（农药学专业论文）莠去津降解细菌hb5的鉴定、发酵及其降解酶初步纯化的研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 h b 5 是本实验室从农药厂废水中分离得到的一株莠去津降解细菌， 前期研究结果表明，根据降解菌l i b 5 的菌体、菌落形态以及生理生化特 性测定，初步鉴定其为革兰氏阳性的节杆菌属；当温度为3 5 c ，p h 为8 5 时，降解酶对莠去津的降解率最高。本文以莠去津降解细菌h b 5 作为主 要的研究对象，利用现代分子生物学的手段对其进行了鉴定；对f i b 5 产 降解酶的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了优化，并对其产生的降解酶的 分离纯化进行了初步探讨。 主要内容如下： 1 介绍了莠去津的理化性质、国内外应用概况，以及由于其广泛应用 所带来的环境污染问题；在对前人工作总结分析的基础上，对莠去律在环 境介质中的残留动态、降解代谢以及生物修复技术进行了综述：并对1 6 s r r n a 基因序列的同源性分析用于细菌系统分类鉴定，莠去津降解细菌的 摇瓶发酵研究以及酶的分离纯化等方面进行了简要概括。进而提出了作者 要研究的问题。 2 通过对菌株l i b 5 的1 6 sr d n a 序列的同源性分析，菌株h b 5 与 a r t h r o b a c t e rs p a d 3 同源性达9 9 3 ，进一步将其鉴定为节杆菌属 ( a r t h r o b a c t e r ) 。 3 以从降解细菌h b 5 中提取到的降解酶对莠去津的降解率为指标， 进行最佳产酶培养基及发酵条件的研究，以提高其产酶量。通过单次单因 子试验、正交试验和均匀试验，对细菌h b 5 的发酵培养基与发酵条件进 行了优化。结果表明， 最佳发酵培养基配方为：蔗糖3 0 9 l ，莠去津0 3 8 9 l 一，k 2 h p 0 4 0 5 9 l 1 ，k h 2 p 0 41 2 9 l 一，m g s 0 4 7 h 2 01 2 9 l 1 ，n a c io 1 9 l - 1 ，微量元 素溶液3 s m l l 。 最佳发酵条件为：培养时间4 8 h ，接种量2 ，发酵液初始p n 9 ，2 5 0 m l 的三角瓶装液量为8 0 m l 。 运用最佳发酵培养基在最优条件下发酵，降解酶对莠去津的降解率 ( 9 1 6 4 煳比原培养基( 4 0 6 7 ) 提高了1 2 5 。 4 对降解细菌h b 5 产生的降解酶进行了分离纯化研究。提取到的降 v 莠去津降解细菌h b - 5 的鉴定、发酵及其降解酵初步纯化的研究 解酶租酶液经3 0 - 7 0 硫酸铵分级沉淀，得到的酶液利用透析袋透析去 除硫酸铵及其小分子物质。酶液进一步利用d e a es e p h a r o s ef f 离子交换 柱层析和s e p h a c r y ls - 3 0 0 h r 分子筛层析进行了分离纯化，得到一个具有 降解活性的分离组分。 关键谒：莠去津：降解酶：发酵；1 6 sr d n a ；分离纯化 v i 山东农业大学硕士学位论文 c h a r a c t e r i z a t i o n ，f e r m e n t a t i o no f a t r a z i n ed e g r a d i n g b a c t e r i u mh b - 5a n d e l e m e n t a r yp u r i f i c a t i o no f i t s d e g r a d i n ge n z y m e w a n gq i a n ( c o l l e g eo f p l a n tp r o t e c t i o n , s h a n d o n ga g r i c u l t u r eu n i v e r i s t y , t a i a n , c h i n a , 2 7 1 0 1 8 ) a b s r a c t i nt h i s d i s s e r t a t i o n , t a k i n ga t r a z i n ed e g r a d a t i o nb a c t e r i u mh b - 5a sa p l i n 壤r ym o d e l ，a n d i t s i d e n t i f i c a t i o n , o p t i m i z e d c u l t u r em e d i u ma n d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n de b z y l n ep u r i f i c a t i o nw e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y 1 r i 圮r e s u l t sc o u l db es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 n 蛤s i t u a t i o no fa p p l i c a t i o n , p o l l u t i o na n dm o b i l i t yi ne n v i r o n m e n t , e c o l o g i c a lt o x i c o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dp o l l u t a n tb i o l o g i c a lm a n a g c r n e n t o f a t r a z i n e ，w h i c hh a db e e na p p l i e de x t e n s i v e l ya l lo v e l t h ew o r l da n dr e c e n t l y i nc h i n a , w a si n t r o d u c e d 1 1 l ek n o w l e d g eo f b a c t e r i u mi d e n t i f i c a t i o nb y 1 6 sr r n a , f l a s k - w a v e sf e r m e n t a t i o na n de n z y m ep u r i f i c a t i o nw e r ea l s o e x p o u n d e d a c c o r d i n g l yt h ei s s u e st h a tw o u l db ei n v e s t i g a t e dw a sp r e s e n t e d b yt h ea u t h o r 2 c l a s s i f i c a t i o no f i s o l a t e dl i b 一5w a sd e f i n i t e db ym o l e c u l a r c l a s s i f i c a t i o n b l a s ta n a l y s i so f i t s1 6 sr d n ag e n es e q u e n c es u g g e s t e dt h a t t h ei d e n t i t yo f w i t ha r t h r o b a c t e rs p a d 3 a c c o r d i n gt op o l y p h a s i c t a x o n o m i c a lp r i n c i p l e , s t r a i nl i b - 5i sd e n o m i n a t e d 嬲a r t h r o b a c t e rs p 3 a na t r a z i n eb i o - d e g r a d a t i o nb a c t e r i u m 似r t h r o b a c t e r 卿z ) ，n a m e da s h b 一5 w a si s o l a t e df r o m 、 r a s t c fw a t e ro fp e s t i c i d e si no u rl a b o r a t o r y t h e o p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n df e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u mo fh b 5 w e r es e l e c t e db yu n i f o r me x p e r i m e n t a ld e s i g na n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t , a n d t h ea m o a n to ff f l l z y m ep r o d u c t i o nf r o mh b 5w g l - ee s t i m a t e db yt h e v 莠去津降解细菌f i b 5 的鉴定、发酵及其降解酶初步纯化的研究 d e g r a d a t i o nr a t eo fa t r a z i n e n l ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e r ea n a l y z e db yt h e s a ss y s t e m i tw a sf o u n dt h a tt h ei d e a lc o m p o s i t i o no fc u l t u r em e d i u mo f f i b 一5i n c l u d e ds a c c h a r o s e3 0g l 。，a t r a z i n e0 3 8g l ，k 2 h p 0 41 2g l ， k 2 h p 0 4 0 5g l m g s 0 4 7 h 2 01 2g l 一，n a c lo 1 9 l 1 ，m i c r o e l e m e n t3 8 m l l 1 n l eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n so fh b 5w e r e ：t h ec u l t u r et i m ew a s4 8 h , t h ei n o c u l u ms i z ew a s2 t h ei n i t i a lp hw a s9 0a n dt h ea m o u n to fc u l t u r e m e d i u mw s i s8 0 m 1 t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fa t r a z i n eb yt h eo p t i m u m f e r m e n t a t i o nl i q u i dr e a c h e du pt o9 1 6 4 ，a n di n c r e a s e d1 2 5 a sc o m p a r e d w i t ht h eo r i g i n a lc u l t u r em e d i u m ( 4 0 6 7 1 4 n l cd e g r a d a t i o ne n z y m ef r o mh b 5w a sp u r i f i e d a f t e ra m m o n i u m s u l f a t ep r e c i p i t a t i o nw i t h3 0 7 0 s a t u r a t i o n , d i a l y s i s ，a ni o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h yw i t hd e a e - s e p h a r o s ef f , a n dg e lf i l t r a t i o nw i t hs e p h a e r y l s - 3 0 0 h 1 lap r o t e a s ew a sp u r i f i e dp a r t l y k e y w o r d s ：a t r a z i n e ；d e g r a d i n ge n z y m e ；f e r m e n t a t i o n ；1 6 s r d n a p u r i f i c a t i o n i i 山东农业大学硕士学位论文 英文缩略表 c vc o e 茄c i e n to f v a r i a t i o n f i d f l a m ei o n i z a t i o nd e t e c t o r e p ae n v i r o n m e n tp r o t e c t i o na g e n c y g cg a sc h r o m a t o g r a p h y h a h d r o x y a t r a z i n e d e a d e s e t h y l a t r a z i n e d i a d e i s o p r o p y l a t r a z i n e d e i d e s e t h y l - d e i s o p r o p y l a t r a z i n e 瓶a t r a z i n e ss t a n d a r dd e v i a t i o n n c b i 激盎勰。n 删。 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n b l a s t 酬b a s i c 恻a l i 删s 黜h t a q 酶t a q d n a p o l y m e r a s e t et r i s e d l = a b u f f e r s a ss t a t i s t i c a la n a l y s i ss y s t e r m t a et r i sa a e e t i ca c i de d t a c i p p 勰溉二& 譬疵 i e xi o ne x c h a n g e 眦躲拳硫删 g f g e lf i l t r a t i o n i x 变异系数 氢焰离子化检测器 美国国家环保局 气相色谱仪 羟基莠去津 2 氯- 4 胺基- 6 异丙胺基 - 1 ，3 ，5 一三嗪 2 一氯4 胺基6 乙基胺基 - l ，3 ，5 一三嗪 2 - 氯4 胺基6 胺基一1 ，3 ，5 三嗪 莠去津 标准偏差 美国国家生物技术信息中 心 聚合酶链式反应 局部对比检索工具 t a q d n a 聚合酶 t r i s e d t a 缓冲液 统计分析系统 t r i s 醋酸e d t a 缓冲液 捕获、中问纯化和精纯 离子交换 疏水层析 凝胶过滤 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期：2 型研 塑塑 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 莠去津的结构和理化性质 莠去津( a t r a z i n e ) ，又名阿特拉津或氯乙异丙嗪，化学学名2 一氯一4 一乙基胺一6 一异丙基胺一1 ，3 ，5 一均三氮苯，属于三嗪类除草剂，分子 式为c s h l 4 c i n s ，分子量2 1 5 7 ，结构式为： 似鹃毽 、c 冬辱e 哆 莠去津纯品为无味白色晶体或粉末，分子量2 1 5 6 9 ，相对密度( 2 2 ) 1 2 3 9 c m a ，熔点1 7 3 - 1 7 5 ，蒸气压( 2 2 ) 4 0 x 1 0 4 p a 。2 5 时，在水 中的溶解度3 3n a g u 1 ，在有机溶剂中溶解度与溶剂极性有关，正戊烷中 为3 6 0 m g l 一，二乙醚中为2 0 0 0n a g l - 1 ，醋酸乙酯中为2 8 0 0 0r a g u 1 ，甲 醇中为1 8 0 0 0 n a g u 1 ，氯仿中为5 2 0 0 0 m g l 1 。p k a 值为1 6 8 ，吸附系数 l o g k o c = 1 9 6 - 0 3 3 8 ，正辛醇水分配系数l o g k o w = 2 6 0 - - 2 7 1 。在水中的半 衰期为4 2 d ，在自然环境中1 8 0 d 才能部分分解。在微酸及微碱介质中较 稳定，但在高温下，碱和无机盐可将其水解为无除草活性的羟基衍生物。 一般得到的原粉为白色粉末，纯度在9 2 以上( 王险峰，2 0 0 0 ) 。大白鼠 急性经口毒性l d s 0 为3 0 8 0 m g - k g 1 ，小白鼠急性经口毒性l d s 0 为 1 7 5 0 m g k g ，属于低毒农药。 1 2 莠去津的除草机理及应用概况 莠去津是典型的光合作用抑制剂，它能通过植物根系和叶片进入植物 体内，并沿木质部和韧皮部在植物体内移动，它抑制光合作用的希尔反应， 其作用部位是光合系统i i 第二个受体的电子传递，作用于q b 蛋白，结果 抑制电子从q b 蛋白向q a 蛋白传递，导致植物失绿，最后干枯死亡( 代 先祝，2 0 0 5 ) 。莠去津属选择性内吸传导型芽前、苗后除草剂，适用于玉 米、高粱、甘蔗、茶园、果园和林地及铁路等防除一年生禾本科杂草和阔 叶杂草，对多年生杂草也有一定的抑制作用( 中国化工产品大全，1 9 9 4 ) 。 莠去津降解细麓f i b - 5 的鉴定，发酵及其降解酶初步纯化的研究 莠去津易被雨水淋溶至土壤较深层，对某些深根草亦有效，持效期也较长， 低浓度的莠去津对某些作物有促进生长的作用，可刺激幼芽和根的生长。 现在生产上常用的多为莠去津与酰胺类除草剂乙草胺、丁草胺、异丙甲草 胺的混配制剂。 该除草剂自1 9 5 9 年投入商业生产以来，在世界各国得到了大面积的 推广和使用。在美国，莠去津被列为最广泛使用的除草剂之一，每年喷洒 3 5 x 1 0 4 t ，占其除草剂使用量的6 0 ( a g e n c yf o rt o x i cs u b s t a n c e sa n d d i s e a s er e g i s t r y ，2 0 0 3 ) 。在日本，莠去津予1 9 6 5 年作为农药登记，现在 全日本每年的生产量为1 7 5 0 t ，产值达3 0 亿日元。我国从2 0 世纪8 0 年代 初开始生产使用莠去津，近年来使用面积不断扩大，1 9 9 6 年莠去滓全年 的使用量为1 8 0 0 t ，1 9 9 8 年为2 1 3 0 t ，1 9 9 9 年为2 2 0 5 t ，2 0 0 0 年为2 8 3 5 2 t ( 束放，2 0 0 0 ) ，每年用量平均以2 0 的速度递增。 i 3 莠去津在生物体内和环境中的代谢 1 3 i 动植物体内的代谢 许多研究已证明莠去津在植物体中的基本反应是和谷光甘肽生成可溶 于水的结合体。已确定玉米、高梁、甘蔗、宿根高粱等作物中含有一种酶， 这种酶叫傲谷胱甘肽s 转移酶。莠去津能对还原的谷光甘肽和有机卤化 物生成结合体起催化作用，能使莠去津迅速失活。这种酶的活性是莠去津 在高等植物体内解毒和选择性作用的主要因素。像含有烷胺取代基的其他 化合物一样，莠去津在代谢过程中发生脱烷基化作用，这种作用不仅发生 在对莠去律稳定的植物体中，而且也不同程度地发生在所有高等植物体 内。和水解不同的是，脱烷基化反应不能保证除草剂的完全失活，因为脱 烷基的中问产物对植物仍具有中等毒性。 和在植物体内一样，莠去津在动物体内的代谢也是和谷光甘肽生成结 合体，不同的是其分解的最终产物为巯基尿酸。在动物体内，除了发生 n 脱烷基化反应外，在较小程度上还发生n 烷基侧链的氧化反应。但在 植物和微生物体内都没有发现这一反应的产物n - ( 2 一氯4 氨基一6 - 均三氮 苯基) 甘氨酸和n ( 2 氯4 氨基6 均三氮苯基) 丙氨酸。在动物体内， 莠去津的水解进行得比较困难，莠去津的三氮苯环在哺乳动物体内不会断 山东农业大学硕士学位论文 裂。莠去津在动植物体内的代谢如图1 - 1 所示。 去乙基舞告樟 告鼻丙基芳击艟 1 与谷胜甘雎盼结台豆虚；2 羟薹化丘虚；3 盥娩基丘应p 图1 - 1 莠去津代谢产物的结构和路径 f i g 1 - it h es h u 咖a n da p p r o a c ho f a u a z i n e sm e t a b o l i t e 1 3 2 水环境、土壤中的降解代谢 莠去津在土壤和水体中降解包括化学和生物降解过程，其中化学降解 包括光解和水解。当波长小于3 0 0 r i m 的紫外线照射时，水中的莠去津发 生光解，且在波长为2 6 0 r i m 时转化的速度最快。在水中莠去津的化学水 解较生物降解强烈，可通过2 位碳的水解、4 位碳的n 一脱烷基化和开环 而发生，p h 对莠去津的水解过程有强烈的影响。在土壤中，土壤腐殖质、 黏土矿物可催化莠去津的化学水解。 莠去津在碱性土壤中的降解主要是生物降解，其降解途径如图1 2 所示，主要包括脱烷基、水解、开环3 个过程。参与莠去津的降解过程的 微生物主要包括细菌、真菌、藻类等。假单孢菌属( p s e u d o m o n a s ) 和红 球菌属( r h o d o c d c u s ) 是降解莠去津的主要细菌。近年来，研究发现藻类 衣绿藻属也能有效地降解莠去津，纤维藻和月芽藻能使莠去滓脱羟基。另 外，在生物降解莠去律的研究中发现，由于微生物的共降解或相互间的协 同作用，通过两种或多种微生物的共降解过程及降解反应，莠去津也是可 以完全降解的。 莠去津降解细菌h b - 5 的鉴定、发酵及其降解酶初步纯化的研究 a 。 非弗w 一腻j l h 山c ! 一但1 5 ”一嘲 弭，毕c 一删 露己基蓐告墟 1 1 1 , i 再墓葬蕾啦 羟葺矗犀西基并去距羟基矗乙基芳击健 伽 上 h l i f 卑峨上上叭叫1 0 h l i f 弋声峨上上篝氲愧h 1 0 髓靛蓄并去建 a m m e l n e 1 _ 嘣湛i2 水；3 侧i 电惨怖；4 开l p 图l - 2 莠去津在土壤中的降解途径 f i g 1 - 2 1 1 e d e g , 划a t i o ar o u t # i ns o i l o f a i r a z i n e 1 4 莠去津的污染状况及生态毒理学效应 1 4 1 莠去津的污染状况 莠去津虽然是一种低毒除草剂，但化学性质稳定，在环境中降解缓慢， 其半衰期长达4 5 7 个周。由于该除草剂在世界范围内广泛使用已经达5 0 多年，所以该化合物及其降解产物对土壤地下水( b e l t u c k d a e t a l ， 1 9 9 1 ) 、地表水( r j c h a r d s r p e t a l ，1 9 9 3 ；t h u r m a n e me t a l ，1 9 9 2 ) 、 雨水( n a t i o n se t a l ，1 9 9 2 ) 和大气( b e s t e r e t a l ，1 9 9 5 ) 造成了严重的污染， 甚至可在雨水、大气中检测出该化合物及其降解产物，而且其浓度远远超 过美国环保局规定的安全浓度3 “g l 1 。 很多水样中不但检测到了莠去津，还检测出了其代谢产物，如脱烷基 代谢产物d e a ( d e s e t l l y l a t r a z m e ) ，d i a ( d e i s o p r o p y l a t r a z i n e ) 、d e i ( d e s e t h y l d e i s o p r o p y l ) ( p u c a r e v i ce t a l ，2 0 0 2 ) 和羟基水解产物h a ( h d r o x y a t r a z i n e ) 水样中这些代谢产物的浓度己超出母体的浓度，有时 甚至可超出莠去津母体浓度的1 0 倍左右( c l a y e t a l ，2 0 0 0 ) 。1 9 9 6 年，美国 u s g s 再次对夏威夷的地下水进行调查，发现5 0 的水井样品都能检测到 除草剂莠去津和其脱乙基代谢产物d e a 。法国t i s s e a u 通过七年的研究调查 4 魁 伽参 少 叩 牵 嚣 少 汕 山东农业大学硕士学位论文 发现，巴黎地下水中d e a 的含量已超出母体莠去津( t i s s e a u e t a l ，1 9 9 8 ) 。 在我国尤其是东北地区，莠去津是使用最广泛的旱田除草剂，由于a t 的 连年施加和其难生物降解性，已经对东北地区地下水造成了大面积的面源 污染( 毛应明等，2 0 0 4 ) 。 莠去津在环境中的持留期较长。研究发现，莠去津在土壤表层中的消 解分为两个阶段：最初1 2 d 衰变一半，而后的4 7 d 衰变一半( t h o m a s 甜a ， 1 9 9 7 ) 。由于莠去滓在土壤中残留期较长，德国从1 9 9 1 年开始停止使用莠 去津，但是莠去津及其衍生物仍可检测到。在研究莠去津污染的水田时发 现，切断污染源1 年后，在农田灌溉水中仍能检测出莠去津的残留；在作 物生长期内也可以检测到作物体内的莠去津残留( 王立仁等，2 0 0 0 ) 。此外， 残留在土壤中的莠去津可以与c d 、z n 、c u 等重金属结合形成复合物，也 有一部分与土壤腐殖质相结合( m a n d e l b a u me ta 1 ，1 9 9 3 b ) 。研究表明，。 莠去津在有机质含量高的土壤中年结合残留量高达5 4 ( k h a n , 1 9 9 5 ； s i e b e r s 。1 9 9 4 ) ，且通过自然环境因素的相互作用无法去除这些结合残留 物。因而，这种结合残留对整个生态系统构成潜在的威胁。 此外，莠去律可以通过挥发和浮尘进入大气，并通过干沉降和湿沉降 返回地面。因此，它对生态环境的影响具有全球性，已引起世界各国的重 视。在德国b i g h t 地区的莠去津的年度大气沉降为2 0 g - i 一( b e s t e re t a l ， 1 9 9 5 ) 。在温暖的季节，瑞典的降雨中含有莠去津。作者认为是由于莠去 津的挥发和风蚀的作用，导致了莠去津在大气和降雨中出现，从而使高山 湖泊中也检测到了莠去津( b u s t e r , 1 9 9 0 ) 。美国衣阿华州，在4 8 月间的 降雨中也能够检测到莠去津，浓度为o 1 4 0 g l 1 。 1 4 2 莠去津污染的生态毒理学效应 莠去漳对水体中的低等动物毒害极大( p h y u e t a l ，2 0 0 5 ) 。海水中的 3 p g l 1 的a t 即可以使桡足类动物的繁殖力降低( h i l l c 印i e 甜a ，2 0 0 5 ) ，杀 死水底节肢动物( u s e p a ，2 0 0 3 ) 。长期接触莠去滓的雌雄黑鲈鱼体内的酮 丁糖和求偶激素雌二醇浓度增加，但蜻蜓和鞘翅目的幼虫数量却增加了一 倍。莠去津达到一定浓度时，可抑制弹琴蛙蝌蚪的生长发育，造成蝌蚪畸 形，并干扰机体内正常的代谢机制( 苑宇哲等，2 0 0 4 ) 。将蝌蚪放在含有不 同浓度莠去津的水中，结果发现，o 1 i n g l - l 的莠去律水溶液就能导致青蛙 莠去津降解细菌h b - 5 的鉴定、发酵及其降解酶初步纯化的研究 产生雌雄同体现象；将雄性青蛙放在浓度为2 5 h g l 1 的莠去津水中观察。 青蛙体内睾丸激素的浓度显著下降( d a l t o n , 2 0 0 2 ；h a y e se t a , 。2 0 0 2 ) 。蛙 类在含有莠去津的水体生活3 周，发现对蛙类的变态发育有害，当继续生活 到5 周时，影响蛙的形态发育( f r e e m a n e t a l ，2 0 0 4 ) ；莠去津易造成大鼠免 疫器官的损伤，使胸腺、脾脏等发生退行性病变( 栾新红，2 0 0 3 ) 。 莠去津对人体影响的数据很少。有研究报道，莠去津可能对人体具有 致癌性，长期接触莠去津会导致乳腺癌和卵巢癌的发生( s u s a n n e ，1 9 9 2 ； t h o m a s ，1 9 9 9 ) 。因此，美国e p a 把莠去津列为可能的致癌物。s a n d e r s o n 等( 2 0 0 2 ) 发现莠去津等三氮苯类除草剂能使人体内c y p l 9 酶的活性升高。 干扰人体内分泌平衡研究莠去津对培养的人体淋巴细胞的基因毒性作 用表明，莠去津具有弱细胞毒性，但不会引起染色体畸变的反应( r i b a se l r a 1 ，1 9 9 8 ) 。莠去津不仅通过食物链的传递，会对人体健康带来影响，使人 体的肝、肾、肺、心脏及血管表现出中毒症状；而且也可能造成人类心血 管系统发生问题和再生繁殖困难( s u s a n n e ，1 9 9 2 ；m u n g e re t a ，1 9 9 7 ) 低 剂量的( “g l - i - r a g l 1 ) 莠去津具有内分泌干扰作用是近期最令人担忧的 发现，莠去津已被列为环境荷尔蒙的可疑物质( c o o p e re te 1 1 ，2 0 0 0 ；l a w se t a 1 ，2 0 0 0 ) 。因此，a t 被列为环境荷尔蒙的可疑物质，受到各国政府的监控。 1 5 莠去津生物降解 。 微生物降解是莠去津在土壤中迁移转化的主要方式之一许多研究表 明，土壤微生物对莠去津的降解起主要作用( s m i t h “a ，2 0 0 5 ) ，微生物 可利用莠去津作为碳源、氮源，使莠去津发生脱烷基、脱n 烷基甚至三 氮环开裂而降解，释放出c 0 2 而发生彻底矿化降解( m a n d e l b a u me ta 1 ， 1 9 9 3 a ；m a n d e l b a u me t n l ，1 9 9 5 ；r a d o s e v i c he t a l ，1 9 9 5 ) 。 l 5 1 降解莠去津的微生物 到目前为止，分离到的降解莠去津的微生物主要包括细菌、真菌、藻 类等。细菌由于其生理生化的多种适应能力及易诱发突变菌株，在降解莠 去津的微生物中占有重要地位。降解莠去津的细菌主要有：诺卡氏菌 ( n o c a r d i a ) ( t o p pe ta 1 ，2 0 0 0 ) 、红球菌( r h o d o c o c c u s ) ( b e h k ie ta 1 ，1 9 9 3 ) 、不 动杆菌( a e i n e t o b a c t e r ) ( m i r g d me la 1 ，1 9 9 3 ) 、土壤秆菌( a g r o b a c t e r i u m ) 6 山东农业大学硕士学位论文 ( s t m t h e r se ta 1 1 9 9 8 ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) ( v a n z e k o n t c h o ua n d o s c h w i n d , 1 9 9 4 ；m a n d e l b a u me ta 1 。1 9 9 5 ) 、根瘤细菌( r h i z o b i u m ) ( b o u q u a r d e t a l ，1 9 9 7 ) 、节杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) ( 刘爱菊，2 0 0 3 ) 。其中降解莠去津的细 菌主要是红球菌属和假单胞菌属；真菌主要有：菌根真菌( d o n n e l l ye la 。 1 9 9 3 ) 、白腐真菌( m o u g i n 甜a ，1 9 9 7 ) 、链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 、绿色木霉 ( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 和曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 等( r o u f n ma n db l a k e ，1 9 7 0 ) 。 1 5 2 莠去津生物降解的影响因素 莠去津的降解代谢是细菌的种类和类型、外在碳氮源、碳氮比、p h 、 湿度等许多因素综合作用的结果( g h o s ha n d 附l i p ，2 0 0 4 ) 。莠去津降解 代谢的速度和程度受其自身的性质影响较大，主要原因是其三氮环不易受 微生物攻击而发生开环。研究表明，莠去津比氰草津和麦草畏更不易被降 解( g ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在已报道的莠去津降解微生物中，能使莠去津分子 结构中三氮环开裂的微生物仅有假单孢菌a d p ( b o u q u a r de t a l ，1 9 9 7 ) 和 农杆菌j 1 4 a ( a e l i o na n dm a t h u r , 2 0 0 1 ) 等数株细菌。 微生物对莠去津的降解，除莠去津自身性质影响外，还受环境条件如 温度、湿度、p h 等因素的影响( c r u z e ta 1 ，2 0 0 3 ；l a l o n d ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 研究证明，微生物的生长及其对莠去津的降解受环境温度和p h 的影响都 较大，并且往往培养温度和p n 条件协同影响微生物的生长及其对莠去津 的降解代谢( 刘爱菊，2 0 0 3 ) 。另有研究表明，缺氧的环境条件也能够抑制 微生物对莠去津的降解( g - u e t a ，2 0 0 3 ) 。 1 5 3 莠去津生物降解研究进展 虽然自八十年代以来从多个细菌属中分离到了降解莠去津的菌株，但 直至九十年代中期，对这一生物降解过程所涉及到的基因、酶和中间代谢 产物，仍知之甚少。1 9 9 5 年w a c k e t t 实验室从施用过莠去津的土壤中分离 到假单胞菌a d p 菌株以后，莠去津的生物降解研究获得了迅速发展( d e s o u z a m l e t a ，1 9 9 6 ) 。v a r g h a 等( 2 0 0 5 ) 从河底泥分离的d e l f t i a a c i d o v o r a n sd 2 4 可以莠去津作为唯一碳源和氮源生长，通过缩二脲途径将 莠去津完全矿化。d es o u z a w 研究表明，a d p 菌株莠去津生物降解途径的 第一个反应由莠去津氯水解酶催化，使莠去津脱氯生成无毒的羟基莠去 7 莠去津终解细菌h b 5 酌鉴定、发酵及其降解酶初步纯化鹊研究 津，编码这种酶的基因a t z a 己被克隆和测序( b o u n d y - m i l l sk le ta 1 。 1 9 9 7 ) 。此外，编码该途径的第二和第三个反应的酶的基因a t z b 和a t z c ， 也被克隆和铡序( s a d o w s k y mje t a ，1 9 9 8 ) 。一般情况下，a t z a ，a t z b ，a t z c 基因位于一个分子大小为9 7 k b 的传递性质粒上( d es o u z amle ta ， 1 9 9 8 ) 。蔡宝立等从农药厂废水中分离到了能以除草剂莠去津为唯一氮源 生长的节杆菌( a r t h r o b a c t e r ) a d l ，该菌株降解莠去津的能力大大超过假单 胞菌a d p 菌株( 蔡宝立等，2 0 0 1 ) 。韩宇宁以假单胞菌a d p 菌株的莠去津氯 水解酶基因( a t z a ) 为参考序列设计p c r 弓 物，以a d1 菌株的总d n a 为模 板，通过p c r 扩增得到a d l 菌株的a t z a 基因( 韩宇宁，2 0 0 1 ) 。蔡宝立等对 莠去津降解菌株进行分离并对莠去津氯水解酶基因进行了克隆和鉴定 ( c a ie ta ，2 0 0 3 ) 。目前，莠去津氯水解酶基因在莠去津污染土壤的生物 修复和莠去津工业废水的生物处理上展示出其良好的应用前景( 王松文等， 2 0 0 1 ) 。 一 1 6 分子生物学方法鉴定细菌现状 近l o 多年来，随着分子生物学理论和技术的迅速发展，特别是作为 生物技术里程碑的聚合酶链反应( p c r ) 技术的出现及核酸测序技术的不断 完善，产生了许多新的细菌分类方法，如：质粒图谱、限制性片段长度多 态性分析( g a oe ta 1 ，2 0 0 2 ) 、脉冲场凝胶电泳( m a oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 、p c r 指纹图、r d n a 指纹图、1 6 sr r n a 序列分析等。它们主要是对细菌染色 体进行直接的d n a 分析或对染色体外的d n a 片段进行分析，从遗传进 化的角度去认识细菌，从分子水平进行分类与鉴定，使细菌的分类越来越 科学和精确，特别是1 6 sr r n a 序列分析方法的出现，使细菌进化可以通 过试验研究来证实。这是细菌分类史上的一次革命，必将使人们对生物进 化及其与其它生物学科关系的认识更加深入( 焦振泉等，1 9 9 8 ；林万明等， 1 9 9 0 ) 。 r r n a 是目前细菌系统分类研究中最常用的分子钟，其种类少，含量 大。不同微生物r r n a 基因序列在某些位点会以不同的几率发生突变，他 们在种。属，界等水平上表现出结构与功能的高度保守性，素有“细菌化 石”之称。特别是其进化具有良好的时钟性质，可作为生物进化史的计时 器。序列的相似程度可以反应出他们的系统发育关系。r r n a 测序适用与 8 山东农业大学硕士学位论文 各种水平，尤其是远源关系的研究，它的同源性为原核生物的系统进化研 究提供了一条可行之路，在细菌分类学上取得了巨大的突破。 1 6 sr r n a 由于分子大小适中，既能体现不同菌属之间的差异，又能 利用测序技术来较容易得到其序列而得到有关系统发育关系的充足信息， 故而被细菌学家和分类学家所接受。1 6 sr r n a 的同源性分析最适用于属 及属以上的远源关系。1 9 7 7 年，w o e s e 等人测定了2 0 0 多种原核生物的 1 6 sr r n a 和真核生物1 8 sr r n a 的寡核苷酸顺序谱，经过比较研究，不 但搞清了原核生物和真核生物的许多系统进化问题，而且还以此为根据提 出了生命系统的三界学说，引起了生物学家的普遍关注，并由此引发了研 究细菌的热潮。原核生物的r r n a 分为三种，分别是5 sr r n a ，1 6 sr r n a ， 2 3 sr r n a ，其位于同一操纵子上。r r n a 基因包含若干种成分，分别是 1 6 sr d n a , 2 3 sr d n a , 5 sr d n a 区间。1 6 sr d n a 序列已经成为细菌种属 鉴定和分类的标准方法。可变序列因不同细菌而异，恒定区序列基本相同， 所以，可以利用恒定区的序列设计引物将1 6 sr r n a 基因扩增出来，利用 可变区序列的差异来对不同菌属，菌种的细菌进行分类鉴定。但较其它鉴 定方法而言，1 6 sr r n a 序列测定分析更适用确定属及属以上的分类单位 的亲缘关系。 细菌的1 6sr r n a 的可变区位点结构如下： 5 v 2v 3v 4v 51 阿姆 v 9 v 03 5 4 0 b p 町o b p1 5 4 b 可麦刚r 甜；l b k 暮；mv i f o ) v b6 1 - 1 0 6 b p v 玉1 2 1 - 2 啦审 v 生4 3 p 蛐嘶pv 4 ：5 8 1 b 酊l b v 量7 3 4 - 7 m v 6 ：$ 2 9 - $ 5 7 b v 再9 j 0 - l o 曲pv s ：1 1 l 缸i l 和虾 v g 1 2 4 0 - 1 2 9 s b r l 也1 4 1 p1 4 9 2 m 口恒宅l i i ir e k e - ) 圈i - 3 细菌的1 6sr r n a 的可变区位点结构 f i g 1 - 3t h ev a r i a b l er e g i o ns t r u f t u r co f b a c t e r i a s1 6sr r n a 1 7 莠去津降解菌的摇瓶发酵研究 微生物对莠去津降解的实质是酶促反应，微生物对莠去津的降解代谢 受到影响，实际上就是微生物体内的酶活力受到影响。因此，影响酶对农 9 莠去津降解细菌h b - 5 的鉴定，发酵及其降解酶初步纯化的研究 药降解的主要因素同微生物一样，主要受到农药本身和环境两方面的影响 ( 王聪颖等2 0 0 5 ) 。 为了提高降解酶的产量，必须对降解酶的发酵进行研究，其中最重 要的研究内容就是菌种和发酵工艺。对菌种而言主要是利用已有的菌株， 利用各种诱变剂对其进行诱变以提高它们产酶的能力。在发酵研究上， 主要是通过研究培养基的成分和配比以及发酵条件来提高其产酶能力。 发酵培养基是指由人工方法配合而成的，专供微生物培养、分离、鉴 别、研究和保存用的混合营养制品( 张致平，2 0 0 2 ) 。由于各类微生物的 代谢活动不同，因此它们需要的营养物质也有很大差别，如果培养基的成 分不适，则微生物发育不良，甚至不能生长。同时，次生代谢产物的产生 与培养基的关系也十分密切，因此微生物培养基的组成，是其培养和工业 发酵生产必须首先解决的问题。一般培养基的营养成分包括水、氮源、碳 源、无机盐类、微量元素和生长因子等。 发酵培养基的选择通常要考虑以下几个基本原则： 第一、必