17w h i c hp r o d u c eh i g ha m o u n to fl y s o z y m ew a s i s o l a t e df o r ms o i lb yd o u b l el a y e rp l a t ec o n t a i n i n gs t r e p t o c o c c u sm u t a n s s o m e 3 - 1 ，4 - n ，6 - o d i a c e t y l m u r a m i d a s ec o m p o n e n t sw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e da f t e rc m s e p h a r o s ef a s tf l o wi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y i no r d e rt oi s o l a t et h eg e n e so f t h e s e1 3 - 1 ，4 - n ，6 - o d i a c e t y l m u r a m i d a s ec o m p o n e n t s ，c o n s e n s u s - d e g e n e r a t eh y b r i d o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s ( c o d e h o p ) w e r e d e s i g n e d ak n o w n p 一1 ，4 - n ，6 一o - d i a c e t y l m u r a m i d a s ep r o t e i ns e q u e n c en a m e dm 1i nt h eg e n b a n kw a s s e l e c t e dt os u b m i t t e dt ob l a s tp r o g r a mt og e t5 0m o s th o m o l o g o u sp r o t e i ns e q u e n c e s a f t e ra l i g n e do ft h e s e5 0s e q u e n c e s ，t w om o s tc o n s e r v e ds h o r ta m i n oa c i ds e q u e n c e s w a sd e t e r m i n e d m e a n w h i l e ，c o d e h o pp c rp r i m e r s ( c dp r i m e r s ) w e r ed e s i g n e d b a s e do nt h ec h a r a c t e r i s t i co fb a s ei nt h eg e n o m i cd n ao f s t r e p t o m y c e sb ya ni n t e r n e t d a t a b a s e p r o g r a m t h e c o n s e r v e d r e g i o n o f g e n e o fa 8 - 1 ，4 n ，6 - o - d i a c e t y l m u r a m i d a s ec o m p o n e n tn a m e dr 2w a sa m p l i f i e da n di s o l a t e d t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r ( t a i lp c r ) w a s p e r f o r m e dt og e tt h ew h o l e s e q u e n c eo fr 2g e n e e x p r e s s i o no fp 1 ，4 - n ，6 - o d i a c e t y l m u r a m i d a s er 2g e n ew a s p e r f o r m e di ne s c h e r i c h i ac o l i w eu s e ds u c hp l a s m i d sa sp e t - 2 8 a ( + ) ，p b v 2 2 0 ， p g e x 一4 t - 1 、p m a l c 2 ea n dp e t - 2 6 b ( + ) ，a n dt h eh o s tc e l lw a sb l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s ， r o s e t t a ( d e 3 ) a n dr o s e t t a g a m i n ( d e 3 ) t h er e s u l ts h o w e dt h a tn oe x p r e s s i o nw a s d e t e c t e du s i n gp l a s m i d sp e t - 2 8 a ( + 1o rp b v 2 2 0 f u s i o ne x p r e s s i o nu s i n gp g e x 一4 t - 1 s h o w e dt h a to b v i o u sp r o t e i nw a sd e t e c t e db ys d s p a g e ，b u tn e a r l ya l lt h ef u s i o n p r o t e i nw a si nt h ef o r mo fi n f u s i o nb o d y , w h i c hh a dn ob i o l o g i c a la c t i v i t y ；o n l yaf e w f u s i o np r o t e i nw a ss o l u b l e t h ep u r i f i c a t i o no ff u s i o np r o t e i nw a sp e r f o r m e db yg s t b i n dr e s i n t h ep u r i f i e dp r o t e i nw a sd i g e s t e db yt h r o m b i n ，t h e r ew a ss t i l ln oe n z y m e 山东大学博士学位论文 a c t i v i t yw a sd e t e c t e d i ti sm a y b et h ee r r o rf o l d i n go ft h es o l u b l ef u s i o np r o t e i nt h a t l e a d st ot h en oa c t i v i t yo ft h ee x p r e s s e dp r o t e i n t h ep r o d u c to fe x p r e s s i o nu s i n g p l a s m i dp m a l - c 2 ew a sp u r i f i e db ya m y l o s er e s i na n dc l a v e db ye n t e r o k i n a s e ，a n d i tc o u l db ed e t e c t e dt h a tt h ef i n a lp r o d u c th a db i o l o g i c a la c t i v i t y t h eo p t i m u mp ho f r e c o m b i n a n t1 3 - 1 ，4 - n ，6 - o d i a c e t y l m u r a m i d a s ew a st h es a m ea st h ew i d et y p e ，w h i c h w a sa r o u n d7 0 t h e o p t i m u mt e m p e r a t u r e o fr e c o m b i n a n t b - 1 ，4 n ，6 - o - d i a c e t y l m u r a m i d a s er 2w a sa r o u n d5 0 c ，w h i c hi sl o w e rt h a nt h ew i d e t y p e b u tt h ea c t i v i t yo fr e c o m b i n a n te n z y m eo n37 cw a sm u c hh i g h e rt h a nt h ew i d e t y p e t h ee x p r e s s i o ni nb l 21 ( d e 3 ) p l y s sw i t hp l a s m i dp e t - 2 6 b ( + ) w a sw e a ka n dt h e p r o d u c t i o nh a db i o l o g i c a la c t i v i t yi nt h ep e r i p l a s m i cs p a c e b u ti tw a su n d e t e c t a b l e f o rt h ee x p r e s s i o n p r o d u c t i o nb ys d s - p a g eo rt h em e a s u r e m e n to fa c t i v i t yb y t u r b i d i m e t r y b u tt h ee n z y m ea c t i v i t y c a nb ed e t e c t e db ym e a n so fa g a rp l a t e d i f f u s i o n sa n dd i r e c t e do b s e r v a t i o no ft h ed e c r e a s eo ft h ed e n s i t yo fh o s tc e l l sa f t e r i n d u c t i o no fi p t g ； 1 3 - 1 ，4 - n ，6 - o d i a c e t y l m u r a m i d a s e h a st h e a b i l i t y t od e c o m p o s e s t r e p t o c o c c u s m u t a n s ，a n di th a sg o o de f f e c to nt h ep r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to fd e n t a lc u r i e s b u t t h ew e a ka c i d i co r a lm i c r o e n v i r o n m e n t w a sn o ts u i t a b l ef o rt h e b 1 ，4 - n ，6 一o - d i a c e t y l m u r a m i d a s et op l a y i t sr o l e s om o l e c u l a rm o d i f i c a t i o nw a s p e r f o r m e dt oc h a n g et h eo p t i m u mp ho f1 3 - 1 ，4 - n ，6 o d i a c e t y l m u r a m i d a s ei no r d e r t o m e e tt h eo r a le n v i r o n m e n t t h e c a t a l y t i c a l l y a c t i v er e s i d u e so f 1 3 - 1 ，4 - n ，6 一o - d i a c e t y l m u r a m i d a s e w e r ea s p 一9 ，a s p 一9 8 ，a n dg l u - 10 0 ，w h i c hw a s r e p o r t e db yt h ea n a l y s i so ft h ec r y s t a ls t r u c t u r eo f8 - 1 ，4 - n ，6 - o - d i a c e t y l m u r a m i d a s e c e l l o s y lp r o d u c e db ys t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r t h e18 3 一g i nw a ss e l e c t e dt ob et h e t a r g e tr e s i d u ef o rt h es i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s b e c a u s ei t l i e sn e a rt h ec a t a l y t i c a l l y a c t i v er e s i d u e s ，a n dd o e sn o tt a k ep a r ti nt h es u b s t r a t eb i n d i n gn o rt h ec a t a l y s i s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg i n l8 3 g l um u t a t i o ns h i f tt h eo p t i m u mp ht oa c i d i cd i r e c t i o n t h em u t a t i o ng i n l8 3 a l ad i dn o tc a u s ea n yc h a n g e st ot h eo p t i m u mp ho f t h ee n z y m e 1 2 山东大学博士学位论文 t h em u t a t i o ng l n l8 3 l y sb r o u g h tac o m p l e t ev a n i s ho fp r o t e i na c t i v i t y a n o t h e rt w o a m i n oa c i d sw e r es e l e c t e dw i t h18 3 g l nt o g e t h e rt op e r f o r ms a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t6 2 t y ra n d138 t y rp l a y e dl i t t l ee f f e c to nt h eo p t i m u mp ho f t h ee n z y m e t h em u t a t i o no f6 2 t y ra n d13 8 t y rc h a n g e dt h es p a t i a ls 仃u c 眦o ft h e a c t i v ec e n t e ro ft h ep r o t e i nm o l e c u l a r ，b u tt h e r ew a sn oo b v i o u sc h a n g eo fe l e c t r i c c h a r g e i ti st h es a m e t ot h es i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i st h a t18 3o l np l a y e da ni m p o r t a n t e f f e c to nt h eo p t i m u mp ho ft h ee n z y m ec a t a l y s i s t h ea c i d i ca m i n oa c i da f t e r m u t a t i o nc o u l db et h ep r o t o nd o n o rw h i c hp r o v i d e d t h a tc h a n g e st h ep k ao ft h e a c t i v ec e n t e rr e g i o n ，s ot h eo p t i m u mp ha l t e r e d t h eg e n eo fa n o t h e rp - 1 ，4 - n ，6 - o - d i a c e t y l m u r a m i d a s ec o m p o n e n tn a m e dr 5w a s i s o l a t e db yan o v e lp c rp r o t o c o lc a l l e dh o m o l o g o u sr e s t r a i n tp c r ( h r p c r ) t h e p r i m e r so ft h i sp c r ( h r p p ) w e r ed e s i g n e dt oa d d ar e s t r i c t i o ns e q u e n c eb e f o r et h e5 e n d so fc d p r i m e r s a f t e rt w os t e p sa m p l i f i c a t i o n ，t h ec o n s e r v e dr e g i o no fr 5g e n e w a si s o l a t e d ，a n dt h ew h o l eg e n ew a sg o tb yt a i lp c r t h ew h o l eg e n eo fr 5 p r o t e i nw a sc o m p o s e do f8 2 5n u c l e o t i d e s t h eh o m o l o g yo f t h e s et w og e n e sw a so n l y 7 9 t h ep r o t e i ns e q u e n c eo fr 5w a ss u b m i t t e dt os i g n a l p 3 0s e r v e rt op r e d i c 萨t h e s i g n a lp e p t i d e s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ep r o t e i nw a sat y p i c a ls e c r e t o n e t h e p h y l o g e n e t i c t r e es h o w e dt h a t t h e g e n e t i cr e l a t i o n s h i p o f p 1 ，4 - n ，6 o d i a c e t y l m u r a m i d a s ep r o t e i n sr 2a n dr 5p r o d u c e db yr x 一1 7w a sq u i t e l a r g e t h ee x p r e s s i o no ft h em a t u r ep e p t i d eg e n ew h i c hw a sb a s e do nt h es i g n a l p 3 0 s o f t w a r eo fp 1 ，4 - n ，6 0 d i a c e t y l m u r a m i d a s er 5w a sp e r f o r m e du s i n gp m a l 。c 2 e ， a n df i n a l l yt h ep r o d u c tw i t hb i o l o g i c a la c t i v i t yw a sg o t t h eo p t i m u mp ho f r e c o m b i n a n t 3 - 1 ，4 n ，6 o d i a c e t y l m u r a m i d a s e r 5w a s7 0a n dt h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ew a s7 0 k e yw o r d s ：1 3 - 1 ，4 n ，6 o d i a c e t y l m u r a m i d a s e ，p r o t e i ne n g i n e e r i n g ，c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n ，s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，s a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s 1 3 山东大学博士学位论文 灰色链霉菌r x - 17 产1 3 - 1 ，4 - n 。6 0 一二乙酰胞壁质酶基因的克 隆、表达和耐酸性分子改造 第一章前言 溶细菌酶，又称细菌细胞壁水解酶，是一类水解细菌细胞壁肽聚糖酶的总称 【1 1 。根据酶水解细胞壁肽聚糖位置的不同，肽聚糖水解酶主要分为三类，n 乙酰 胞壁质酶科a c e t y l m u r a m i d a s e ) 【2 1 ，n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶 ( n a c e t y l m u r a m y l l a l a n i n ea m i d a s e ) 3 1 ，内肽酶( e n d o p 印t i d a s e ) 【4 1 。n 乙酰胞壁质 酶主要作用于细菌细胞壁肽聚糖的n 乙酰葡萄糖胺与n 乙酰胞壁酸之间的p 1 ，4 糖苷键，n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶主要作用于n 乙酰胞壁酸与四肽侧链之 间的酰胺键，内肽酶则作用于四肽侧链中四个氨基酸之间的肽键。几种酶的作用 位点见图1 1 。 、 n a c e t y i m u r a m i d a s e e n d o p e p t i d a s e u n - a c e t y l m u r a m i d a s e d g i u i 、i s( g i y ) 5 ：f s 一。乜喘转一 。上a 图1 1 各种溶细菌酶的作用位点 f i g u r e1 1t h ea c t i o ns i t eo fa l lk i n d so fl y s o z y m e s 脚i 斜l ，一 山东大学博士学位论文 n 乙酰胞壁质酶是通常狭义的溶菌酶，在自然界中分布广泛，从细菌 噬菌体、细菌、真菌到植物以及高等哺乳动物，都有该种酶的存在，其在生 物体抵御外来微生物侵染方面发挥了关键作用，成为生物体自身防护体系的重要 组成部分。n 乙酰胞壁质酶可以分为4 类1 5 ，4 种类型的典型代表分别为鸡卵清 溶菌酶( h e ne g g - w h i t el y s o z y m e ，h e w l ，c 型) 、鹅卵清溶菌酶( g o o s ee g g - w h i t e l y s o z y m e ，g e w l ，g 型) 、细菌噬菌体t 4 溶菌酶( b a c t e r i o p h a g et 4l y s o z y m e ， t 4 l ，t 型) 及拟内串生孢霉溶菌酶( c h a l a r o p s i sl y s o z y m e ，c h l ，c h 型) 。 以鸡卵清溶菌酶为代表的c 型溶菌酶，在自然界中分布最为广泛，研究和应 用也最为深入，其中鸡卵清溶菌酶长期以来一直被作为一种“模型”对象 6 】【刀， 用于蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系等方面的 研究【8 】，鸡卵清溶菌酶分子量为1 4 ，3 0 7 d a ，等电点为1 1 1 ，由1 2 9 个氨基酸构成， 酶分子中二硫键和t r p 含量较高，该酶的g l u 3 5 、a s p 5 2 被认为是酶催化中心 的必需氨基酸【9 】【10 1 。它具有胞壁质酶和壳聚糖酶两种活性，可以以肽聚糖和几丁 质等物质作为底物【1 1 j ；鹅卵清溶菌酶最早由c a n f i e l d 发现 1 2 j ，与c 型溶菌酶轻度 同源，g 型溶菌酶仅存在于少数几个物种中，如黑天鹅、鸵鸟等【l3 1 ，分子量为 2 0 ，5 0 0 d a ，由18 5 个氨基酸构成，鹅卵清溶菌酶的g l u 7 3 、a s p 8 6 可能与鸡卵 清溶菌酶的g l u 3 5 、a s p 5 2 同源”1 6 1 ，但是鹅卵清溶菌酶不具有壳聚糖酶活性 1 7 1 ；t 4 噬菌体溶菌酶存在于很多噬菌体内，在噬菌体侵入细菌以及成熟的噬菌 体释放的过程中起到重要的作用，在氨基酸序列上与c 型溶菌酶同源性很低【1 8 】， 酶蛋白由1 6 4 个氨基酸构成，分子量为1 8 ，7 0 0 d a ，g l u 1 l 和a s p 2 0 被认为是t 型溶菌酶的催化中心氨基耐1 9 1 。 1 3 - 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶即拟内串生孢霉溶菌酶( c h 型) ，是n 乙酰胞 壁质酶的一种，同鸡卵清溶菌酶的不同之处在于它除了b 1 ，4 - n 乙酰胞壁质酶活 力外，还具有d 1 ，4 n ，6 0 二乙酰胞壁质酶活力，能够降解细胞壁结构中n 乙酰 胞壁酸6 位羟基氧原子被乙酰化的微生物 2 0 l ( 如图1 2 ) ，例如普通溶菌酶无法 作用的导致龋齿等口腔疾病的变形链球菌、导致化脓性感染和食品腐烂的金黄色 葡萄球菌等，具有比溶菌酶更广泛的溶菌谱( 见表1 1 ) ，但是它不具有壳聚糖酶 1 6 山东大学博士学位论文 活性，不能以几丁质为底物【2 0 1 ，但是它仍具有非常重要的潜在应用价值。 n a g n h a c o c l e a v a g e 图1 2p 一1 ，4 - n ，6 - 0 - 二乙酰胞壁质酶的作用底物 图中n a m6 位羟基氧原子被乙酰化，例如金黄色葡萄球菌的细胞壁 f i g u r e1 2s u b s t r a t eo 邛一1 ，4 - n ，6 - 0 一d i a c e t y l m u r a m i d a s e t h e6 - 0 a c e t y l a t e db a c t e r i a lp e p t i d o g l y c a n , e g o fs t a p h y l o c o c c u st 2 e u s ，i ss h o w n 表1 ip - 1 ，4 - n ，6 一o - 二乙酰胞壁质酶的溶菌谱 t a b l e1 1t h el y s i ss p e c t r u mo fb 1 ，4 j n ，6 - 0 一d i a c e t y l m u r a m i d a s e 溶壁微球菌 a s l 2 6 7 金黄色葡萄球菌 a s1 2 8 2 藤黄八叠球菌a s i 1 9 3 乳脂链球菌 a s l 9 粪链球菌 a s l 1 0 1 枯草芽胞杆菌 a s l 3 3 8 a s l 8 8 球形芽胞杆菌a s l 9 3 0 短小芽胞杆菌a s i 9 4 0 1 7 伽 o m o 6 6 勰 弘 坦 o 0 2 i ； 6 5 m 拗 。 兰； 酷 螺 m 叭 跖 山东大学博士学位论文 1 1 、b - 1 ，4 n ，6 0 _ 二乙酰胞壁质酶的研究背景 第一个被发现的b 1 ，4 n ，6 0 二乙酰胞壁质酶是来自霉菌c h a l a r o p s 括的c h 酶【2 l j 。1 9 6 3 年，h a s h 等在分解金黄色葡萄球菌时，发现了c h a l a r o p s i s 产生的 、c h 酶。该酶是一种中性蛋白质【2 2 】【2 3 1 ，分子量2 2 ，4 1 5 d a ，等电点为7 5 3 ，能充分 分解金黄色葡萄球菌、粪链球菌、白喉棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌、 溶壁微球菌等菌体。1 9 7 5 年，f e l c h 等对c h 酶的一级结构进行了测定：它由2 1 1 个氨基酸残基组成，n 末端氨基酸为t h r ，c 末端氨基酸为g l y ，分子内有个 二硫键，同其他类型的胞壁质酶没有同源性，属于新型的溶菌酶类型【2 4 】【2 5 1 。 此后，来自球孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg l o b i s p o r u s ) 的m 1 酶【2 6 】【2 刀，来自天 蓝色链霉菌( s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r ) 的c e l l o s y l ，来自丙酮丁醇梭茵( c l o s t r i d i u m a c p t o b “叫纪“聊) 的溶菌酶【2 8 】【2 9 1 以及肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ) 噬菌 山东大学博士学位论文 体c p 、乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s ) 噬菌体m v l 【3 0 】和q ) a d l a 产生的溶菌酶等也陆续被 发现和研究。 1 1 1 、链霉菌产1 3 - 1 。4 - 1 t 6 - 0 一二乙酰胞壁质酶的研究历史 链霉菌是产生抗生素种类最多的微生物属，其溶菌酶的研究也早就开始了， 1 9 3 6 年，w e l s c h 等人首次从土壤中分离出了可以产生溶菌酶的白色链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sa l b u s ) g 菌株【1 1 ，其产生的溶菌酶能够溶解金黄色葡萄球菌，上 世纪五十年代以后，国际上有关链霉菌溶菌酶的报道层出不穷，由于其大部分属 于c h 型溶菌酶，因此受到了广大学者的青睐。 目前研究最多的当属球孢链霉菌，其产生的变溶菌素( m u t a n o l y s i n ) 已经成 为一种普遍应用的工具酶，并已经商业化生产【3 l 】，1 9 7 2 年日本学者y o k o g a w a 首次发现了球孢链霉菌1 8 2 9 菌株可以产生变溶菌素，并且能够溶解变形链球菌， 该学者对其发酵液酶组分进行了分离，发现一种p 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶 m 1 ，另外还有三种非p 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶成分。 白色链霉菌g 菌株所产的溶菌酶中研究较多的是3 2 酶和f 1 酶，均属于 p l ，4 - n ，6 o - - 7 , 酰胞壁质酶。在灰色链霉菌所产的d 一1 ，4 - n ，6 一o 一- - 7 , 酰胞壁质酶 研究中，s 3 5 菌株可以产生一种p 1 ，4 - n ，6 o - - 7 , 酰胞壁质酶，但是同其他类型 的d 1 ，4 n ，6 。o - - 7 , 酰胞壁质酶不同之处在于它不能作用于溶壁微球菌。w a r d 等 人在1 9 6 8 年发现一株灰色链霉菌产生两种p 1 ，4 - n ，6 o 二乙酰胞壁质酶，分子量 分别为1 1 ，8 0 0 d a 和1 3 ，5 0 0 d a 。1 9 8 8 年z i n k e v i c h i u t e 等人从一株灰色链霉菌中分 离出一种溶菌酶，它的溶菌谱较窄，但是对链球菌和葡萄球菌具有较高的活性 【3 2 1 。 1 1 2 、1 3 - 1 4 - n ，6 0 - 二乙酰胞壁质酶分子生物学研究 1 9 9 0 年，l i c h e n s t e i n 等人对s t r e p t o m y c e sg l o b i s p o r u s 的m 1 酶基因( a c m ) 进行了克隆、测序【3 3 1 ，发现a c m 基因以a t g 起始，其后为8 8 5 个核苷酸的开放 读码框架，在其翻译的2 9 4 个氨基酸中，前7 7 个为前导肽区域，负责酶的成熟 山东大学博士学位论文 肽部分穿膜。n 端第9 - 1 3 个氨基酸残基区域为一a r g 簇，接下来在1 4 2 3 位为 一疏水区，在2 4 7 7 位含有很多切割位点，可能是信号肽的切割处。在基因末端 的终止密码子t g a 下游有一个1 5 b p 的反向重复序列，负责a c m 基因的转录中 止。与链霉菌的基因特点相符，a c r e 基因g + c 达到7 1 4 ，且三连密码子的第 三位有9 7 2 的为g 或c 。氨基酸序列分析表明它与c h 酶最为接近，相似性为 4 7 3 ，分子中有一个二硫键。2 0 0 1 年s e o 等【3 4 1 研究了来自s t r e p t o m y c e s g l o b i s p o r u s 的m 1 酶基因在大肠杆菌中的表达，他采用周质空间的表达方式，得 到了有生物活性的成熟肽酶蛋白，然而其表达量非常低，大量的发酵液仅能够得 到非常微量的目的蛋白，这可能同b 1 ，4 n ，6 0 二乙酰胞壁质酶对宿主菌的毒性 有关。c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m a t c c 8 2 4 的胞壁质酶基因咖于19 91 年克隆测 序1 3 5 】，该基因全长9 7 1 b p ，编码3 2