（动物学专业论文）甘丙肽对ic神经元声信号处理的调制.pdf

硕士学位论文 、1 a sr e r s t j i e s i s 摘要 在听觉中枢系统中，动物听觉中枢处理声音强度和频率及其它时空特征主 要是通过神经元回路兴奋性和抑制性传入冲动的相互作用进行的。已有的研究 表明，y a m i n o b u t y r i ca c i d ( g a b a ) 、a c e t y l c h 0 1 i n e ( a c h ) 、9 1 u t a m i ca c i d ( g l u ) 、 g l y c i n e ( g i y ) 、5 h y d m x y t r y p t a m i n e ( 5 一h t ) 等神经递质在i n f e r i o rc o i i i c u i u s ( i c ) 听觉信息处理中起着重要作用。甘丙肽( g a l a n i n ，g a l ) 最初是1 9 8 3 年从猪 的小肠中分离、提取的一种含2 9 个氨基酸组成的多肽。后来发现g a l 在中枢 神经系统中与多种递质共存，在听觉以外的多方面发挥作用。故此对听觉系统 而言，如果g a l 有作用，可称之为是一种新异的听觉中枢调制物，本实验通过 观察离子电泳g a l 的方法，观察了g a l 对i c 神经元基本声反应特性( 如b f 、 m t 、发放模式) 、强度发放率函数和频率调谐曲线的影响，研究这种新异调 制物g a l 在i c 神经元处理声信息的作用。 本实验共获得9 6 个神经元，其中接受g a l 离子电泳注射并获得结果的有 3 0 个神经元。结果表明：( 1 ) 少数神经元( n = 5 3 0 ) 发放模式在给g a l 期问发 生改变，2 个相位型发放转变成相位爆发型发放，说明g a l 起到了一种易化或 兴奋性调制作用，使神经元兴奋增强而发放率增加；2 个神经元由相位爆发型 发放转变成相位型，和1 个神经元由持续型发放转变成相位爆发型，提示g a l 发挥了一种抑制性调制作用，使发放率受到抑制而下降。( 2 ) 半数神经元 ( n = 1 5 3 0 ) 的强度一发放率函数被g a l 改变。非单调型发放函数神经元中有1 个转变为单调型，4 个转变为饱和单调型；饱和单调型神经元有5 个转变成单 啁型，4 个转变成非单调型；单调型神经元中有1 个转变成饱和单调型；其余 则在g a l 注射后仍保持原函数类型。( 3 ) 还有部分神经元( n = 7 3 0 ) 受到g a l 兴奋，使其最大发放率显著提高。( 4 ) 部分神经元( n _ 7 2 5 ) 的f t c 在g a l 作用下显著锐化，而另一部分神经元( n = l l 2 5 ) 的f t c 在g a l 电泳注射期间 显著拓宽。 综上所述，对g a l 在听觉系统中作用的首次探讨，获得的结果富有重要的 启示作用。可以将其对听觉下丘神经元处理声信号的调制作用分为易化或兴奋 硕士学位论文 、1 、s i e r s 1 1 i i e s i s 性调制、抑制性调制、以及基本不受影响3 种类型。推测其原因可能是在不同 的i c 神经元上，存在有不同的g a l 受体亚型和与之共存的递质或调质不同时， g a l 所发挥的作用也不相同所致。从而动态调节听觉功能回路中神经元的兴奋 状态，使之以不同功能模式进行活动，有利于动物适应复杂的外界声信息处理。 关键词：甘丙肽神经调制声信号处理下丘 硕士学位论文 、j sr e r st i i e s i s a b s t r a c t i nt h ec e m r a la u d i t o r ys y s t e m ，t h ei n f o i t r l a t i o no ft h ef r e q u e n c y ，i n t e n s i 吼 t e m p o m la n ds p e c t r a lp r o p e n i e si n v o l v e di nm e s o u n ds i g n a li sp r o c e s s e dt h m u g h t h ec o m p l e xi m e g r a t i o no ft l l ee x c i t a t o r ya j l di i l l l i b i t o r yi n t e r a c t i o no ft h en e u r a l c i r c u i t s t h es t u d i e s p e r f o m l e dh a v e s h o w nt h a tn e l l r o t r a n s m i t t e r s ，s u c ha sy 一锄i n o b u t y “ca c i d ( g a b a ) ，a c e t y l c h o l i n e ( a c h ) ，g l u t a m i ca c i d ( g l u ) ，g l y c i n e ( g l y ) ，a n d5 一h y d r o x y t r y p t a m i n e ( 5 - h t ) p l a yak e yr o l e i np r o c e s s i n go fs o u n d s i g n a li ni n f e r i o rc o l l i c u l u s ( i c ) g a l a n i n ( g a i ) ，a2 9 锄i n o a c i dc 一锄i d a t e dp e p t i d e o r i g i n a l l yi s o l a t e df r d mt h ep o r c i n eg u ti n 19 8 3 ，h a sb e e nf o u n di tc o e x i s t sw i t h m a n y o t h e rn e u m t r a i l s m i t t e r si nc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ( c n s ) i t sm o d u l a t e de f f e c t o nal o to f 缸1 c t i o n a la c t i v i t i e so fc n si so b s e r v e d ，b u tw h e m e ri tm i 曲tm o d u l a t e r e s p o n s e so fa u d i t o r yn e u r o nr e m a i nl l r l d e t e n n i n e d b yi o n t o p h o r e s i sa p p l i c a t i o n o fg a l ，t l l ee f f b c t so fg a lo nb a s i cr e s p o n s ep m p e r t i e ss u c ha sr a t e i n t e n s i t y r m c t i o n s ( r i f s ) ，f r e q u e n c yt u n i n gc u e s ( f t c s ) ，d i s c h a r g ep a t t e mo fi n f c r i o r c o l l i c u l a rn e u r o n so fm o u s ew e r ei n v e s t i g a t e d at o t a lo f9 6n e u m n sw e r ea t t a i n e dw i t hs i n g l ea n dm u l t i u n i tr e c o r d i n gm e t h o d f r o mm o u s e ( f 淞m 淞c “，“5 ，k m ) i c 3 0o f9 6n e u m n sa c c e p t e di o n t o p h o r e s i so f ( j a la n dt h ee a e c t so fg a lo nt h en e u r o n a lb a s i cp m p e n i e s ，r a t e i m e n s i t yf h n c t i o n s ， a n df r e q u e n c yt u n i n g so fi cn e u r o n sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w ：1 ) f e wu n i t s ( n = 5 3 0 ) t r 锄s f o m l e dt 1 1 e i rd i s c h a 唱ep a t t e md u r i n gg a l 印p i i c a t i o n ：1 w o p h a s i cr e 印o n d e r s w e r ec h a n g e dt op h a s i cb u r s t e r ，21 w op h a s i cb u r s tr e s p o n d 盯st o p h a s i co n e s ，a n do n e t o n i cr e s p o n d e rt op h a s i cb u r s t i ts u g g e s tt h a tg a ls h a l le x e n f a c i l i t a t i n g o ri n l l i b i t o r ym o d u l a t i o no ni cn e u r o n s ；2 ) t h er i f so fh a l fu n i t s ( n = l5 ，3 0 ) v a r i e da f k rg a l 印p l i c a t i o n ：0 fn o n m o n o t o n j cr i f s ，o n ew a sc o n v e r t e d t om o n o t o n i cr jf ，4t os a t u r a t e dm o n o t o n i c ，w h i l es a t u r a t c dm o n o t o n i cr i f s ，f i v e t om o n o t o n j ca r i df b u rt on o n m o n o t o n i c t h eo t h e r sr e m a i n e dt h e i rr i f s 硕士学位论文 1 、s i t r s t l i e s c o n 疗g u r a t i o n ；3 ) f a c i l i t a t e dr c s p o n s eo ff e w 蛐i t s ( n = 7 3 0 ) b yg a la p p l i c a t i o n w c r e o b s e r v e d t m a x i m a ld i s c h a 唱e so ft 1 1 e s en e u r o n si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yd u r i n g g a la p p l i c a t i o n ；4 ) t h ef t c so ff b wu n i t s ( n = 7 2 5 ) w e r es h a r p e n e d ，w h i l et h e o t h e r s ( n = 1 1 2 5 ) 、v e r eb r o a d e n e db y g a l o u ra b o v er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec h a r a c t e r i s t i c so fm o d u l a t i o no fg a la r e c o m p l e x t h o u g h ta1 0 to fn e u m n sw e r cu n a h e c t e d ，e x c i t a t o r ym o d u l a t i o n sa 1 1 d i n h i b i t o r ym o d u l a t i o n so fg a lo nt 1 1 er e s p o n s e sp m p e r t i e so fi cn e u r o n sw e r e e m e r g e d i ti ss u g g e s t e dt h a tf o rd i 旋r e n ts t a t e so fn e u r a lc i r c u i t s ，d i 行e r e n tg a l a n i n r e c e p t o r s ( g a l r s ) o fg a lm a yb ei n v o l v e di nt h ep r o c e s s i n go fs o u n ds i g n a l 0 u r d a t aa d dt h ee v i d e n c et o s u p p o r tt 1 1 en o t i o nt h a tt h en e u r o m o d u l a t o r s ，f o rb e t t e r p r o c e s s i n go fc o m p l e xs o u n ds t i m u l io ft h ee x t e m a lw o r l d ，s h o u l db et a 量np a r ti n f u n c t i o n a l l yr e c o n f i g u r i n ga w i d er a n g eo f n e u r a lc i r c u i t s k e y w o r d s ：g a l a n i n ；m o d u l a t i o n ；i n f e r i o rc o l l i c u l u s ；m o u s e 硕士学位论文 、l 、s i e r sl i i e s i s a b b r e v i a t i o n 英文缩写英文全称中文全称 a ( ：h a f ) a l a b f b i c c g r p c n s d a d n l l e f t c f f r c g a b a g a l g a l r g h g h r h g i v g 1 u g d r o t e in 5h t i c a c e t y l c h o l i n e a l z h e i m e rd i s e a s e a l a n i n e b e s t f r e q u e n c y b i c u c u l l i n e c a l c i t o n i ng e n r e l a t e dp e p t i d e c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m d o p a m i n e d o r s a ln e u c l e u so fl a t e r a l l e m n i s c u s e x c it a t o r yf t c f r e q u e n c ym o d u l a t i n g f r e q u e n c yt u n i n gc u r v e y a m i n o b u t y r i ca c i d g a l a n j n g a l a n i nr e c e p t o r g r o w t hh o r m o n e g r o w t hh o r m o n er e l e a s i n gh o r m o n e g l y c i n e 9 1 u t a m i ca c i d g u a n i n en u c l e o s i d er e g u l a t o r y p r o t e i n s 5 一h y d r o x y t r y p t a m i n e i n f e r i o rc o l1 i c u l u s 乙酰胆碱 早老性痴呆 丙氨酸 最佳频率 荷包牡丹碱 钙基因相关肽 中枢神经系统 多巴胺 外斜体背核 兴奋性频率调谐曲线 频率调制 频率调谐曲线 y 一氨基丁酸 甘丙肽 甘丙肽受体 生长激素 促生长素释放激素 甘氨酸 谷氨酸 鸟嘌呤核苷调节蛋白 5 一羟色胺 下丘 硕士学位论文 、1 i e r si l f e s i s in h i b i t o r yf t c i n s u l jn o s i t o l t r i p h o s p h a t e i n h i b i t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l 1 a t e n c y l u t e i n i z i n gh o r m o n er e l e a s i n g h o r m o n e l a t e n c y i n t e n c i t yf u n c t i o n g a l a n i t i d e m e d i a lg e n i c u l a t eb o d y m u s c a r i n er e c e p t o r m i n i m u mt h r e s h o l d n o r a d r e n a l i n e p a s s i v ea v o i d a n c ep r o c e d u r e p h a s i c p h a s i cb u r s t p r o l a c t i n p u ls er e p e t jti o nr a t e r a t ei n t e n s i t yf u n c t i o n p o s t s t i m u l u st i m eh is t o g r a m s o m a t o s t a t i n s u b s t a n c ep s t r y c h n i n e t o n i c v e n t r a lh i p p o c a m p u s v a s o a c t i v ei n t e s t i n a l p e p t i d e 抑制性频率调谐曲线 胰岛素 三磷酸肌醇 突触后抑制电位 反应潜伏期 促黄体生成素释放激素 强度一潜伏期函数 g a l 拮抗剂 内侧膝状体 毒蕈碱受体 最小闽值 去甲肾上腺素 被动回避行为程序 相位型 相位爆发型 催乳素 脉冲重复率 强度一发放率函数 刺激后放电直方图 生长抑素 p 物质 士的宁 紧张型 海马腹侧 血管活性肠肽 t s ；s t r f 5 b r f t m r p 汴h h u m 眦m 队 。曲儿阳阱陌e弓 吼。州 1 、引言 1 1i c 中神经递质的分布及其在听觉信息处理中的基本作用 神经递质是整合抑制和兴奋作用的基础。在i c 内发现有多种递质分布，如 g 卧、g ly 、a c h 、5 一h t 、g l u 等。 g a b a 是t c 中分布广泛且作用显著的一种抑制性神经递质，对不同动物的 听神经元发放率均有一定的抑制性影响，但作用可因不同结构或同一结构不同 的区域而有所不同( c a s p a r ye ta l ，1 9 7 9 ；p a l o m b i a n dc a s p a r y ，1 9 9 2 ) 。 在蝙蝠的d n l l 以及i c 等部位均可观察到神经元对b i c 敏感并显示出放电率增 加，m u c i m a l 作用则相反( p a r ka n dp 0 1 l a k ；1 9 9 4 ；y a n ga n dp o l l a k ，1 9 9 4 ： r ( ，1 1 a ka n dp a r k ，1 9 9 5 ) 。l a t 已被证明是单耳和双耳声信息处理过程中的关 键因素。陈其才等( 1 9 9 4 ) 观察到蝙蝠i c 神经元随p r r 增加其l a t 延长的现 象，注射g a b a 受体拮抗剂b i c 后l a t 则不再延长，表明i c 神经元的l a t 受 到g a b a 抑制的影响( j e ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 。通过离子电泳给b i c 阻断g a b a 抑制，须蝠i c6 0k h z 等频区内一半以上神经元l a t 缩短了卜5m s ，其中约 2 ( ) 则缩短了5 3 0m s ，而且有迹象表明丘脑神经元的l a t 变化范围较那些向 它传递兴奋性投射的低位核要宽，这一现象亦同样被认为是由于g a b a 抑制所 致( p a r ka n dp o l l a k ，1 9 9 3 ；p o l l a ka n dp a r k ，1 9 9 5 ) 。但该现象并非在其 它动物中都存在；b e a u 等( 1 9 9 6 ) 就曾指出，g a b a 改变蝙蝠i c 神经元l a t 是回声定位蝙蝠独有的特性。当在须蝙蝠i c 离子电泳给b i c 阻断g a b a 能抑 制后，可见神经元f t c 大大加宽。关于这种g a b a 抑制的起源，除上行抑制性 投射外( p a r ka n dp 0 1 1 a k ，1 9 9 3 ：p 0 1 1 a ka n dp a r k ，1 9 9 5 ) ，陈其才和孙心 德( 1 9 9 4 ，1 9 9 6 ) 等还发现有来自a c 的下行g a b a 能抑制存在，另可能还 有局部g a b a 能神经元参与。y a n g 等人( 1 9 9 2 ) 的研究显示，b i c 能阻断g a b a 能受体，拓宽许多神经元的f t c ，这为f t c 被g a b a 抑制所锐化提供了直接证据。 g 1 y 是中枢神经系统的另一种抑制性神经递质，在实验中给g 1 y 后神经元 硕士学位论文 、1 、s l e r s f l i f e s l s 发放率呈剂量依赖性减少，g l y 能受体拮抗剂s t r y 在对发放率产生影响时也常 对发放模式产生影响，但发放率改变并不等同于反应时程度的改变( b e a ue t a 1 ，1 9 9 6 ) 。g a b a 和g l y 离子电泳使神经元产生一个剂量依赖型发放率减少， 人多数受试神经元在给b i c 、s t r y 后都变为梳状放电模式，但对l a t 无明显作 用( e v a n sa n dz h a o ，1 9 9 3 ) 。b e a u 等( 1 9 9 6 ) 发现g l y 能抑制对i c 单位的时 间发放模式产生重要影响，并能调节发放模式，可能受兴奋一抑制性传入冲动 之间相互作用的时间差或这些传入冲动为特异膜电导的影响所调制。s t r y 对 o n s e t 发放成分和s u s t a i n 发放成分的影响因对照p s t h 类型的不同而存在差 异，意味着不同神经元的抑制性传入冲动的时程和强度不同。 c h 是一种经典的神经递质，在i c 也有发现( h a b b i c h ta n dv a t e r ，1 9 9 6 ) ， 其胆碱成分能兴奋或抑制单个i c 神经元的发放，调节i c 神经元活性水平，对 声刺激特别构型( 特别强度、特异频率) 的编码起到神经递质作用，因其受体 分布不同，对神经元活性的调节随受体分布区域存在差异，其精确调节功能尚 待进一步研究。 引 1 能神经几乎投射到所有听觉脑干神经元；它能改变6 6 的记录神经元 的声诱发反应，其作用随声信号时间空间结构的不同而存在差异，例如，在大 多数细胞中5 一h t 对短声反应主要为抑制，对f m 反应既有兴奋也有抑制，另外， 它对不同时空结构f m 反应也产生不同效果，这可能是5 一h t 调制某些兴奋性和 或抑制性突触，不仅作用于细胞的i f t c ，也作用于e f t c ，在不同时空结构声刺 激中两种作用通过不同组合产生抑制或兴奋( h u r l e y ，1 9 9 9 ) 。故推测：特殊 声诱发反应并不仅仅包含单一固定i c 听觉连接通路，5 一h t 能和其它神经调质 的介入使神经元听觉信息处理具有广动力学范围。 1 2 有关甘丙肽对中枢神经系统作用方面的研究 ( ；a l 最初从猪的小肠中分离、提取，是一种由2 9 个氨基酸组成的多肽 ( t a l e m o l oe ta l ，1 9 8 3 ) 。由于发现时其功能未知，故根据该多肽n 端为g l y 和c 。端为a l a 这一特征将其命名为g a l 。近年来，有关g a l 的研究日益受到国 际神经科学界的重视，1 9 9 1 年和1 9 9 8 年两次在瑞典召开了关于g a l 的国际学 2 硕士学位论文 、1 、s e r s1 1 【e s i s 术大会。现有资料表明，g a l 广泛存在于机体的神经系统中，是中枢和外周神 经系统中种重要的调制物。 放射免疫组织化学研究显示，g a l 免疫反应阳性神经元广泛存在于大鼠中 枢神经系统。在脊髓，g a l 样免疫活性( g a l l 1 ) 神经元存在于背角表层的小 型初级传入神经元轴突，以及局部中间神经元和脊髓固有层，含g a l l l 的胞 体亦在腹角发现。在脑干，g a l 定位在延髓腹侧表面，三叉神经尾核、孤束核、 迷走背核、脑桥的蓝斑和中脑导水管中央灰质，并少量分布于下丘。下丘中含 有中低浓度g a l 的神经元发现于猫i c 臂状核和中央周围核，提示了g a l 在听 觉机制中产生作用( m a r c o se ta 1 ；1 9 9 4 ) 。在间脑，g a l 密集在下丘脑外侧 区、视上核、室旁核、结节核、弓状核及丘脑室周区。在前脑，g a l 主要分布 于杏仁核、尾核、海马、中隔一基底前脑结构和梨状皮层。 免疫组织化学研究还显示g a l 与部分经典递质共存于同一神经元中，研究 g a l 与其它神经递质相互作用不仅对认清g a l 生理功能提供依据，而且可进一 步阐明经典递质在中枢的作用机制。在哺乳动物脑中，与n a 共存于篮斑，与 5 h t 共存于中缝核，与d a 共存于正中隆起，与组织胺共存于弓状核，与a c h 共存于腹侧海马，并在多处与g a b a 共存。 在对行为调节方面，g a l 和5 一h t 能神经传递能影响动物p a 的执行，是中 脑5 一h t 的强力调制物( o g r e ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。另外，g a l 使新纹状体和嗅球 的d a 含量呈剂量依赖性增加，并显著减少自发运动活动。在伏隔核g a l 通过 激活d a 能系统抑制体内胆碱能活性，从而刺激摄食( r a d ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 在对神经损伤和反射调节方面，外周神经损伤可引起g a l 在相关神经元中 表达增强，提示该物质也许和s p 、s o m 、v i p 以及c g r p 一样，在肽能神经传入 中超传递或调制( m e d i a t e d ) 作用( h o k f e l te ta 1 ，1 9 9 4 ) 。另外，还发现g a l 可抑制脊髓反射，并具镇痛作用，据其在脊髓中的分布特征，它随外周神经的 损伤在背根神经节中显著增加并存在于感觉传入神经元，提示其在传递温热感 觉和机械伤害性感觉方面的作用。h o k f e l t 等8 0 年代研究表明，大鼠蛛网膜下 腔注射g a l ，可呈剂量相关性( 0 6 5 6 5n m 0 1 ) 抑制背根刺激引起的伤害性 反射，并拮抗s p 对伤害性反射的易化作用，该反应不能被纳洛酮翻转，提示 有可能是通过突触后抑制，直接降低s p 的去极化反应所致。这一结果可由g a l 3 硕士学位论文 1 、s 【e r sl i i e s 【s 被受体拮抗剂g a l a n t i d e ，m 3 5 阻断吗啡镇痛效果加以确认。神经损伤大鼠研 究也从行为水平表明内源性g a l 具有潜在的抑制伤害性信息传递的作用。g a l 在痛觉信号处理过程中的作用较为复杂，在脊髓水平，g a l 与内源性阿片肽协 同抑制伤害性信息传递，一般起抑制作用，但在低剂量时也呈兴奋作用( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。三种不同亚型的g a l r 通过不同信号途径作用可对此作出部分 解释：高剂量g a l 通过g a l r l 介导产生镇痛作用，而低剂量g a l 通过g a l r 2 受 体介导产生伤害感受( l i u ，2 0 0 1 ) 。目前基本上能肯定的是：1 ) g a l 对伤害性 信息传递有抑制作用；2 ) g a l 总是伴随神经元损伤而表达增高，它与神经元的 再生、神经与靶组织的重建密切相关；3 ) a d 与g a l 在基底前脑等区域含量增 加成密切正相关。 在有关g a l 对学习和记忆的影响研究方面，向几种啮齿类动物中枢海马注 射g a l ，均有抑制学习和记忆的作用，而注射g a l 拮抗剂m 3 5 则能提高动物的 学习成绩，说明内源性g a l 可在学习中起抑制作用( 0 9 r e ne t a 1 ，1 9 9 9 ) 。 有组织学分析证实，g a l 阳性纤维和末梢在a d 病人基底前脑区极为密集，提示 g a l 可能在胆碱能细胞体及胆碱能终末的突触前膜上经突触前抑制a c h 释放， 发挥抑制作用( c r a w l e y ，1 9 9 6 ) 。在研究中还发现，g a l 对海马各区空问认知 记忆的调制效果不同，可能是不同区域g a l r 亚型和神经激活方式不同，如g a l 一般通过g a l r l 受体发挥作用，而在包含g a l 的n e 能末梢分布区域调制活性 则主要通过g a l r 2 受体。而且g a l 对认知影响不是严格的剂量依赖型，与体内 胆碱能传递变化也不直接相关，如在脑的不同部位( 海马腹侧和背侧) 对a c h 释放影响存在差异，表明还有其它递质的参与( o g r e ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 关于g a l 受体及作用机制的研究：9 0 年代后，编码猪、大鼠、牛和人的g a l c d n a 纷纷被克隆，目前已知数种脊椎动物的g a l 序列( 张艳萍等1 9 9 8 ) 。种属 同源性表明，g a l 的n 一末端卜1 5 是高度保守的，系受体作用部位，c 一未端则 表现出种属特异性。根据分别克隆出的人脑和大鼠脑中的g a l 受体的c d n a ，推 导出的g a l 受体有3 4 6 和3 4 9 个氨基酸残基，他们有9 2 的同源性，具有典型 的与g p r o t e i n 偶联的受体特点( h o w a r de ta 1 ，1 9 9 7 ) 。现已有几种g a l 受 体拮抗剂，他们均为多肽类，例如，将g a l ( 卜1 3 ) 与s p ( 5 11 ) 酰胺连接成 一嵌合体( 即m 1 5 ) ，可以对抗g a l 对神经元的抑制作用( h o w a r de ta l ；1 9 9 7 ) 。 4 硕士学位论文 、l 、s l e r s t i i e s i s 根据使用多肽拮抗剂进行的行为学或生理学研究结果推测，g a l 受体存在不同 的亚型。g a l 的作用能被m 3 5 完全阻断，说明它通过膜联高亲和g a l r 实行其功 能。内源性g a l 主要由n a g a l 神经元胞体和树突释放对自身受体和临近的神 经细胞膜上的受体产生作用( p i e r i b o n ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 。g a l 受体广泛分饰于 中枢神经系统，属于g 蛋白偶联受体大家族( 张艳萍等，1 9 9 8 ) 。三种g a l r 亚 型被分辨出来：g a l r l 、g a l r 、g a l r 3 。g a l 与g a l r l 、3 的绑定抑制了腺苷酸 环化酶，而与g a l r 2 绑定激活磷脂酶c 活性，提高ip 3 转换，提高了受体亚型 在相互独立的分子串联事件( d i v e r g e n tm 0 1 e c u l a rc a s c a d e s ) 中的功能，并 可能产生不同生理作用( w y n i c ke ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 g a l 的主要效应为抑制，脑内注射g a l ，蓝斑核神经元和组胺能神经元放电 受到抑制，细胞膜电位表现出超极化( 邹冈，1 9 9 3 ) ，产生i p s p 。观察豚鼠g a l 对 3 h a c h 释放的影响研究发现g a l 不改变a c h 基础水平的释放，但明显减少 电刺激v i p 或p 物质引起的a c h 释放，表明g a l 起着一种调制性作用。g a l 可 能通过抑制磷脂肌醇水解和或抑制腺苷酸环化酶两种途径抑制神经递质释放 和神经元发放率抑制，影响认知和记忆。在海马腹核，g a l 通过电压敏感性c a 通道减少钙离子内流，抑制碳酰胆碱传递的刺激；在小肠分泌细胞，g a l 激活 a t p 敏感k 通道；在大鼠背根5 一h t 神经元中g a l 通过突触后受体提高k + 通透性 产生抑制作用( x ue ta 1 ，1 9 9 8 ) ；在前脑g a l 能够对突触后5 一h t l a 传递产 f l 短程调制。 1 3 研究g a l 调制声信号处理的意义 神经肽是由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接组成的分子，在神经系 统中它常常与经典神经递质如a c h 、n a 、5 一h t 等共存于部分神经元中，并一同 被分泌( m a r c o s ，1 9 9 4 ；沈上，韩济生，1 9 9 5 ) 。一个神经元释放两个或两个 以上的神经调节物，可以使神经调节更加精确，更加多样化，范围亦更为扩大。 脑内产生神经肽的神经元若发生功能异常，无论是先天的、中毒的、感染的或 是正常衰老的原因，都可能导致神经活动的紊乱，继而导致行为变化以及自主 和躯体神经系统功能的变化。据信，对这一系统的生理学阐述可能改变目前关 于c n s 功能的流行观点( h o k f e l t ，1 9 9 1 ) 。 尽管有关i c 神经元声反应特性的研究已取得长足进展，但离阐明其功能意 义与机制则还相距甚远。在i c 神经递质方面，目前人们仍主要集中于g a b a 、 g 1 v 、g l u 等几种经典递质的研究。既然放射免疫组织化学研究已显示在下丘存 在含有中低浓度g a l 的神经元，那就必定产生某种作用，尤其是g a l 能否在i c 神经元信息处理中发挥某种调制性影响，尚未见有报道，本研究对这方面做初 j 探索。 6 硕士学位论文 1 1 1 e r sl i e s i s 2 1 实验动物制备 2 材料和方法 本研究使用实验动物为湖北省卫生防疫站饲养的清洁级小鼠( k u n m i n g m o u s e ，胁s 用“s c u “sk m ) ，共2 2 只，雌雄不拘，体重2 0 3 5 克，均健康， 听力良好。 本实验的手术方法主要参照c h e na n dj e n ( 1 9 9 4 ) 。小鼠在手术前先用戊巴比妥钠 ( 4 0 + 5 0m g 爪gb w ) 经腹腔注射麻醉，随后头部去毛，暴露额项骨，除去上面的肌肉和 结缔组织，仔细清理头骨表面。动物移于手术显微镜f ，将一个1 8c m 长的平头钉用超 强力胶粘定在头项颅骨上，使之能用于小鼠头部固定。在声刺激耳对侧的颅骨上根据骨线 对i c 所在付置定何，并制各5 0 0 8 0 0um 的小孔，用自伟4 的小针挑破脑膜，暴露i c ，以 便插入电极。上述操作完成后，将动物安放于无回声屏蔽室中自制的动物装置上，头骨上 的头j 铍迮丁一特制的铜支架上，以i 划定头部。手术后2 3 小时之后开始记录，在实验期 间根据需要补注戊巴比妥钠，使动物维持在浅麻醉状态。无回声屏蔽室室内温度控制在 2 50 c 2 8o c 。 2 2 实验用品与仪器 戊巴比妥钠( n e m b u t a l ，p e n t o b a r b i t a ls o d i u m ) 、5 0 2 胶( a c r y l i cg l u e ) 、 2mn a c l 溶液( p h7 4 ) + 快绿( f a s tg r e e n 2 ) ( 便于电极定位) 、0 1 6m n a c l 溶液( p h3 o ) 、1 0 【f i mg a l ( s i g m a ) 溶液、0 1 mh c l 。 手术显微镜( s x e l ，上海医用光学仪器厂) 、微电极拉制器( b i o s c i ，英 国) 、微电极推进器( d a v i d k o p f6 4 0 ，美国) 、微电极放大器( i s 0 一d a m ，w p i ， 荧囡) 、离子电泳注射仪( m o d e l 2 6 0 ，w p i ，u s a ) 、函数信号发生器( g f g 一8 0 1 6 g ， g o o dw 订1 i n s t r u m e n t ，中国台湾) 、短声发生器、d b 衰减器( l a t 一4 5 ，l e a d e r ， j a p a n ) 、混音器( 自制) 、功率放大器( 自制) 、超声喇叭( 腿k ，德国) 、生物 电信号放大器( i s o d a m ，w p i ，美国) 、示波器( p m 3 0 8 0 ，f l u u k e ，美国) 、监 7 听装置( g r a s s ，美国) 、计算机。仪器连接方法见李安邦等，2 0 0 l 。 2 3 电极制备 单管玻璃电极( 内径1 o m m ) 购自中科院上海生理所，多管电极购自美国 w p i 公司。 本实验所用电极为多管电极，制备方法主要参照h a v e r y 和c a s p a r y ( 1 9 8 0 ) 创立的p i g g y - b a c k e d 方法。临实验之前分别拉制多管玻璃微电极 ( m u l t i b a r r e lm i c r o e l e c t r o d s ) ( 尖端总直径1 0 一1 5u m ) 和单管玻璃微电极 ( 尖端直径 0 0 5 ) ；少数( n = 7 3 0 ，2 3 3 ) 神经元的最大发 放率在给g a l 期间增加( 旷o 0 3 7 ，即仄o 0 5 ) ，有显著性差异，故g a l 提高神 经元声反应最大发放率是有生物学意义的。 1 6 1 0 0 垂 。 石2 0 0 n 1 5 0 1 0 0 5 0 0 一p r e g a i o g a i 2 04 06 08 01 0 0 i n t e n s j t y ( d bs p l ) 1 7 图5 g a l 对神经元发放率的 影响。a ：g a l 抑制声诱发的反戍 使发放减少，最大发放率在给药 后降低了2 4 ；b ：g a l 对声诱发 的反应基本没有影响，在给药后 仅增加了8 ；c ：g a l 易化神经元 声诱发的反应使最大发放率增加 了1 3 9 。箭头：晟大发放率；白 分数：g a l 使神经元最人发放率变 化的百分比。n ：最大发放率变化 相同的神经元的数量。a 、b 、c 二 个神经元的记录深度( um ) 、b f ( k h z ) 、m t ( d bs p l ) 分别是( a ) 1 1 2 0 、2 0 5 、3 1 2 ：( b ) 1 2 1 7 、 1 72 、9 9 ：( c ) 1 2 9 8 、2 2 0 、3 2 4 。 伽 伽 o 瑚 瑚 n，s|nqe=o0z 硕士学位论文 、1 、s i e r si i i e s 【s n h - b i t i o nn o ta 仟e c t e df a c i l i t a t i o n 3 4 g a l 对神经元频率调谐的影响 图6 给g a i 前和此 期问的神经元最大发放 率的平均变化。柱项部的 垂直线为1 2 标准著( 1 2 s d ) ；n ：神经元数量。 ： 俨0 0 3 7 ( 疥o 0 5 ) ，具有 显著性差异。 在本实验中还观察3 0 个给g a l 神经元中有2 5 个神经元给g a l 前后f t c 的 变化。g a l 要么使神经元f t c 产生锐化，要么拓宽，要么没有影响。图7 a 显示 给( ；a l 期间神经元m t 升高，f t c 锐化；图7 b 为g a l 对神经元f t c 没有影响； 图7 c 显示给g a l 期间神经元f t c 拓宽。 0 0 0 o 0 加 帖 竹 5 iln至苗nmjn c l e e3ujix晒lu芑c毋。乏 硕士学位论文 、1 、s 1 1 e r s _ l i i e s i s o 2 0 - 4 0 占0 8 0 一p r e g a i o g a l 051 01 52 0 2 53 0 f r e q u e n c y ( k h z ) 图7 g a l 对神经元频率调谐的影 响。a ：g a l 使神经元f t c 锐化；b ：g a l 对神经元频率调谐基本没有影响；c ： g a l 使神经元f t c 拓宽。n ：f t c 变化 相同的神经元的数鼙。a 、b 、c 二个 神经元的记录深度( um ) 、b f ( k h z ) 、 m t ( d bs p l ) 分别是9 2 4 、1 5 7 、2 8 3 ； 1 0 4 8 、1