（微生物学专业论文）酸性植酸酶产生菌的筛选及其基因克隆.pdf

西南农业大学硕士研究生论文 摘要 植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶，它能够解除动物 植物性饲料中植酸的抗营养作用，提高植物性饲料的营养价值，因而受到国内外广泛 关注，尤其是微生物所产生的酸性植酸酶。但微生物野生菌株产酶水平较低，制约了 微生物植酸酶在生产上的广泛应用，因此提高植酸酶野生菌株的产酶水平是实现其广 泛应用的关键所在。目前，提高野生菌株产酶水平的主要思路是通过基因工程手段克、 隆其植酸酶基因，然后在生物反应器中高效表达该植酸酶基因。才g 实验的目的旨在从k 土壤中筛选出酸性植酸酶高产菌株，并克隆其植酸酶基因，从而为植酸酶的基因工程 提供基因材料。；主要实验结果如下： 1 用植酸钙选择性平板培养基从土样中筛选出了1 0 2 株能产透明圈的菌株，经分 离纯化后，接入液体发酵培养基，2 8 、2 2 0 r m i n 发酵5 天，在3 7 、p h 2 5 条件下 用钒钼酸铵法测定其所产植酸酶的活力，结果显示，酶活较高的有2 4 株，经再次摇瓶 复筛后，酶活大于1 5 u m l 且产酶性能稳定的共有7 株，其中以l 矿菌株的酶活最高， 可达5 3 8 6 u m l ，经初步鉴定为黑曲霉，编号为a s p e r g i l l u s n i g e r l 。 2 用氯化苄法提取了a s p e r g i l l u s n i g e r l 4 4 基因组d n a ，根据g e n eb a n k 中已知的 黑曲霉植酸酶基因序列设计出一对特异性引物( 上游引物： 5 7 a t a g g c a t c a t g g g c g t c t c37 下游引物：5 7 c a g c t a a g c a a a a c a c t c c g c 37 ) ，采用p y r o b e s t d n ap o l y m e r a s e ( 高保真d n a 聚合酶) ，通过p c r 方法从 a s p e r g i l l u s n i g e r l 4 “基因组d n a 中扩增出了预期的1 5 k b 左右的特异性产物，将其与 p m d l 8 一tv e c t o r 连接后，转化e c o l f f 3 h 5 a 菌株的感受态细胞，经质粒抽提、酶切鉴定， 确认该目的产物已得到成功克隆。 3 核苷酸序列分析表明，p c r 扩增产物中包含有完整的p h y a 基因，该基因全长 1 5 0 6 b p ，其中包含一段长1 0 2 b p 的内含子，该内含子具有真菌植酸酶基因内含子的特 征保守序列：d o n o r 序列- g n 盯g c ，l a r i a t 序y o - - g c t g a c 及a c c e p t o r 序列一c a g 。 该基因编码4 6 7 个氨基酸，理论分子量为5 l3 7 k d a ，其上有13 个潜在的 n 一糖基化位点，n 端1 9 个氨基酸为信号肽序列，植酸骑活性位点序列 ( c r v t f a q v l s r h g a r y p t d s k g k ) 位于氨基酸序列的+ 7 1 + 9 3 。 4 序列比较结果显示，本研究克隆的p h y a 基因与a n i g e r n r r l 3 1 3 5 、an i g e r 5 k 。5 7 和a n i g e r n 2 5 的p h y a 基因的同源性分别是9 6 、9 6 和9 2 ，编码的氨基酸序列同 源性分别为9 8 1 0 、9 5 7 0 和9 7 9 0 。k ，一 关键词：酌啦植酸酶 菌株筛选基因克隆 。_ _ _ _ 一。一。- m _ ， l 酸性植酸酶产生菌的筛选及其基因克隆 t h e s c r e e n i n g o fa na c i d i c p h y t a s e p r o d u c i n g s t r a i n a n dt h e c l o n i n go f i t sp h y t a s eg e n e m a l i p i n g ( c o l l e g eo f a n i m a l a n dv e t e r i n a r ys c i e n c e ，s o u t h w e s ta g r i c u l t u r eu n i v e r s i t yc h o n g q i n g4 0 0 7 l6 j a b s t r a c t p h y t a s ei s ak i n do fe n z y m e sw h i c hc a r l c a t a l y z et h eh y d r o l y s i so fp h y t a t e i n t o m y o i n o s i t o l a n d p h o s p h a t e i t c a l lr e l i e v ea n t i n u t r i t i o no fp h y t a t ea n d i m p r o v et h e n u t r i t i o n a lv a l u eo fa n i m a lf e e df r o mp l a n t ，t h es t u d yo np h y t a s e ，e s p e c i a l l ya c i d i cp h r a s e p r o d u c e db ym i c r o o r g a n i s m ，i sp a i dm u c h a t t e n t i o nb ys c i e n t i s t si no u rc o u n t r ya n da b r o a r d h o w e v e r i t sw i d ea p p l i c a t i o n si nm a n u f a c t u r ea r er e s t r i c t e db ys u c haq u e s t i o na sl o w p h y t a s e p r o d u c i n gl e v e lo f w i l ds t r a i n s ，s ob e f o r et h ew i l ds t r a i n sw h i c hc a n p r o d u c e a c i d i c p h y t a s ea r ew i d e l yu s e d ，t h e i rp h y t a s ea c t i v i t i e sm u s tb ei m p r o v e db yv a r i o u sm e a n si n w h i c hu s i n ga ne f f i c i e n te x p r e s s i o ns y s t e mt o e x p r e s sh e t e r o g e n o u sp h y t a s e i sam a i n c o n s i d e r a t i o n t h eo b j e c t i v eo ft h i sr e s e a r c hi st os c r e e no u tt h es t r a i nw h i c hc a np r o d u c e a c i d i cp h y t a s ea th i g h e rl e v e la n dc l o n ei t s p h y t a s eg e n e ，t h e r e b yp r o v i d i n gt h eg e n eo f i n t e r e s tf o r g e n e t i ce n g i n e e r i n go np h y t a s e m a i n r e s u l t so f t h i sr e s e a r c ha r ea sf o l l o w e d ： 1 t h e1 0 2s t r a i n sw h i c hc a np r o d u c eh y d r o l y z e dc i r c l e sw e r eo b t a i n e du s i n ga l t e r n a t i v e m e d i u mc o n t a i n i n gp h y t a t e c a l c i u m a f t e rb e i n gi s o l a t e da n dp u r i f i e d ，t h e s es t r a i n sw e r e i n o c u l a t e di n t of e r m e n t e dm e d i u m ，s h a k i n gi n2 8 ca t2 2 0 r r a i nf o r5d a y s ，t h e nt h e i r e n z y m a t i ca c t i v i t i e s w e r ed e t e r m i n e db ya m m o n i u mm o l y b d a t e - p h o s p h n t ec o l o r i m e r t r y u n d e rt h ec o n d i t i o no f3 7 c a n dp h 2 5 t h er e s u l ts h o w e dt h e r ew e r e 2 4s t r a i n sw i t h h i 【g h e r e n z y m a t i ca c t i v i t i e sa m o n g t h e 、, 10 2s t r a i n s ，a f t e r t h er e s c r e e n i n g ，7s t r a i n sw e r eg a i n e dw i t h e n z y m a t i c a c t i v i t i e sb e y o n d1 5 u m la n ds t a b l ea b i l i t yo f p r o d u c i n ga c i d i cp h y t a s e ，o f w h i c h ， e n z y m a t i ca c t i v i t y o ft h es t r a i nl 掣w a st h e h i g h e s t ，r e a c h i n g5 3 8 6 u m l ，a n d i tw a s p r e l i m i n a r i l l yi d e n t i f i e da s a s p e r g i l l u s n i g e r , t h e n n u m b e r e da s a s p e r g i l l u s n i g e r l 4 “ 2 b e n z y lc h l o r i d ew e r eu s e df o re x t r a c t i n gg e n o m i cd n a o f a s p e r g i l l u s , n i g e r l 4 4 a b o u t 15 k b s p e c i f i cf r a g m e n tw a s o b t a i n e df r o mg e n o m i cd n a o f a s p e r g i l l u s n i g e r l 4 b yp c r a m p l i f i c a t i o n w i m p r i m e r s ( f o r w a r dp r i m e r 5 a t a g g c a t c a t g g g c g t c t c t 3 7 2 西南农业大学硕士研究生论文 r e v e r s e - p r i m e r 5 7 c a g c t a a g c a a a a c a c t c c g c37 ) d e s i g n e d a c c o r d i n g t ot h e k n o w n s e q u e n c e so f t h ep h y t a s eg e n ei nt h eg e n eb a n ka n d p y r o b e s t t md n ap o l y m e r a s e ， a f t e r l i g a t e d w i t h p m d l 8 t v e c t o r ，t r a n s f o r m a t e d i n t oe c o l i d h 5 a c o m p e t e n t c e l l s u c c e s s f u l l y 3 n u c l e o t i d e s e q u e n c ea n a l y s i so f t h e c l o n e d f r a g m e n t r e v e a l e dt h ep r e s e n c eo ft h ew h o l e p h y ag e n ei np c rp r o d u c t t h el e n g t ho f t h i sp h y t a s eg e n ei s l 5 0 6 b pi n t e r r u p t e do n c eb ya l l i n t r o no f1 0 2 b pi nt h e5 p a r to ft h eg e n e ，t h i si n t r o nc o n t a i n sd o n o r s e q u e n c e g t a t g c ， l a r i a ts e q u e n c e - g c t g a ca n da c c e p t o r s e q u e n c e c a gw h i c ha r et y p i c a l l yc o n s e r v e d s e q u e n c e o f t h ei n t r o no f f u n g a l p h y t a s eg e n e t h i sg e n ee n c o d e s a p e p t i d eo f 4 6 7 a m i n oa c i d r e s i d u e sw i t hm o l e c u l a rw e i g h to f 5 1 3 7 k d a ，c o n t a i n i n g1 3p o t e n t i a ln g l y c o s y l a t i o ns i t e s a n da s i g n a lp e p t i d es e q u e n c em a d eu po f1 9a m i n o a c i dr e s i d u e sa tnt e m i n a lo f t h e p e p t i d e t h es e q u e n c eo fa c t i v es i t eo f p h y t a s e ( c r v t f a q v l s r h g a r y p t d s k g k ) i sl o c a t e da t + 7 1 9 3s i t e so f t h e p e p t i d e 4 rd n aa l i g n m e n tr e v e a l e d 9 6 ，9 6 a n d9 2 h o m o l o g yt o t h e p h y ag e n e o f a s p e r g i l l u sn i g e r n r r l 3 1 3 5 , a s p e r g i l l u s j n i g e r n 2 5a n d a s p e r g i l l u s n i g e r 5 k 5 7r e s p e c t i v e l y t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c es h o w e d9 8 10 、9 7 18 a n d 9 5 7 0 h o m o l o g y t ot h o s e o f a s p e r g i l l u s n i g e r n r r l 31 3 5 ，a s p e r g i l l u s n i g e r n 2 5a n da s p e r g i l l u s n i g e r 5 k 一5 7r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：a c i d i cp h y t a s e s t r a i n s c r e e n i n gg e n ec l o n i n g 3 酸性植酸酶产生菌的筛选及其基因克隆 一、文献综述 1 1 植酸的特性 1 1 1 植酸的分子结构 植酸( p h y t a t e ) 2 更称肌醇六磷酸酯，其结构复杂，在自然界中最常见的结构见图1 。 植酸分子含有6 个磷酸基团，带有丰富的磷，植酸是磷的重要贮存形式。在中性p h 条件下，植酸分子的磷酸基团上至少有一个或两个负氧离子，它可以通过阳离子将两 个磷酸基团络合起来形成螯合物，这些螯合物不易分解，因而植酸分子上的磷和金属 阳离子不易被动物所利用。 h o p c g a 2 2 图1植酸结构式 f i g i s t r u c t u r ef o r m u l ao f p h y t i ca c i d 1 1 2 植酸的抗营养作用 植酸不仅本身所含磷的利用率低，而且它也是种重要的抗营养因子，它与蛋白 酶抑制剂、凝血素、皂角索、单宁等多种抗营养物质一样，在玉米、豆粕等植物性饲 料被单胃动物采食后，不仅影响动物对矿物元素和蛋白质的利用率，而且还能抑制一 些消化酶的活性，具体表现如下： 1 1 2 1 降低植酸磷的利用率 在植物性饲料中以植酸盐形式存在的有机磷酸化合物称为植酸磷( p h y t a t e p h o s p h o r u s ) 。我国谷物、油饼、糠麸等猪禽饲料中的植酸磷含量很高，一般约占总磷 的4 0 一8 0 。其中，谷类籽实中的植酸磷含量约占总磷的4 4 。o - - 6 4 ，小麦麸占7 4 ， 而米糠中高达9 3 ( 于炎湖，1 9 9 9 ) 。饲料中的植酸磷必须在消化道内水解成无机磷酸 4 西南农业大学硕： 研究生论文 盐的形式才能被动物所吸收利用，猪禽的消化道中缺乏植酸酶，因此对植酸磷的利用 率很低，猪对植酸磷的利用率约为2 0 5 0 ，家禽对植酸磷的利用率略低于猪，但成 年家禽，由于胃肠道中植酸酶活性较高，对植酸磷的利用率可达5 0 左右( r a v i n d r a n 等，1 9 9 5 ) 。 1 1 2 2 降低矿物元素的利用率 植酸是一种很强的螯合剂，在单胃动物消化道中能结合二价和三价金属离子如 c a 2 + 、z n 2 + 、m 9 2 + 、c u 2 + 、f e ”、c 0 2 + 等矿物元素形成不溶性螯合物，这些螯合物不能 被动物消化道吸收，因此，饲料中植酸含量过高时，可使这些矿物元素的利用率大为 降低，特别是z n ”，在小肠上部适宜p h 条件下，易形成极难溶的植酸盐。高含量的 植酸可使单胃动物对c a 2 + 的吸收率降低3 5 ，尤其是幼畜，植酸过多对c a 2 + 吸收的抑 制作用表现得更明显，可导致佝偻病( 黄遵锡等，1 9 9 9 ) 。所以，植酸不仅降低动物对 磷的利用率，还直接干扰着不少矿物元素的利用。 1 1 2 3 降低蛋白质的利用率 植酸在单胃动物消化道中还可与其中的蛋白质形成难溶性的复合物。植酸与蛋白 质的这种互作关系与p h 值密切相关，在低于蛋白质等电点的p h 条件下，植酸可与蛋 白质分子上的碱性基团( 赖氨酸、精氨酸和组氨酸等氨基酸残基) 结合形成植酸一蛋 白质二元复合物；在高于蛋白质等电点的p h 条件下，则以金属阳离子如c a 2 十、m 9 2 + 和z n ”等为桥梁生成植酸一金属阳离子一蛋白质三元复合物。这些复合物的形成不仅 使蛋白质可溶性明显降低，而且大大降低了蛋白质的生物学效价与利用率，从而影响 了蛋白质的生物学功能。 1 1 2 4 抑制消化酶的活性 植酸及其水解产物还能抑制蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性，从而影响动物对蛋 白质、碳水化台物的消化吸收。有实验表明，植酸盐对不同来源的a 一淀粉酶有很强的 抑制作用，添加植酸盐能使淀粉的消化率降低6 0 。此外，植酸盐对维生素也存在不 利影响。因此，动物采食了高植酸含量的饲料后，常表现出厌食、消瘦、生长繁殖机 能衰退等症状。 1 1 3 植酸对环境的影响 不能被单胃动物所利用的植酸磷由动物粪便排泄体外后被土壤、水中的微生物分 解，引起河流、湖泊的富营养化作用，致使藻类及其它浮游生物迅速繁殖，水体溶氧 量降低，水质恶化，鱼类及其它生物大量死亡，从而对生态平衡造成很大的影响。 5 酸性植酸酶产生菌的筛选及其基因克隆 1 2 植酸酶的研究概况 1 2 1 植酸酶的种类 植酸酶是催化植酸及其盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶，现己知植酸酶有三 种类型( 王红宁等，2 0 0 0 ) ：肌醇六磷酸一3 磷酸水解酶( 3 - 磷酸水解酶，e c 3 1 3 8 ) ， 主要存在于植物和微生物中，它首先使肌醇分子上第三位c 上的磷酸解离，此过程需 m 9 2 + 参与：肌醇六磷酸6 磷酸水解酶( 6 磷酸水解酶，e c 3 1 3 2 6 ) 主要存在于植物 种子中，它首先使肌醇分子上第六位c 上的磷酸解离；非特异的正磷酸盐单酯磷酸水 解酶。 1 2 2 植酸酶的来源 1 2 2 1 植物植酸酶 1 9 0 7 年，s u z u k i 等在米糠中首次发现植酸酶，植物植酸酶的活性在不同种类植物 中存在很大差异：黑麦( 5 1 3 0 单位k g ) 、小麦( 1 1 9 3 单位k g ) 、大麦( 5 8 2 单位k g ) 和小麦麸具有很高的植酸酶活性，而燕麦、玉米、大豆饼、花生饼和棉籽饼中植酸酶 活性很低。植物来源的植酸酶有两种，一种是6 植酸酶( e c 3 1 3 2 6 ) ，其系统命名为 肌醇六磷酸6 磷酸水解酶，它首先催化磷酸从肌醇分子第六位c 位点上脱落，主要存 在于植物种子中；另一种是3 植酸酶( e c 3 1 3 8 ) ，系统命名为肌醇六磷酸3 一磷酸水 解酶，首先使肌醇分子上第三位c 上的磷酸解离，需m 矿+ 参与催化过程。 1 2 2 2 微生物植酸酶 1 9 1 1 年a w o o s 和r g o l d e n 首次发现微生物能够产生植酸酶，n e l s o n ( 1 9 7 1 ) 首次证明了a s p c u u m 产生的植酸酶可以水解植酸。实际上，自然界中许多细菌、酵 母菌和霉菌都可以产生植酸酶，细菌当中有枯草芽孢杆菌，假单孢杆菌，乳酸杆菌， 大肠杆菌等。丝状霉菌，特别是曲霉属，有较强的产植酸酶能力，比如：黑曲霉( 爿n i g e r ) ， 无花果曲霉( a f i c u u m ) ，米曲霉( a o r y z a e ) ，土曲霉( 4 t e r r u s ) ，它们能分泌具有高 度活力的胞外植酸酶，其中黑曲霉( 彳n i g e r ) ，无花果曲霉( j 4 f i c u u m ) ，一直被认为是 微生物植酸酶主要生产菌而被大量研究，利用微生物发酵法可以生产商品化植酸酶。 a s p n i g e r 产生的植酸酶活性最强，而a f i c u u m 的植酸酶产量最大。大多微生物产生的 植酸酶主要是3 植酸酶( e c 3 1 3 8 ) 。 1 2 2 3 动物植酸酶 哺乳动物的小肠及脊椎动物红血球中含有植酸酶，但含量很少且活性很低，而牛 6 西南农业大学硕士研究生论文 等反刍动物的瘤胃中植酸酶活性较高，这可能是瘤胃微生物产生植酸酶的缘故。 1 2 3 植酸酶的性质 1 2 3 1 植物植酸酶的性质 植物植酸酶的最适p h 范围是4 8 6 0 ，在p h 3 0 时活性显著下降，甚至失活，因 此这类酶在动物胃中高酸度条件下，难以发挥其催化活性。植物植酸酶活性在4 7 。c 6 2 范围内比较稳定，当温度达到7 0 c 以上时，植物植酸酶活性部分或全部丧失。植物 植酸酶主要存在植物种子当中，干种子当中的植酸酶无活性，只有种子萌发时，才可 发挥作用，水解植酸从而为种子萌发提供营养。植物植酸酶进入动物消化道后，在一 定的温度和湿度条件下，有发挥其作用的可能，但因其在动物胃中高酸度条件下容易 失活，加上植物植酸酶提取工艺复杂，所以植物植酸酶不适合用作动物饲料添加剂。 1 2 3 2 微生物植酸酶的性质 大多数微生物植酸酶最适p h 范围是2 5 6 0 ，a n i g e r n r r l 3 1 3 5 的植酸酶最适p h 值分别为2 5 和5 5 ( s i m o n s 等，1 9 9 0 ) ，最适温度为5 5 ( 2 ，是一种糖基化蛋白，表观分 子量为5 5 k d a 。c a 2 + 、f c 2 + 对该酶活性无影响，m n 2 + 、c 0 2 + 则有激活作用，能使酶活性 分别提高3 0 和1 3 。来源于a n i g e r 9 6 3 的植酸酶( p h y a ) 的酶学性质( 姚斌等， 1 9 9 8 ) 与来源于a n i g e r n r r l 3 1 3 5 的植酸酶基本相似，仅在最适p h 有所差异，前者 最适p h 为1 8 和5 7 ，而后者为2 5 和5 5 。通常猪和家禽胃的p h 值约为1 5 3 5 ，小 肠前端的p h 值约为5 o 7 0 ，因此，它们的植酸酶能较好地适应动物消化道中的p h 值条件，从而有效发挥酶的催化作用。来源于e c o l i 植酸酶的分子量为4 2 k d a ，最适 p h 为3 5 。大多数酵母都可产生植酸酶，酵母植酸酶最适p h 范围为4 0 5 0 ，最适温 度较高，一般为6 0 c - 8 0 。b a c i l l u s s u b t i l i s 产生的植酸酶呈中性，分子量为4 5 k d a ， 最适温度为5 5 c ，最适p h 值为7 5 ，适合作鲤鱼科鱼类的饲料添加剂，因为鲤鱼科鱼 类无胃，只有星中性的肠道( 姚斌等，2 0 0 1 ：王亚茹等2 0 0 1 ) 。大多数微生物植酸酶 的最适温度在4 5 * 0 6 0 范围内，个别高达7 7 。据n e w m a n ( 1 9 9 1 ) 报道，将a 7 妇r 植酸酶置于9 0 c 环境下3 0 分钟，其活性仍保留8 4 以上。江均平( 1 9 9 6 ) 筛选的产 耐高温植酸酶曲霉菌株h 4 6 1 和h 5 9 2 所产的植酸酶经过7 0 ( 2 处理9 0 m i n ，酶活力分 别保存9 7 和8 1 。而且近几年来，有关极端微生物的研究成为热点，在对极端微生 物的研究中，l u i sp a s a m o n t e s 等( 1 9 9 7 ) 发现嗜热烟熏曲霉所产的植酸酶在1 0 0 * c 下 2 0 m i n ，活性丧失不到1 0 。所以微生物植酸酶适合作动物饲料添加剂，加上其提取 工艺简单，故其应用前景非常广阔。 7 酸性植酸酶产生菌的筛选及其基因克隆 1 2 4 植酸酶作用机理 大量研究表明，在动物饲料中添加植酸酶具有提高植酸磷、钙、镁、锌等矿物元 素以及蛋白质、氨基酸的利用率，这是由于植酸酶能够将植酸水解成为肌醇和磷酸的 缘故。植酸酶将植酸分子上的磷酸基团逐一切下，形成中间产物i p 5 ，i p 4 ，i p 3 ，i p 2 等，终产物为肌醇和磷酸，而不同来源的植酸酶作用机理也不尽相同，大多数微生物 植酸酶( e c 3 1 3 8 ) 首先从肌醇分子上的第3c 位点开始水解酯键而释放无机磷，然 后释放出其它c 位点的磷酸基团，最终酯解整个植酸分子，此酶需要m g “参与催化过 程。具体步骤如下： 植酸+ 1 , 2 ，4 ，5 ，6 - 五磷酸肌醌+ l ，2 ，5 ，6 - 四磷酸肌醇卜1 ，2 ，6 一三磷酸肌醇或1 , 2 ，5 一 三磷酸肌醇一，2 二磷酸肌醒+ 2 - 磷酸肌醇 大多数微生物植酸酶水解到此步为止，还有少数可以继续水解，最终生成磷酸和 肌醇，象烟熏曲霉的植酸酶便可以做到彻底水解( l u i sp a s a m o n t e s 等，1 9 9 7 ) 。来源于 植物的6 - 植酸酶，首先从植酸的第6c 位点开始催化而释放无机磷。植酸酶在水解植 酸的同时，也将释放出磷酸根离子和被植酸螯合的大量z n 2 + 、c u 2 + 、c a 2 + 、m n 2 + 等矿 物元素以及蛋白质，从而使这些营养成分被有效吸收，故可解除植酸的抗营养作用， 提高了动物饲料的营养价值。 1 2 5 植酸酶的应用 1 2 5 1 植酸酶在饲料工业上的应用 目前国内外大量试验研究表明，在单胃动物( 如猪禽) 的植物性饲料中添加植酸 酶已经明确地证明是有效的。它可以使单胃动物植物性饲料中磷的利用率提高6 0 ， 粪便中磷的排泄量减少4 0 ，同时可降低植酸的抗营养作用。具体效果表现在以下几 个方面： 1 2 s 1 1 植酸酶可提高猪禽对植酸磷的利用率，降低磷的排泄，有利于环境保护 在饲料中添加植酸酶可有效分解饲料中的植酸，释放无机磷，提高动物对植酸磷 的利用率。w a l d r o u p 等( 2 0 0 0 ) 报道，在以豆饼为基础日粮的肉鸡饲料中添加植酸酶 大约有5 0 植酸磷被释放。c r o m w e l l 等( 1 9 9 3 ) 在生长猪的豆粕和玉米豆粕目粮中 添加植酸酶进行试验表明，植酸酶水平为1 0 0 0 u k g 时，豆粕中植酸磷的吸收利用率 从2 5 提高到5 7 ，丽玉米一豆粕中则从1 5 提高到4 3 。由以上可知，在猪禽饲料 中添加植酸酶可提高植酸磷的吸收利用率，植酸磷的利用率提高了，那么相应粪便中 磷的含量就有所降低，c r o m w e l l 等( 1 9 9 3 ) 报道，在猪的玉米豆粕型日粮中添加植酸 。8 西南农业大学硕士研究生论文 酶粪便中磷的排泄量减少3 4 - 5 4 。s i m o n s 等( 1 9 9 0 ) 在肉鸡的玉米豆粕型f 1 粮 中添加植酸酶，粪便中磷的排出量减少了5 0 。饲料中植酸酶的添加减少了粪便中磷 的排泄量，大大降低了磷对环境的污染程度。 1 2 5 1 2 植酸酶可提高猪禽对蛋白质及矿物元素的利用率 植酸酶水解植酸释放无机磷的同时，也释放了被植酸螯合的各种矿物元素，如 c a ”、z n 2 + 、f e 3 + 、m n 2 + 、c u 2 + 等，从而提高其利用率，同时由于植酸酶水解了植酸， 破坏了植酸一蛋白质键，也使蛋白质被释放出来。因此，猪禽饲料中添加植酸酶可提 高猪禽对矿物元素和蛋白质的消化利用率。v i v e r o s 等( 2 0 0 2 ) 发现植酸酶能提高钙利 用率。另有报道，猪目粮中添加植酸酶能使m 9 2 + 、z n 2 + 、c j + 、f e ”的表观利用率分 别提高1 3 、1 3 、7 和9 。肉鸡日粮中添加植酸酶还能改善锌的沉积量。 实验证明在猪禽饲料中添加植酸酶能提高蛋白质和氨基酸的利用率。m r o z 等 ( 1 9 9 1 ) 报道，添加植酸酶能改善猪的回肠氮和氨基酸消化率以及氮存留。诺丁汉大 学研究表明，植酸酶使回肠的氮消化率从5 5 提高到6 8 ，整个消化道氮的消化率从 8 1 提高到8 6 。r a v i n d r a n 等( 1 9 9 9 ) 研究结果表明，在肉鸡的豆饼饲料中添加微生 物植酸酶对1 5 种氨基酸的回肠消化率提高幅度为8 5 5 ，而且，当考虑个别氨基酸的 影响时，发现t h r 和v a l 的回肠消化率增加幅度最大。 1 2 5 1 3 植酸酶可改善猪禽的生产性能 许多实验都证明在猪禽饲料中添加植酸酶可提高猪禽的生产性能。a d e o l a 等 ( 1 9 9 5 ) 向断奶仔猪饲料中添加植酸酶( 5 0 0 u k g ) ，试验结果表明，添加植酸酶组猪 的日增重、饲料报酬率和采食量分别提高6 0 3 、5 8 6 和0 3 。s e b a s t i a n 等( 1 9 9 6 ) 对肉仔鸡玉米一豆粕日粮中添加植酸酶的试验结果表明，添加植酸酶组公母仔鸡日增重 分别提高1 3 2 和5 6 。p o m e y 等( 1 9 9 3 ) 研究表明，在肉鸡日粮中添加1 植酸酶 显著提高了仔鸡胫骨强度，但对饲料利用效率影响不大。 1 2 5 2 植酸酶在食品中的应用 植酸酶除了在饲料工业和环境中的利用外，它在食品工业中的应用潜力也很大。 许多主要的食品原料象豆类、谷物和油料作物中植酸含量很高，由其加工的食品中植 酸的含量也很高，而在人的小肠中，植酸酶活性极低，难以利用植酸盐，所以在食品 中添加植酸酶可提高食品的营养价值。有研究表明，在面团中加入黑曲霉植酸酶，铁 的吸收率从1 4 3 提高到2 6 1 ，提高了9 8 ( 毕士峰等2 0 0 0 ) 。 1 2 5 3 植酸酶在化工医药产品开发研究中的应用 9 酸性植酸酶产生菌的筛选及其基因克隆 植酸的酶解产物有肌醇、2 磷酸肌醇、3 - 磷酸肌醇、4 一磷酸肌醇和5 一磷酸肌醇，它 们有着非常重要的营养价值和药用价值，它们能够降低血糖水平、降低胆固醇和甘油 三酯含量，还能治疗阿尔落海默病和帕金森病。肌醇有类似维生素b 1 和维生素h 的 作用，可用于治疗肝硬化、肝炎、脂肪肝、血管硬化、糖尿病、四氯化碳中毒等病症。 近年的研究表明以l ，2 ，6 i p 3 、1 , 2 ，3 i p 3 和l ，3 ，4 i p 3 等异构体为主的三磷酸肌醇具有 广泛的生理功能，它们能够消除体内的自由基，具有抗血小板凝聚的功能，对不同类 型的炎症具有消炎作用( 余以刚等，1 9 9 9 ) 。因此，用植酸酶水解植酸制备三磷酸肌醇 用于医药中具有广阔的前景。 1 2 6 植酸酶基因 8 0 年代末，荷兰w a g n i n g e n 大学克隆了第一个植酸酶基因，从此以后，植酸酶的 研究进入分子水平，这为解决植酸酶产量及耐热性问题奠定了基础。到目前为止，共 有十余个植酸酶基因得到分离克隆，其中绝大多数是微生物植酸酶基因，仅有一个植 物植酸酶基因。 最先分离出来的植酸酶基因是a n i g e r n r r l 3 1 3 5 的p h y a 基因( w i mv a n h a r t i n g s e l d t 等，1 9 9 3 ) ，该基因全长1 5 0 6 b p ，其中+ 4 6 + 1 4 7 的1 0 2 b p 核苷酸序列是一 典型的真菌内含子序列，其上存有真菌内含子的特征保守序列：d o n o r 序列一g t a t g c ， l a r i a t 序列一g c t g a c 及a c c e p t o r 序列一c a g 。该基因编码4 6 7 个氨基酸，n 端的1 9 个氨基酸为信号肽序列，形成的植酸酶是一种糖基化蛋白。在p h y a 编码的氨基酸序 列上，发现了l o 个潜在的n 一糖基化位点。从氨基酸推断出该植酸酶的理论分子量为 5 14 k d a ，氨基酸序列上存在组氨酸酸性磷酸酶的活性位点保守序列： r h g a r y p t ， 它位于氨基酸序列的+ 5 2 - - 4 - 7 4 ，可归为组氨酸酸性磷酸酶这一家族。 姚斌等( 1 9 9 8 ) 分离的an i g e r 9 6 3 植酸酶基因p h ) ，a 2 与a n i g e r n r r l 3 1 3 5 的p h y a 相比较，其结构基因长度、所编码氨基酸的长度、信号肽编码序列、内含子序列及位 置等均相同。在d n a 序列上只有1 2 3 个核苷酸的差异，同源性为9 1 8 0 ，编码氨基 酸序列上有3 9 个氨基酸不同，同源性为9 1 6 0 。在p h y a 编码的p h y a 蛋白上有j 0 个潜在的n - 糖基化位点，而在p h y a 2 上有9 个，其中8 个与p h y a 上的位置相同。 王红宁等( 2 0 0 1 ) 分离的a n i g e rn 2 5 的p h y a 与a n i g e r n r r l 3 1 3 5 的p h y a 相比，其 结构基因长度、所编码氨基酸的长度、信号肽编码序列、内含子序列及位置等均相同。 在d n a 序列上仅有4 9 个位置上的碱基不同，同源性可达9 6 7 5 。编码氨基酸序列上 有1 1 个氨基酸残基不同，同源性高达9 7 6 4 ，有1 0 个潜在的n - 糖基化位点，植酸 1 0 西南农业大学硕士研究生论文 酶活性位点序列位于氨基酸序列的+ 7 1 9 3 。 a n i g e r n r r l 3 1 3 5 的第二个植酸酶基因p h y b 于1 9 9 3 年得到了分离克隆( k e n n e c h 等，1 9 9 3 ) ，p h y b 与p h y a 的核瞢酸序列及所编码的氨基酸序列同源性低，但p h y b 也属组氨酸酸性磷酸酶家族，氨基酸序列上也有活性位点保守序列：r h g x r x p 。p h y b 基因全长1 6 0 5 b p ，p h y b 共编码4 7 9 个氨基酸，其上至少有8 个潜在的n 糖基化位点。 细菌的植酸酶基因较短，与已报道的p h y a 及p h y b 同源性低，且编码的氨基酸序 列上不存在活性位点保守序列：r h g x r x p ，因此，它不属于组氨酸酸性磷酸酶家族。 1 9 9 8 年，k e r o v u o 等首次从b a c i l l u s s u b t i l l s 中分离出完整的植酸酶基因p h y c ，该基因 全长1 1 5 2 b p ，编码3 8 3 个氨基酸，其中n 端的2 6 个氨基酸是信号肽序列。 到目前为止，分离出来的植物植酸酶基因只有玉米的植酸酶基因p h y s l l ，是 m a u g e n s e t 等于1 9 9 7 年从萌发的玉米种子中分离得到的，该基因全长1 1 6 7 b p ，编码 3 8 8 个氨基酸，它所编码的氨基酸序列与黑曲霉植酸酶只有3 3 个氨基酸同源区，而且 该区有r h g x r x p 活性保守序列存在。 1 2 7 植酸酶基因工程 植酸酶作为一种新型饲料添加剂，无论在动物生产还是在环境保护中都有重要的 应用价值。然而植酸酶在天然材料中表达水平低，加上天然植酸酶一些性质不能完全 适合饲料加工的要求( 如热稳定性) ，因此，为解决以上两个问题的植酸酶基因工程便 成为植酸酶的发展趋势。 1 2 7 1 在微生物中克隆植酸酶基因 p i d d i n g t o n 等( 1 9 9 3 ) 克隆了an i g e r v a ta w a m o r i a l k 0 2 4 3 菌株植酸酶( p h y a ) 基因并测序后，将此植酸酶基因克隆到黑曲霉突变株a l k 0 2 2 8 6 中，其表达量提高到 3 2 9 u m l 。u l l a h 等( 1 9 9 1 ) 从无花果曲霉( a f i c u u m ) 中克隆出植酸酶p h y a 和p h y b ，并 利用基因工程技术在1 9 9 1 年和1 9 9 3 年，分别得到p h y a 和p h y b 的基因工程菌。w i m v a n h a r t i n g s e l d t 等( 1 9 9 3 ) 将a n i g e r n r r l 3 1 3 5 的p h y a 基因导回原菌株，使p h y a 基因的拷贝数增加到1 5 个以上，从而使植酸酶的表达量提高到7 6 0 0 u m l 。到1 9 9 6 年， 植酸酶制剂工业化生产技术已经比较成熟，美国把饲用植酸酶投放了市场。 在我国，姚斌等( 1 9 9 8 ) 从土壤中筛选到产植酸酶的黑曲霉菌株a s p n i g e r 9 6 3 ， 通过p c r 扩增法获得该菌株植酸酶p h y a 2 基因，并将该基因改造后导入巴斯德毕赤 酵母( p i c h i p a s t o r i s ) 中，得到了高效表达，比原菌株a n i g e r 9 6 3 的表达量提高了3 0 0 0 倍以上。王红宁( 2 0 0 1 ) 提取出了黑曲霉n 2 5 ( a s p n 辔盯c h i n as t r a i n ) 的基因组d n a ， | l 酸性植酸酶产生菌的筛选及其基因克隆 根据已测定出的植酸酶p h y a 基因全序列设计出了一对引物，采用聚合酶 a d v a n g a g e h f 扩增到去除信号肽的内含子后约1 4 k b 片段，并对其进行克隆和序列测 定，然后构建成功了p v i c 9 k p h y a 载体，接着用p p i c 9 k p h y a 载体转化巴斯德毕赤 酵母，经g 4 1 8 抗性筛选获得了高效表达的转化子p p - n p 一1 ( 2 3 8 6 9 4 u m 1 ) 、 p p n p 2 ( 2 0 5 3 3 0 u m 1 ) 和p p n p 3 ( 3 5 6 4 6 7 u m 1 ) ，其酶活分别是出发菌株的4 6 4 6 倍、 3