（微生物学专业论文）小曲中优良根霉的分离筛选及产酶条件研究.pdf

西南大学硕十学位论文 摘要 小曲中优良根霉的分离筛选及产酶条件研究 微生物学专业硕士研究生：叶磊 指导教师：张惟广副教授 摘要 我国小曲资源丰富，构成了一个巨大的微生物菌种库，里面蕴藏着许多质量优良的菌种。 本文以收集的传统小曲为样本，分离并纯化其中的根霉，筛选得到了e r h 2 0 3 和e r h 5 0 5 两个 优良菌株，同时研究了其产酶特点，优化了制曲条件，并完成了对菌株的鉴定工作。实验结 果如下： ( 1 ) 通过对8 种传统小曲样品的分析发现：曲2 糖化力和液化力最高，蛋白酶活力也较 高，而曲5 具有最高的蛋白酶活力，糖化力和液化力也相对较高，从这两种小曲中分离纯化 并得到了1 2 株根霉。通过制曲和糯米试饭试验，比较了各菌株的产酶特点，筛选出了e r h 2 0 3 和e r h 5 0 5 两株优势根霉。同时发现，这两株根霉都具有一定的产酒精能力，这也是优良根霉 的重要特点之一。 ( 2 ) 单因素试验表明，培养时间对两株根霉产酶有较大的影响，培养3 4 天有利于根 霉的生长和酶活力的提高。同时，温度也影响着根霉的产酶情况，在3 0 时，糖化酶和液化 酶活力较高，而蛋白酶活力则在2 6 ( 2 下培养时却达到最大值。在p h 5 2 一p h 7 0 之间，根霉产 酶活性比较稳定。在麸皮培养基中添加一定量的玉米粉能显著提高根霉的产酶能力，当玉米 粉浓度为8 - - 1 2 时，酶活力都有不同程度的增加。e r h 2 0 3 在玉米粉浓度为8 时，糖化酶 活力和液化酶活力都达到最大，分别为9 1 9 3 7m g h g - 1 和6 4 8 6 4m g h g - 1 ，分别增加了6 7 和 5 4 ，蛋白酶活力在添加1 2 玉米粉时达到最大值8 6 0 7 4 l g m i n g 1 ，增加了5 9 。 ( 3 ) 正交试验结果表明：培养温度、培养时间、玉米粉浓度对菌株e r h 2 0 3 产糖化酶、 液化酶和蛋白酶的活性的影响显著。对糖化酶的影响顺序是培养温度 培养时间 玉米粉浓 度，最佳条件是培养温度3 0 c 、培养时间3 d 和添加玉米粉浓度8 。对液化酶的影响是培养 时间 培养温度 玉米粉浓度，最佳条件是温度3 0 、时间3 d 和玉米粉浓度8 。对蛋白酶 的影响是培养时间 培养温度 玉米粉浓度，最佳条件是培养温度2 8 ( 2 、培养时间4 d 和玉 米粉浓度1 2 。 ( 4 ) 通过显微镜下菌落形态，如菌丝、假根、孢子囊、孢囊孢子、厚垣孢子等的观察和 西南大学硕士学位论文摘要 测量，结果为：e r h 2 0 3 是藻状菌纲( p h y c o m y c e t e s ) 毛霉目( 坛脚r 口k s ) 毛霉科( m u c o r a c e a e ) 根霉 属( r h i z o p u se h r e n b e r g ) 中的米根霉( r h i z o p u so r y z a ew e n te tp r i n s e ng e e r l i n g s ) ，e r h 5 0 5 是藻状 菌纲( 尸纫，c d 彬) 忙p 删毛霉目( m u c o r a l e s ) 毛霉科( m u c o r a c e a e ) 根霉属( r h i z o p u se h r e n b e r g ) 中的河 内根霉( r h i z o p u st o n k i n e n s i sv u f t t ) 。 关键词：小曲根霉酶活力产酶条件鉴定 u 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a bs t r a c t r h i z o p u s ，f u n g u so ft h em u c o r a c e a cf a m i l ya tt h ep h y c o m y c e t e sc l a s s ，c a n p r o d u c el o t so fa m y l a s e ，p r o t e i n a s e ，z y m a s e 、i 廿lt h e i rg r o w t h i ti st h em a i n s a c c h a r i f i c a t i o nf u n g u si nc h i n e s ek o j i b er i c hi nc h i n e s ek o j i ，c h i n ah a sah u g e l i b r a r yo fm i c r o o r g a n i s m s ，w h i c hc o n t a i n sal o to fq u a l i t yf u n g u s b e c a u s eo ft h i s ，m a n y s a v a n t sa r ei n t e r e s t e di ns e p a r a t i n g ，p u r i f y i n ga n ds c r e e n i n gt h es u p e r i o rr h i z o p u s i n t h i st h e s i s ，s e l e c t e ds u p e r i o rs t r a i n sf r o mt h es u p e r i o rt r a n d i t i o n a lc h i n e s ek o j i ，a n dg o t t w os u p e r i o rr h i z o p u s ：e r h 2 0 3a n de r h 5 0 5 a tt h es a m et i m e ，t h ec h a r a c t e r so f e n z y m ep r o d u c t i o na r es t u d i e da n dt h er h i z o p u si d e n t i f i c a t i o na r ec o m p l e t e d a l lo f t h e s ec a ng i v et h et h e o r e t i c a lb a s i sa n dr e f e r e n c ed a t af o rt h ea c t u a lp r o d u c t i o n t h e m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ( 1 ) t h r o u g ha n a l y s i so ft h e8s a m p l e so ft r a n d i t i o n a lc h i n e s ek o j i ，s a m p l e2 h a s t h eh i g h e s tg l u c o a m y l a s ea n dl i q u e f i c a t i o ne n z y m ea c t i v i t i e sw i mh i g h e rp r o t e a s e e n z y m ea c t i v i t i e s s a m p l e 5h a st h e h i g h t e s tp r o t e a s ee n z y m e a c t i v i t i e sa n d g l u c o a m y l a s ea n dl i q u e f i c a t i o ne n z y m ea c t i v i t i e s t h e r e f o r e ，s a m p l e2a n ds a m p l e 5a r e c h o s e nf o rf u r t h e ri n v e s t i g a t i o n b ys e p e r a t i n ga n dp u r i f y i n gt h e s et w os a m p l e s ，h e r e g e t s1 2s t r a i n s c o m p a r i n g1 2s t a i n s 、析mt h ec h a r a c t e r so fe n z y m ep r o d u c t i o na n dt h e r i c ef e r m e n t a t i o nt e s tw h i c hw e r ei s o l a t e df r o ms a m p l e2a n ds a m p l e5 ，t w os u p e r i o r s t r a i n sh a v e b e e ns e l e c t e df o rf u r t h e rs t u d i e s ：e r h 2 0 3a n de r h 5 0 5 a d d i t i o n a l l y , b o 也o f t h e mc a l lp r o d u c ez y m a s e s ，w h i c hi st h em o s ti m p o r t a n tc h a r a c t e ro fb e i n ga s u p e r i o rs t r a i n s ( 2 ) t h r o u g ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t ，c u l t i v a t i o nt i m eh a sm o r ei n f l u e n c ei n e n z y m ep r o d u c t i o n i tw i l li m p r o v et h eg r o w t ho ft h et w os t r a i n sa n dt h ea c t i v i t i e so f e n z y m eb y3t o4d a y s m e a n w h i l e ，t e m p e r t u r ea l s oi n f l u e n c e st h ee n z y m ep r o d u c t i o n c u l t u r i n gt h et w os t r a i n sa t3 0 ，t h ea c t i v i t i e so fsg l u c o a m y l a s ea n dl i q u e f i c a t i o n e n z y m ea r em u c hh i g h e r ，b u tt h ea c t i v i t i e so fp r o t e a s ee n z y m eg e tt h em a xa t2 6 c i n t h ec o u r s eo f p r o d u c t i o n ，c o n t r o l l i n gt h et e m p e r a t u r e 、7 i ，i mt h er e q u i r e m e n ti si m p o r t a n t t h ei n i t i a lp hv a l u ed o e sn o th a v em u c hm o r ei n f l u e n c ei nt h et w os t r a i n s b e t w e e n p h 5 2t op h 7 0 ，t h ea c t i v i t i e so fe n z y m ep r o d u c t i o nw i l lb em o r es t a b l e p u t t i n gs o m e c o r nf l o u ri nb r a nc u l t u r em e d i u mc a ni m p r o v et h ea b i l i t yo fe n z y m ep r o d u c t i o n a d d i n g t h ec o r nf l o u ra tac o n c e n t r a t i o no f8 1 2 t ot h et w ot r a i n s ，t h ea c t i v i t i e so f g l u c o a m y l a s e ，l i q u e f i c a t i o ne n z y m ea n dp r o t e a s ee n z y m ei n c r e a s ei nv a r y i n gd e g r e e s m 两南大学硕七学何论文a b s t r a c t f o re r h 2 0 3 ，w h e nt h ea d d i n gc o r nf l o u rc o n c e n t r a t i o ni s8 ，t h eg l u c o a r n y l a s ea n d l i q u e f i c a t i o ne n z y m ea c t i v i t i e sg e tt h em a x ，9 1 9 3 7m g h 。g - 1a n d6 4 8 6 4m e g h - g c o m p a r i n gw i t h o u ta d d i n gc o lf l o u r , i ti n c r e a s e s6 7 a n d5 4 1 1 l ea c t i v i t i e so f p r o t e a s ee n z y m ew h e na d d i n g12 c o r nf l o u ri s8 6 0 7 4 9 9 m i n g - 1t h a ti n c r e a s e d 5 9 w h e na d d i n gc o r nf l o u rb e y o n dt h ec o n c e n t r a t i o n ，t h ea c t i v i t i e so fe n z y m ew i l l b ed o w n h e r ei st h er e a s o n ，t h em o r ec o r nf l o u r , t h em o r eo fv i s c o s i t yo fc u l t u r e m e d i u m ，w h i c hr e d u c e st h ea c t i v i t i e so fe n z y m e 1 1 1 er e a s o ne f f e c t st h eg r o w t ho f r h i z o p u s ( 3 ) f r o mt h er e s u l t so fo r t h o g o n a lt e s t s ，t h er e s u l t ss h o wt h a tt h et e m p e r a t u r ea n d t h ec u l t i v a t i o nt i m ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no fc o r nf l o u ra f f e c tt h el i v i n g b e s so fa c t i v i t i e s o fe n z y m eo b v i o u s l y 1 1 1 ei n f l u e n c eo fa c t i v i t i e so fg l u c o a m y l a s ei s t e m p e r a t u r e c u l t i v a t i o nt i m e c o n c e n t r a t i o no fc 0 1f l o u rw i t ht h eb e s tc u l t i v a t i o nt e m p e r a t u r eo f 3 0 ，t h eb e s tc u l t i v a t i o nt i m eo f3d a y s ，a tt h ee o n c e r a t i o no f8 o ft o mf l o u r 1 1 l c i n f l u e n c eo fa c t i v i t i e so fl i q u e f i c a t i o ne n z y m ei sc u l t i v a t i o nt i m e t e m p e r a t u r e c o n c e n t r a t i o nw i t ht h eb e s tc u l t u r i n gt e m p e r a t u r eo f3 0 c ，t h eb e s tc u l t u r i n gt i m eo f3 d a y s ，a tt h ec o n c e r a t i o no f8 o fc o r nf l o u r n ei n f l u e n c eo fa c t i v i t i e so fp r o t e a s e e n z y m ei s c u l t i v a t i o nt i m e t e m p e r a t u r e c o n c e n t r a t i o nw i t ht h eb e s t c u l t u r i n g t e m p e r a t u r eo f2 8 ，t h eb e s tc u l t u r i n gt i m eo f4d a y s ，a tt h ec o n c e r a t i o no f12 o fc o r n f l o u r ( 4 ) t h r o u g ht h eo b s e r v a t i o no fc o l o n y ，t h eo b e r v a t i o na n dt h em e a s u r eo fh y p h a , r h i z o i d ，s p o r a n g i u m ，s p o r e ，c h l a m y d o s p o r ee t c b ym i c r o s c o p e ，h e r ei st h e r e s u l t e r h 2 0 3i sr h i z o p u so r y z a ew e n te tp r i n s e ng e e r l i n g ss p e c i e so f r h i z o p u se h r e n b e r g g e n u so fm u c o r a c e a ef a m i l ya tm u c o r a l e so r d e r a t p h y c o m y c e t e sc l a s s ，a n d e r h 5 0 5i sr h i z o p u st o n k i n e n s i sv u i l ls p e c i e so fr h i z o p u se h r e n b e r gg e n u so f m u c o r a c e a ef a m i l ya tm u c o r a l e so r d e r a tp h y c o m y c e t e sc l a s s k e yw o r d ：c h i n e s ek o j ir h i z o p u sa c t i v i t i e so fe n z y m ee n z y m e - p r o d u c i n g r e q u i r e m e n t si d e n t i f i c a t i o n i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：叶磊签字日期：20 0 9 年6 月1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止)。 学位论文作者签名： 签字日期： 吐兢 易月砂日 导师签名： ，_ 一、 鳓期：少夕年易月沙 | 西南大学硕+ 学位论文文献综述 1 文献综述 1 1 根霉简介 根霉( 醌i z o p u s ) 在分类学上属于真核生物界的真菌f q ( f u n g o 、藻状菌纲( p h y c o m y c e t e s ) 、毛 霉 | ( m u c o r a l e s ) 、毛霉科( m u c o r a c e a e ) 中的根霉属( r h i z o p u se h r e n b e r g ) 】。根霉是常见的霉菌， 在空气、土壤，以及各种器具表面都有它的孢子存在。在日常生活中，它常会引起淀粉质食 品如馒头、面包发霉变质，也能引起蔬菜霉烂。但是在酿酒工业上，它常常扮演重要的糖化 角色 2 1 。 根霉菌丝没有分隔，呈比较粗的管状、无隔膜，在培养基上生长时，由营养菌丝体产生 弧形的葡萄菌丝，向四周蔓延。葡萄菌丝接触培养基处，分化成假根用来吸收营养。在假根 对面，生出直立的孢子囊柄，柄的顶端膨胀而形成囊，称为孢子囊。孢子囊里有许多孢子， 称孢囊孢子。成熟后的孢囊孢子从破裂的囊壁被释放出来，散布各处或随风飘扬，当外界条 件( 温度、水分、营养) 适宜时，开始繁殖f 3 】。 根霉有两种繁殖方式，即无性繁殖和有性繁殖。一般以无性繁殖为主，孢子囊孢子在温 度、水分和酸碱度( p h 值) 等适宜的条件下，吸水膨胀萌发，长成菌丝体。根霉是好气性菌， 在整个培养过程中必须供给充足的氧，否则就会影响繁殖和生长，并且喜欢在微酸环境中生 长，最适p h 值为5 0 5 5 1 6 j 。 1 2 酒曲根霉的酶系特征及作用 在我国南方各省，尤其是四川、贵州、广东、广西和福建等地，小曲酒在市场中都占据 一定优势，其价廉物美，深受广大消费者的欢迎，同时在东南亚各国也很有市场。小曲酒生 产用曲量小，生产周期短，出酒率高，耗粮少，使用原料品种广泛，酒厂的规模可大可小， 符合国家节约酿酒用粮的要求。小曲是小曲酒的糖化发酵剂，在小曲酒的酿造过程中起着糖 化和发酵的双重作用，即小曲中由霉菌产生的丰富淀粉酶将淀粉水解成可发酵性糖，再经由 酵母产生的酒化酶系的作用，发酵生成酒精和其它风味物质【4 j 。 小曲中的微生物种类繁多，主要有根霉，酵母和细菌等。1 8 9 2 年，法国科学家卡尔麦提 ( c a l m e t t e ) 在我国酒曲中首次发现糖化力强的根霉。1 9 5 6 年，我国方心芳先生对小曲中分离出 的根霉进行分类，并做了大量生理特性的研究，确定了根霉是小曲中的主要糖化菌。 根霉具有很强的糖化能力是因为它在生长过程中能产生大量的淀粉酶，而且具有很强的 活性，能将淀粉较彻底地分解成可发酵性糖。它还能产蛋白酶、酒化酶和脂肪酶等一系列酶 系，而且在发酵过程中可以产生柠檬酸、乳酸和琥珀酸等多种有机酸，对小曲酒的质量和风 昧有着重要的影响。 西南大学硕+ 学位论文文献综述 1 2 1 淀粉酶的作用 酿酒用粮有高粱、玉米、大米、小麦、养麦等，各种粮食的淀粉都含直链淀粉和支链淀 粉。直链淀粉是由几十个到几百个葡萄糖基组成，各个葡萄糖以洳1 ，4 糖苷键连接，形成一条 长链，而支链淀粉则由几百到上千个葡萄糖基组成，葡萄糖分子在直链中以a - l , 4 糖苷键连接， 而在分支处以a 1 ，6 糖苷键相连。淀粉酶的作用是将淀粉中的这些糖苷键切断，生成可发酵性 糖类。根霉可以产生丰富的葡萄糖淀粉酶，其次是洳淀粉酶，异淀粉酶等【5 j 。关于根霉的酶系， 日本的上田诚之助于1 9 8 4 年测定了1 6 株根霉的5 种酶的活性，包括糖化酶、果胶酶和木聚 糖酶等。另外，方心芳、乐爱华等也曾研究过根霉产果胶酶、延胡索酸、和甾族激素等。按 作用方式不同，根霉的淀粉酶可分为液化型淀粉酶和糖化型淀粉酶。 1 2 1 1 液化型淀粉酶的作用 液化型淀粉酶主要是指甜淀粉酶，它可以水解直链淀粉和支链淀粉内部的弘l ，4 - 糖苷键， 产生短链的低聚糖混合物，在酿造工业中，它使得淀粉溶液的黏度很快下降。它不能水解分 支点的1 , 6 糖苷键，但能越过分支点继续水解，随着淀粉链的变小，它的作用速度也随之变慢。 由于它对淀粉主要起液化作用，因此称为液化酶。研究表明，真菌产生的伽淀粉酶对热相对 敏感，并且是产生麦芽糖为主和一些其他低聚物的淀粉酬7 】。 1 2 1 2 糖化型淀粉酶的作用 糖化型淀粉酶主要包括p 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶( 简称糖化酶) 。其中，p 淀粉酶只能水 解小1 ，4 糖苷键，它的作用是从淀粉非还原性的一端开始，依次切下一个麦芽糖分子，遇到a - 1 ，6 糖苷键的分支处时，就停止不前，无法越过。葡萄糖淀粉酶是从淀粉的非还原性末端开始水 解a - 1 ，4 糖苷键，依次切下一个葡萄糖分子，同时它也可以微弱的水解泓l ，6 糖苷键【8 1 1 9 1 。它一 般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖，因此被广泛地应用于酒精、白酒、抗生素、氨基 酸、有机酸、甘油、淀粉糖等工业中，是我国产量最大的酶制剂产品【1 0 】。目前根霉葡萄糖淀 粉酶的研究已经比较深入，根霉能产生5 种活性组分【l l l 。 1 2 2 酒化酶的作用 根霉能产生一定量的酒化酶系，是根霉作为糖化菌的重要特点，在整个小曲酒发酵过程 起着重要作用【1 2 】。尤其在发酵前期，酵母处于繁殖阶段，还没有产生酒化酶，此时由于糖化 作用，已经积累了一定量的葡萄糖和麦芽糖，而葡萄糖和麦芽糖在葡萄糖苷酶的作用下，很 容易生成不可发酵的潘糖，从而会造成酒精的无形损失，影响出酒率1 3 1 。根霉产生的酒化酶 保证了前期发酵的正常进行，从而使得整个发酵过程始终处于边糖化边发酵状态，所以发酵 作用较彻底，出酒率得到进一步提高f 。目前工业上常用单一纯种根霉而不添加酵母来发酵 生产甜酒，除了根霉具有很强的糖化力外，它能产生酒化酶也是其中一个重要原因。 2 西南大学硕士学位论文文献综述 根霉因品种不同，产酒精能力差别较大，筛选出酒化能力强的菌株，将对酿酒工业起到 重要作用。张凤英等利用纯种根霉2 2 菌株发酵酿酒，与该根霉中添加酵母发酵作对比，结 果发现发酵结束时两者酒精含量无明显差异，但是前者发酵比较迟缓，证明采用纯根霉发酵 的可行性，但是对根霉发酵其它方面的因素还需要加以全面的考虑。 1 2 3 蛋白酶的作用 酿酒原料中一般含有一定量的蛋白质，蛋白酶对其的分解作用是发酵正常进行的重要保 证【1 6 】。其作用主要表现在三个方面，一是分解蛋白质成氨基酸为提供微生物的营养物质；二 是氨基酸还可以经过微生物代谢，生成杂醇油、醛类、酸类、脂类及其他一些香味物质，对 小曲酒香型和风格的形成有着直接的关系；三是剩余的氨基酸构成酒体的营养成分之一。 1 2 4 产酸的作用 根霉一般都具有一定的产酸能力，大多是有机酸，如乳酸、延胡索酸( 富马酸) 、琥珀酸、 苹果酸等。根霉的产酸能力在小曲酒发酵过程中的作用主要有以下两个方面。一是产生酸类 物质使发酵液p h 下降，从而抑制了某些在酸性环境中难以生长的杂菌的污染。二是根霉产生 的酸类物质是构成酒体风味的主要成分以及其它风味物质的前体成分，如琥珀酸有利于调和 酒体风味等，乳酸除了使酒体具有浓厚的香味外，还是生成风味物质乳酸乙酯的前体物质【1 7 1 。 1 3 根霉的研究进展 中国酒曲历史悠久，有的学者认为，制曲酿酒可与我国古代四大发明相媲美。我国古人 对酒曲的研究很早就有文字记载。2 0 0 0 多年前，人们就懂得开始利用霉变和发芽的混合谷物 来发酵酿酒，那时的酒曲是天然的酒曲。但是天然酒曲不能经常得到，因此古人模仿天然酒 曲变酒的方法，发明了人工酒曲，也就是我国最早的酒曲。现在，小曲是用米粉或麸皮等作 为原料，接入一定量的母曲，在控制温度和温度的条件下制成。 人们形象地称曲为“酒之骨”，可见曲对酒质具有极重要的作用。所以要酿好酒必先制得 好曲嗍。随着随着微生物技术的发展及对小曲研究的深入，人们采用纯培养技术，分离选育 出了一些优良菌株，应用于生产后，对提高出酒率和酒质起到了重要的作用，这也极大地促 进了我国酿酒工业的发展【1 9 1 。 1 3 1 菌种筛选 我国小曲资源丰富，构成了一个巨大的微生物菌种库。1 9 8 5 年，日本学者柳田氏在我国 云贵两省市场上收集了2 2 个酒曲样品，经分离纯化得到1 2 0 株，并以日本现存的米根霉、日 本根霉和少根根霉等优良菌株为对照，以相同方法制曲后，进行了酶活性测定。结果发现， 在这1 2 0 株根霉中，小淀粉酶比对照组中洳淀粉酶中最高的少根根霉还高的菌株有4 株，其糖 化力比少根根霉要高2 8 倍，其中有一株蛋白酶活性比对照组中活性最高的米根霉高出3 2 倍。 3 西南大学硕+ 学位论文文献综述 1 9 8 9 年，小泉氏在我国西南地区采集了1 9 种酒曲，回国后分离鉴定后，筛选出几株优良菌株， 与日本既知菌株相比，液化力大4 5 倍，糖化力大2 8 倍，蛋白酶活力大3 2 倍，与柳田氏的 研究结果一致。这两个例子充分说明了我国酒曲不仅资源丰富，而且蕴藏着大量优良的菌株， 是一笔珍贵的财富。 与自然界中的根霉相比，小曲中的根霉有以下优势：1 ，j 、曲根霉在特定的环境中生活了数 百年，这个漫长的自然选择过程使优良的菌种保留了下来，并且具有很强的适应性，是自然 界中的根霉无法比拟的。2 小曲根霉酶系丰富，且酶系中糖化型淀粉酶活力强，能将淀粉较彻 底地水解成可发酵性糖。 目前，根霉菌株的筛选主要集中在以下几个方面1 2 0 l ：1 高酶活力菌株的筛选，从而缩短生 产周期；2 特征产物酶产生菌的筛选，如产低聚麦芽糖酶菌株以生产功能性保健酒和风味较好 的品种；3 多酶系产生菌株的筛选，如糖化酶和酒化酶系活力都较高的菌株可以用于单一菌种 制曲，节约原料，节省工序，并且有利于制曲过程中的参数控制，使成品酒具有较好的酯香味。 1 9 5 9 年，乐爱华和方心芳1 2 1 】从全国各地收集了一批品质较好的酒曲，分离筛选出了 a s 3 8 5 1 ( r h i z o p u st o n m n e n m s ) 、a s 3 8 6 6 ( r h i z o p u st o n l d n e n s i s ) 、a s 3 8 6 7 ( r h i z o p u st o n k i n e n s i s ) 、 a s 3 8 5 2 ( r h i z o p u s j a p o n i c u s ) 和a s 3 8 6 8 ( r h i z o p u s j a p o n i c u s ) 5 株优良的根霉菌株，其中a s 3 8 6 6 根霉糖化力和生成乳酸等有机酸的产酸力较强，酒化酶活力也高，被广泛应于生产，这也是中 国最早的应用于工业生产的菌株之一，有的到目前仍在使用中。陈圣龙( 1 9 7 9 年) 分离了台湾根 霉q 3 0 3 ( r h i z o p u s f o r m o s a e n s i s ) ，它的生长速度快，糖化力比a s 3 8 6 6 更强，但酒化酶活力稍 弱，也是目前工业上应用最广的菌种之一。 在菌种分离技术方面，研究人员进行了大量工作。1 9 9 9 年，黄萍等【2 2 l 利用原生质体培养 技术选育根霉新菌株。结果发现，将纯化后的根霉q 3 0 3 原生质体涂布于再生培养基上培养， 在3 0 c 下暗培养1 2 h 后，约1 4 的原生质体再生长出菌落，而且此种再生菌株在形态及生长 习性上与原菌株并无明显差异，表明了通过原生质体培养选育根霉优良菌株的是可行的。同 时建立了根霉q 3 0 3 原生质体的分离和再生的方法，为其原生质诱变育种、融合、转化奠定了 基础。2 0 0 2 年，李金生【2 3 】依据根霉在生长时首先长出丝状菌体，并具蔓延、伸展的特性，采 用菌丝切割移植方法，简化了操作程序。该方法选育获得一单条菌丝只需l o h 左右，大大缩 短了分离时间，简化了操作，而且具有较高的选育成功率，符合生产上简便、快速、实用的 要求，并在江苏的一些制曲推行，取得了良好的效果。 对菌株进行鉴定并归类，可以为以后学者的研究提供内容更详细的参考，研究人员对此 进行了大量工作。吴雪梅【2 6 】对广东省九江酒厂有限公司的小曲进行了分离鉴定工作，通过菌 落特征、形态、制片标本等实验对纯培养进行鉴定，得到四株根霉：华根霉( r h i z o p u sc h i n e n m s s a i t o ) ，少根根霉( r h i z o p u sa r r h i z o sf i s c h e r ) ，黑根霉( r h i z o p u sn i g r i c a n se h r e n b e r g ) 和米根霉 ( r h i z o p u so r y z a ew e n t e t p r i n s e ng e e r l i n g s ) 。周红丽等1 4 0 1 分析了衡阳一种民间酒曲的微生物组 成、菌落形态以及对主要酶活力进行了测定，得到一株z 0 6 根霉，具有较强淀粉酶活力与蛋 4 西南大学硕士学位论文文献综述 白酶活力。李健容纠1 9 】通过微生物的菌落特征、菌体形态观察和生理生化特征等检测，分离 出米根霉( r h i z o p u so r y z a ew e n t e tp r i n s e ng e e r l i n g s ) 和华根霉( r h i z o p u sc h i n e n $ i ss a i t o ) 。 1 3 2 诱变育种 在生物进化进程中，微生物形成了愈来愈完善的代谢调节机制，使细胞内复杂的生物化 学反应能高度有序地进行和对外界环境条件的改变迅速作出反应1 2 4 j 。因此，处于平衡生长， 进行正常代谢的微生物不会有代谢产物的积累。而微生物育种的目的就是要人为地使某种代 谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发 生基因的重新组合优化遗传性状，实现人为控制微生物，获得我们所需要的高产、优质和低 耗的菌种。诱变育种是是实现这一目标常用的方法【2 5 j 。诱变育种是指利用各种诱变剂处理微 生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。 为了提高根霉菌株的产酶能力，常通过物理、化学诱变的方法获得高产突变的菌株，或 者采用系统选育与诱变选育、性能测定与生产应用、制曲与酿酒相结合的方法，收集生产上 使用效果较好的曲样，从中分离纯化培养优势根霉菌，以此为出发菌株，经反复物理诱变处 理、生化性能测定、试验、鉴定，选育酶活力高适应性广、性能稳定等特性的优良根霉菌株【2 引。 喻风香等【2 7 】对根霉r a 1 菌株进行n a n 0 2 诱变和紫外线诱变，得到一株菌株，其液化酶比出 发菌株提高了4 8 6 2 ，糖化酶提高到出发菌株的5 6 7 8 ，低聚糖酶活力达到比出发菌株提高 4 0 3 7 ，并且对菌株进行了斜面传代，产酶性况非常稳定。袁静明【2 8 j 等从汾酒大曲中分离到 一株根霉，经诱变处理后获得了具有高产葡萄糖淀粉酶的变异株。该菌株经固体麸曲培养， 水抽提得到原酶液经层析后，得到了紫外光谱和电泳皆为均一的葡萄糖淀粉酶，总活力回收 达到7 0 ，比活力提高了2 3 7 0 倍。刘建军【2 9 】等从淀粉厂土样等样品中分离筛选到一支产淀粉 降解酶的根霉菌株，经紫外线及辐射诱变和自然分离，获得一个突变菌株p e - 8 ，经高压液相 色谱和纸层析分析证明，其分泌的淀粉降解酶类作用于适当液化的玉米淀粉产物中麦芽三糖 至麦芽八糖的比例达7 7 6 、葡萄糖含量仅为3 0 3 ，为麦芽低聚糖高产菌株。中国白酒界第 一位博士后徐成勇p o l 通过比较试验，采用平板透明圈筛选法选得透明圈直径较大的根霉糖化 酶产生菌株6 株，并通过试饭糖化力实验对所筛选的菌株进行了比较，得到了r h - 1 4 菌株， 具有很高的糖化力，产酸能力适中。任道群等【3 1 】用紫外诱变法诱变出c - 2 4 和l z - 2 4 两株根霉， 具有生长速度快，对酿酒原料( 大米、玉米、糯高粱、粳高粱) 适应性好，试饭糖分高等特 点，出酒率分别比q 3 0 3 提高了3 5 7 和3 4 5 。刘云秀等1 3 2 j 以华根霉3 8 5 纯种为出发菌株， 通过紫外线诱变处理，运用推理育种技术，选育到1 株突变株s u s e 华根霉2 ( 6 1 8 ) ，糖化力 和液化力都得到了提高，并且增加了芳香脂类和产生酒精的能力。可见诱变育种是提高产酶 能力的一个重要方法。 5 西南大学硕士学位论文 文献综述 1 3 3 制曲工艺条件的研究 微生物生长及产酶需要合适的条件，根霉也是如此。因此制曲工艺条件的研究是非常重 要的工作，在工艺条件适宜的时候，根霉产酶活性就强。曾令琴等【3 3 】以根霉q 3 0 3 为对照，研 究经分离纯化培养所得泰国优质甜酒曲中的根霉菌株r l 、r 2 的液化力及其影响因素，结果表 明：根霉菌株r 1 、r 2 在p h 5 2 6 4 、温度5 5 - 6 5 ( 2 、培养时间3 d 的条件下，液化力达到最大值， 并且与q 3 0 3 相比，其发酵产品有较好的色泽。姚万春等【3 4 】对根霉菌株c - 2 4 、q 3 0 3 、3 8 6 6 、 7 0 2 、y g 5 5 的产酶作对比试验，研究了培养基，加水量，培养温度以及原料对产酶的影响， 结果表明，三角瓶试饭产酶最适品温为3 0 3 2 - 3 5 ，用麸皮做固体培养基加水5 0 - 6 0 培养， c - 2 4 根霉曲的试饭糖化力最高达到5 8 4 9 m g ( g h ) 。刘宪春等【”】研究了水分与温度对根霉q 3 0 3 生长繁殖的影响，结果发现，在拌麸皮时加4 5 5 0 的水，制曲过程的品温最好控制在3 6 3 8 ；前期干燥温度一般为4 0 - 4 5 ，后期烘干温度可控制在4 5 5 0 。 传统小曲在制曲时，除了有米粉或麸皮等原料外，一般还添加一些其他物质( 如中草药等) 来促进微生物的生长代谢。那么，纯种制曲时，添加一些其他有利于微生物生长的原料，也 可能会提高产酶活性，许多学者对此进行了研究。田国政1 3 6 】对r h i z o p u s 3 4 菌株在制曲时添加 一定浓度的玉米粉，在不同培养时间和玉米粉浓度下培养产生的糖化酶、液化酶、蛋白酶的 活性进行了比较研究，当添加5 - 1 0 玉米粉时，三种酶活性都有不同程度的提高，并且力达 到最大值。李新社等【3 7 1 研究了不同何首乌叶添加量对小曲的微生物种类和数量、产酶的影响。 结果表明：在小曲中添加何首乌叶对小曲的质量有促进作用，不同的何首乌叶添加比例对小 曲的菌量、糖化力、液化力有着重要的影响，当何首乌叶的添加量为6 时，小曲的糖化力、 液化力和酒化力达到最大，而且感官指标也较好。陆步诗掣3 8 1 研究了在制曲过程中添加桑叶 对小曲质量的影响。结果发现，在一定范围内桑叶对小曲质量具有良好的促进作用，当添加 量为9 时，糖化力、液化力及发酵力都有所提高。 1 3 4 固定化技术的应用 固定化技术是2 0 世纪5 0 年代兴起的一种新型生物技术，是指利用物理或化学手段将游 离的细胞或酶与固态的不溶性载体相结合，使其保持活性并可反复使用的一种技术1 3 9 1 4 射。与 传统分批游离发酵相比，利用固定化微生物技术具有细胞负荷高、生物催化高效、细胞可反 复使用等优点，并可得到高的目标产量和原料转化率，易于实现细胞与产物分离，有利于实 现工艺过程的自动化、连续化，降低生产成本，具体表现在1 4 1 】：( 1 ) 生物反应器中可以获得极 高的菌体浓度，因而发酵速率可以大大提高，反应器设备的生产强度得以强化；( 2 ) 产物分离 纯化过程中菌体从发酵液中的分离十分容易；( 3 ) 固定化细胞可以重复或长期使用，这样既能 够简化游离细胞过程需要不断培养菌体的操作，又减少了营养物质的浪费，还提高了生产效 率。 近年来，研究人员对固定化技术在酿酒工业中应用的研究非常活跃。利用小曲中几种起 6 西南大学硕十学位论文 文献综述 主要作用的微生物，在特定生态关系中建立固定化多菌种的混合发酵体系，从多菌发酵的协 同性作用上探讨固定化多菌发酵的互生机制，以达到传统酿造技术改造的目的。许喜林等【4 3 j 对固定化根霉细胞经增殖后进行液体培养发酵产糖化酶进行了研究，结果发现，海藻酸钙是 适宜的固定化载体，相同条件下固定化细胞产酶较游离细胞高6 0 0 o - 8 0 ，而且可以连续使用 3 0 0 小时以上。王克明等1 4 4 1 以德氏根霉、酿酒酵母和产酯酵母共固定化细胞混合发酵葛根保健 酒进行了研究，结果发现：葛根粉浓度为4 ，菌种比例为根霉：酿酒酵母：产酯酵母= 2 ：l ： l ，发酵温度为2 5 ，发酵5 天，产酒为2 5 5 ( v v ) 、而且产品富含矿物质、微量元素、氨基 酸、维生素以及异黄酮类物质。陈军等【4 5 】利用小曲中分离到的乳酸菌l 3 、根霉r 2 和酵母y 5 的固定化培养，研究了三者之间的协同发酵性能。结果发现，当乳酸菌、根霉和酵母的固定 化颗粒分别以l ：2 ：1 的比例混合组成的确定性混合培养体系具有良好的协同发酵性能，同 时对该混合发酵体系的发酵条