（动物营养与饲料科学专业论文）鸡源乳酸杆菌的分离鉴定及保存技术研究.pdf

摘要 为了开发研制禽用微生物添加剂，本研究从北京油鸡盲肠黏膜和粪便中分离 鉴定得到5 株球菌和2 株乳酸杆菌，通过o 值和p h 值的测定，筛选出优良乳 酸杆菌，确定其最佳培养条件。并对优良乳酸杆菌进行了培养基优化、5 0 l 发酵 罐扩大培养、冷冻干燥过程，最后将冻干菌粉用于肉鸡生产中测定肉鸡盲肠黏膜 和粪便中乳酸菌与大肠杆菌的数量，结果表明： ( 1 ) 本试验从北京油鸡的盲肠黏膜和粪便中分离出了4 1 株菌种，通过对菌种 的菌落形态的观察以及染色油镜观察，共筛选出7 株进行乳酸菌属种的生理生化 鉴定，并根据进一步的糖发酵试验，确定m l 、m 2 为盲肠肠球菌，f 5 、f 8 、f l l 为粪肠球菌，m 3 为短乳杆菌，m 8 为戊糖乳杆菌。 ( 2 ) 在通气( 加棉塞震荡) 培养和密闭( 恒温静置) 培养两种培养条件下对 乳酸杆菌m 3 和m 8 生长o d 。值和p h 值进行了测定，结果显示：m 3 在通气培养条件 下菌株0 。值最高为1 1 5 4 ，p h 值从5 8 6 下降n 4 1 6 ，密闭培养条件下0 d * 一值最 高值为1 1 5 7 ，p h 值从5 8 5 下降到4 1 4 ，m 3 在两种培养条件下生长趋势相差不多； m 8 在通气培养条件下菌株0 。值为1 0 1 l ，p h 值从5 6 4 下降n 4 3 6 ，而在密闭培 养条件下0 。值可达n 2 0 8 3 ，p h 值从5 6 4 降n 3 4 2 。因此，筛选m 8 为优良乳杆 菌，最佳培养条件为密闭培养。 ( 3 ) 添加不同比例的菊粉替代部分葡萄糖，采用密闭培养条件，测定m 8 生 长0 瞻。值和p h 值，结果表明：m 8 均在2 0 h 进入稳定生长期，2 8 h 左右0 d m 一达 到最高值。其中效果最好的为3 菊粉添加量，最高0 d m “达到2 9 3 7 ，p h 从5 8 1 降到3 3 7 。 ( 4 ) 采用5 0 l 发酵罐扩大培养，在发酵到2 0 h 时，m 8 开始平稳生长，进入 稳定期，在2 3 h 时达到最高值，o d 舯。值为2 5 0 2 。在2 7 h 时，鹏生长缓慢，其 0 d 。值开始下降，确定最佳收菌期为2 0 h 。 ( 5 ) 将m 8 发酵液分别在常温和4 。c 冰箱中贮存，结果表明：m 8 发酵液在常温 保存时，从最初的1 3 7 1 0 9c f u m l 降到6 7 9 x1 0 7 c f u m l ，差异极显著( p 0 0 1 ) ； 鹏发酵菌液在4 c 冰箱贮存时，最初为1 1x1 0 9 c f u 1 l ，贮存1 2 天时活菌数降为 5 1 1x1 0 8 c f u m l ，差异极显著( p o 0 1 ) ，因此，乳酸杆菌m 8 不适合以发酵液体 的形式保存。 ( 6 ) 本试验测定了1 5 种不同保护剂组合对m 8 在冷冻干燥中的存活率的影 响。结果表明：保护剂对提高冻干过程中m 8 的存活率具有明显效果，并且不同 保护剂协同累加效果不同，其中1 8 脱脂奶粉+ 1 蔗糖+ 1 甘油+ 2 淀粉的活 菌存活率为9 6 6 4 。 ( 7 ) i i i 组( 添加m 8 冻干菌粉) 与i i 组( 抗生素组) 相比能使盲肠黏膜上乳 酸菌数量显著增加( p 0 0 5 ) 。 关键词：乳酸杆菌；分离鉴定；菊粉；冷冻干燥；保存；肠道菌群 s t u d yo ni s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n dc o n s e r v a t i o no f l a c t o b a c i l l if r o mp o u l t r y a u & o r z h a n gd o n g y a n a d v i s e n ：z h a og u o x i a n ( p r o f e s s o r ) j ih a i f e n g ( r r c h e f ) m a j o r a n i m a ln u t r i t i o na n df e e ds c i e n c e a b s t r a c t i no r d e rt op r e p a r et h eb e s tp r o b i o t i co fp o u l t r y , t h ee x p e r i m e n ti s o l a t e df i v e e n t e r o c o c c u aa n dt w ol a c t o b a c i l f if r o mt h eb l i n di n t e s t i n a lm o c o u sa n df e c e so f h e a l t h yb e i j i n gy o uf o w l a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t so fo d 6 0 0 咖a n dp h ，w e s e l e c t e d1s 仃a i na st h eb e t t e rl a c t o b a c i l l i a n dc o n f i r mt h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o n t h e n ， t h ee x p e r i m e n tc a r r i e do u ts o m ee x p e r i m e n t si n c l u d i n go p t i m i z i n gc u l t u r em e d i u m ， c u l t i v a t i n gi n5 0l i t r ef e r m e n t e r , f r e e z e - d y r i n gw i t hd i f f e r e n tc r y - p r o t e c t i v ea g e n t ，a n d s oo n a tl a s t , w em a d et h ep r o d u c t i o no ft h ef r e e z e - d r yp o w d e ro fm 8i n b r o i l e r s f e e di no r d e rt oi n v e s t i g a t ei t se f f e c to nt h em i c r o f l o r ao f b r o i l e r s t h er e s u l t s s h o w e d ： ( 1 ) 4 ls t r a i n sb a c t e r i a ss p e c i e sf r o mt h eb l i n di n t e s t i n a lm o c o l l ja n df e c e so f h e m t h yb e i j i i n gy o uf o w l t 1 1 0 u g ht h eo b s e r v a t i o no fc o l o n i a lm o r p h o l o g ya n dg r a m s t a i n i n g , 7s t r a i n sw e r ei d e n t i f i e dp h y s i o l o g i c a l l ya n db i o c h e m i s t r i c a l l ya c c o r d i n gt o t h ed i a g n o s t i cc h a r a c t e r i s t i c so f b a c t e r i aa n dw e r ep r e l i m i n a r i l yd e f i n e da sl a c t i ca c i d b a c t e r i 扎t h er e s u l ts h o w e d ：m 1 、m 2w e r ed e f i n e da se s c e c o r u m ；f 5 、f 8 、f ilw e r e d e f i n 。da se f a e c a l i s ；m 3w a sd e f i n e da slb r e v i sa n dm 8w a sd e f i n e da sl p e n t o s u s ( 2 ) t h ee x p e r i m e n tg o tt h eg r o w t hc o i v e sa n dp ho fl a c t o b a c i l l im 3a n dm 8i n b r e e z ya n ds e a l e db o t t l e s o d 甜o mo fm 3r e a c h e dt o1 1 5 4a n dp hr e a c h e dt o4 1 6 f r o m5 8 6i nb r e e z yb o t t l e s ，a n di nt h es e a l e db o t t l e s ，o d 鲫姗r e a c h c dt o1 1 5 7a n d p hr e a c h e dt o4 1 4f r o m5 8 5 o nt h eo t h e rh a n d s o d 6 0 0 o fm 8r e a c h e dt o1 o ll a n dp hr e a c h e dt o4 3 6f r o m5 6 4i nb r e e z yb o a l e s ，a n di nt h es e a l e db o t t l e s ，o d e o m r e a c h e dt o2 0 8 3a n dp hr e a c h e dt o3 4 2f r o m5 6 4 t h e r e f o r e , m 8w a st h eb e t t e r l a c t o b a c i l l ia n di t so p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o nw a si ns e a l e db o t t l e s ( 3 ) w ea l s og o tt h eg r o w t ho d 6 a n dp ho fm 8i ns e a l e db o t t l e sw i t hd i f f e r e n t l e v e l so fi n u l i n 、i l l lt h ef o u rl e v e l so fi n u l i n m 8t u r n e di n t ot h es t a t i o n a r yp h a s e u n d e r2 0 h 。a n dr e a c h e dt oh i g h e s tv a l u ea b o u t2 8 h1 n l eb e s tp e r c e n to fi n u l i nw a s 3 ，a n dt h e0 d 6 0 0 l ir e a c h e dt o2 9 3 7a n dp hr e a c h e dt o3 4 0f r o m5 8 1 ( 4 ) i n5 0l i t r ef e r m e n t e r , m 8t u r n e di n t ot h es t a t i o n a r yp h a s ea b o u t2 0 h , a n d r e a c h e dt ot h eh i g h e s tv a l u ew i t h2 3 h ，w h i c ht h eo d 6 mr e a c h e dt o2 5 0 2 t h e n ，m 8 g r e ws l o w l yu n d e r2 7 ha n di t so d 6 m b e c 锄em o r el o w e r , t h e r e f o r et h eb e s tt i m eo f h a r v e s tw a s2 0 h o ) w h e nt h ec u l t u r eo fm 8s t o r e da sl i q u i da tr o o mt e m p e r a t u r eo r4 c ，t h e 、，i a b l ec d ln u m b e rr e a c h e dt o5 1 l x l o o c f u m lf r o m1 1 1 0 9 c f u m lw h e ni tw a ss t o r e d a tr o o n lt e m p e r a t u r e ( p o 0 1 ) o nt h eo t h e rh a n d s ，t h ev i a b l ec e l ln u m b e rr e a c h e dt o 6 7 9 x 1 07 c f u m lf r o m1 3 7 x 1 0 9 c f u m l ( p o 0 1 ) a t4 c ，t h e r e f o r e ，t h ec u l t u r eo fm 8 s t o r e da sl i q u i dw e r en o tt h eb e s tm e t h o do f c o n s e r v a t i o n ( 6 ) t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ec r y - p r o t e c t i v ea g e n th a do b v i o u se f f e c t o n i n c r e a s i n gt h es u r v i v a lr a t eo fm 8 i nt h ee x p e r i m e n t s w eh a v eu s e dl5k i n 出o f d i f f e r e n t c r y - p r o t e c t i v ea g e n t t h ed i f f e r e n tc r y - p r o t e c t i v ea g e n th a dd i f f e r e n t s y n e r g i s t i ca c c u m u l a t i o n , a n dt h es u r v i v a l r a t eo fm 8w e r o9 6 6 4 u s i n gt h e c o m p o n e n t so f1 8 s k i mm i l k + 1 s a c c h a r o s e + 1 g l y c e r i n + 2 a m y l u m ( 7 ) c o m p a r e dw i t ht h eg r o u pi ( c o n t r o lg r o u p ) ( 网0 1 ) a n dt h eg r o u p i i ( a n t i b i o t i cg r o u p ) ( p o 0 5 ) ，t h eg r o u p i i i ( f i e e z e - d r yp o w d e ro f m 8 ) a d d i n gi n t o b a s a ld i e t sc o u l di n c r e a s et h en u m b e ro ft h el a c t i ca c i db a c t e r i ao fb l i n di n t e s t i n a l m u c o u s ；t h ee c o i lo f b l i n di n t e s t i n a lm o c o u s ( 矿田0 5 ) 、t h el a c t i ca c i db a c t e r i aa n d t h e e c o i l o f f e c e s h a d n od i f f e r e n t f r o m t h e g r o u p o f f r e e z e - d r y p o w d e r k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l l i ；i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n ；i n u l i n ；f r e e z e - d r y i n g ； c o n s e r v a t i o n ；i n t e s t i n a lm i c r o f l a 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i 垦垒些盘堂或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：掺耋j b 签字日期： 知唧年f 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解泣i 垦盘些盘茔有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权塑i 垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：器戡 导师签名： 毙c 冯杉 签字日期：拜年6 月6 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 签字日期：啪年6 月日 电话 邮编 鸡源乳酸杆菌的分离鉴定及保存技术研究 1 引言 1 9 3 5 年d o m a g k 发明磺胺类药物、1 9 4 0 年c l i a i n 等证实了青霉素可以作为有效的化学治疗 剂，从此抗菌药物的研究、筛选、合成及应用发展迅速1 9 5 0 年，美国食品与药品管理局( f g a ) 首次批准抗生素用作饲料添加剂后，世界各国相继进行抗生素的饲喂试验并用于生产。人们发 现四环素对畜禽具有促进生长、预防疾病之功效，因此也就开始了化学抗生素作饲料添加剂的时 代。但随着科学研究的深入和人们环保意识的觉醒，抗生素的大量使用给养殖业带来的严重问题 已受到越来越多的关注。第一，动物饲用化学药物后引起耐药菌株扩散给动物氏期使用或过 量使用抗生索等化学物质，还可通过肉、奶等动物产品传递给人类，导致人体产生大量耐药菌株t 对人类的身体健康造成危害；第二，引起动物体内菌群失调，导致动物发病或死亡。抗生素虽有 其抗菌谱，但它作用于病原菌的同时也会影响体内有益菌群生k 。特别是长期大量使用抗生素， 可使动物体内菌群失调，微生态平衡遭破坏，使潜伏在体内的有害菌趁机大量繁殖，从而引起 内源感染；第三，会造成畜禽产品中的药物残留问题，一些性质稳定的抗生素类化学物质发挥作 _ i j i 后其毒性仍然存在，即使捧泄到土壤中，也不易转化药物残留被称为。隐性杀手”，有致 癌、致畸、致突变的作用”1 如果人类食用了残留抗生素的动物产品，将会引起中毒或免疫能力 降低，受害的还是人类自己。 正因为如此，抗生素的这些问题已经危及到人类的安全、食物的安全和农牧业的发展。饲料 安全即食品安全的概念在世界范围内已成为共识，消费者们对食品的安全，卫生等问题也越来越 严格。因此加速开发、推广和应用新型安全高效的饲料添加剂，提高饲料和食品的安全和质量已 迫在眉睫。微生物添加剂( 又称益生素、益生菌、活菌制剂) 作为一种新型的绿色饲料添加剂正 在越来越多地受到人们的重视。 1 1 微生物添加剂概念的发展历史 1 9 6 5 年l i l l y 和s t i l l w e l l 首先使用了益生素( p r o b i o t i c s ) 这个词，他们把益生素描述为 一种与抗生素相反的物质，是指微生物产生的可以刺激其它微生物生长的物质”1 。1 9 7 4 年，p a r k e r 认为。益生素”是能够影响肠道微生物并且对动物产生有益作用的微生物到1 9 8 9 年，p u l l e r 将益生素定义为“一种活的、能够有效促进机体调节肠道内微生态平衡的微生物添加剂“1 9 9 1 年我国学者将其定义为“在动物微生态理论指导下，用正常微生物群成员，通过鉴定、培养、干 燥等一系列特殊工艺制成的活菌制剂( 包括代谢产物) ，它可以直接饲喂动物，以促进动物生产 性能为目的的活菌制荆”2 0 0 0 年t a n n o c k 等将其定义为“能够通过胃肠道，从而对人和动物健 康有益的活的微生物”，这更加强调微生物在胃肠道中的存活能力。 1 2 微生物添加剂使用的菌种 菌种的好坏直接关系到微生物添加剂的应用效果及产品质量，一般认为，优良菌种需具备以 下4 个条件：对动物和人体无毒、无害、安全和无副作用；具有存活能力并能进行工业化规 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 模生产；经加工后活菌存活率高、稳定性好；有利于促进宿主的生长发育及提高抗病能力 1 9 9 8 年美国食品与药品管理局( f d a ) 和饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂、安全的微生物菌 种有4 5 种，我国农业部2 0 0 6 年公布了允许使用的饲料级微生物菌种为1 6 种，包括地衣芽孢杆 菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) ，两歧双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m b i f i d u m ) 、干酪乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sc a s e d 、屎链球菌( e n t e f o c o c c u mf a e c i u m ) 、乳酸片球菌( p e d i o c o c c u s a c i d i l a c t i c i i ) 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l u s a c i d o p h i l u s ) 、乳链球菌( s t r e p t o c o c c u sl a c t i s ) 、酿酒酵母( s a c h a r o m y e sc e r e v i s i a e ) 、 产朊假丝酵母( c a n d i d au t i l i s ) 、沼泽红假单胞菌( r h o d o p s e u d o mo f l a $ p a u s t r i s ) 、植物 乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a z m ) ，粪链球菌( e n t e f o c o c c u sf a e c a l i s ) 、戊糖片球菌 ( p e d i c o c c u sp e n t o s a c e u $ ) 、乳酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sl a c t i s ) 、保加利亚乳杆菌 ( l a c t o b a c i l u sb u l g a r i c u s ) 1 3 乳酸菌类微生物添加剂的生物学功能 乳酸菌类微生物添加剂是应用最为广泛，效果较好的一类。它是多种动物消化道主要的共生 菌，能形成正常菌群，也是我国最早公布的2 种可直接使用的饲料级微生物添加剂菌种之一( 李 树鹏等，2 0 0 5 ) 1 7 j 这一类群能使可发酵碳水化物( 主要指葡萄糖) 产生大量乳酸( 黄庆生等，2 0 0 2 ) 9 】， 属无芽孢革兰氏阳性菌，厌氧或兼性厌氧生长，有较强的耐酸性，在p h 3 ，o 4 5 酸性条件下仍能 够生存，不耐热，6 5 7 5 下死亡其中以乳杆菌属、双歧杆菌属为代表，并已被证实在临床 上能够治疗和预防人和动物的某些肠道疾病或者起保健作用口l 。能够应用于微生物添加剂的乳酸 菌主要有乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、片球菌属，目前主要应用的有嗜酸乳杆菌、双歧乳 杆菌和粪链球菌，有大量研究报道这类微生物添加剂具有良好的生物学功能，并已在饲料业中广 泛应用 1 3 1 对动物具有营养作用，能够促进动物生长 乳酸菌能把结构复杂、分子量较大的蛋白质部分降解为小分子肽和游离氨基酸，利于胃肠消 化吸收。它还能合成动物所需要的多种维生素( 如b i 、b 2 、b 6 、b n 、烟酸、泛酸、叶酸等) 和有 机酸，有机酸能加强肠的蠕动，促进常量及微量元素如钙、铁、锌等的吸收，近而达到为宿主提 供必需营养物质，增强动物的营养代谢，直接促其生长的作用。乳酸菌还可以分解食物中的蛋白 质、糖类，使部分脂肪少量降解增加乳中游离脂肪酸和挥发性脂肪酸含量。另外，它还可利用 本身所特有的某些酶类补充宿主在消化酶上的不足，帮助分解上消化道未被充分水解吸收的营养 物质，有利于宿主进一步吸收利用，如双歧杆菌可以产生糖苷酶可以消化碳水化合物，对黏蛋白、 非淀粉多糖和抗性淀粉进行降解使其利用；保加利亚乳杆菌还可以增强8 半乳糖苷酶的活性。乳 酸菌还能够激活胃蛋白酶，促进胃肠蠕动 2 鸡源乳酸杆菌的分离鉴定及保存技术研究 1 3 2 抑制病原菌的生长，维持肠道菌群平衡 黏附能力通常被认为是病原苗的一种重要的毒性因子( f i r d a y 等。1 9 9 7 ) ”1 ，致病菌与肠道黏 膜表面受体结合粘附于肠道黏膜，是其定植并产生临床症状的前提条件。因此，许多微生物添加 剂可以通过与致病菌竞争肠上皮微绒毛上的脂质和蛋白质上的相同复合糖( g l y c o c o n j u g a t e ) 受 体来达到阻止致病菌的定植( 李树鹏等，2 0 0 4 ) “。乳酸菌是定居在肠道中的有益菌群，对肠道黏 膜具有较强的黏附能力，如嗜酸性乳杆菌依靠糖类、二价钙离子来黏附；鸡乳杆菌通过糖类和糖 蛋白来黏附，而且其黏附力最强( f e r n a n d e z 等2 0 0 3 ) 1 。 另外，乳酸菌还能够产生抑制病原菌的代谢产物，如：酸性物质：肠道内双歧杆菌、乳酸 杆菌等有益菌可产生一些酸性代谢产物( 如乙酸、乳酸、短链脂肪酸) 能够降低局部p h 值，可 抑制大肠杆菌及梭菌类的生长，抑苗率高达8 0 以上；细菌素( b a c t e r i c i n ) ：细菌素是一 类选择性作用于细菌靶细胞的抗菌物质，它们大多属多肽类且具水溶性。如乳酸乳球菌产生的 n i s i n 细菌素、嗜酸乳杆菌产生的细菌素、双歧杆菌还产生b i f i d i n 菌素以及从枯草芽孢杆菌中 提取的枯草菌素( s u b t i c i n ) ，都能够起到抑菌或杀菌作用；产生过氧化氢( h 籼) ：嗜酸乳杆菌、 乳酸乳杆菌等在动物体内可产生过氧化氢，激活动物大肠内的过氧化物酶一硫氰酸盐反应系统， 在此系统中，乳过氧化物酶与过氧化氢结合，然后将硫氰酸盐氧化成氧化性中间产物，抑制葡萄 球菌等致病菌的生长繁殖( 马现永等2 0 0 2 ) “”；产生诱导酶：某些乳杆菌和双歧杆菌产生胞外 糖苷酶，可降解肠枯膜上皮细胞的复杂多糖，由于这些糖是致病菌和细菌毒素的潜在受体，通过 酶的作用，可以阻止毒素对上皮细胞的枯附和侵入；产生双乙酰( 丁二酮) ：乳酸菌的各个属在 塘代谢时都可产生双乙酰，这种化合物对许多病原菌有抑制作用( 楚渠等，2 0 0 4 ) l i 3 j e 1 3 3 提高动物免疫力 1 3 3 1 微生物添加剂中具有免疫调节作用的活性成分 革兰氏阳性菌含有脂磷壁酸( l t a ) ，阴性菌细胞壁含有细菌肽聚糖( p g ) ，细菌脂多糖( l p s ) 和 多糖( p s ) ，这些大分子成分是细菌对宿主发挥生理功能的主要物质基础。k o p p 等( 1 9 9 9 ) 1 认为 细菌脂多糖( l p s ) 和细菌肽聚糖( p g ) 可通过信号传导通路刺激巨噬细胞、内皮细胞、嗜中性粒细 胞产生介质，如肿瘤坏死因子、i l 一1 、i l - 6 、i l - 8 、i l - 1 2 等，对介导非特异性免疫起重要作用。 另外，r o w l a n d ( 1 9 7 5 ) “”发现双歧杆菌分泌一种降解n 一亚硝胺的酶，使亚硝胺分解，预防其引 起的肿瘤产生。 i 3 3 2 体液免疫 乳酸杆菌和双歧杆菌的代谢物和整个细胞等抗原物质能通过m 细胞进入回肠派伊尔结 ( p a y e r sp a t c h ) ，激活t h 2 细胞，产生大量的i l 一5 ，而i l 一5 是有效的i g a 产生因子，能激活p p 生发中心的b 细胞。使其转化为浆细胞，在生产i g 的过程中向i g a 转化，从而使得s i g a 水平上 升。s i g a 是黏膜体液免疫的主要效应因子，它能预防肠道蛋白酶的分解，形成黏膜上的抗体。它 经肠黏膜上皮细胞释放到肠腔内与肠黏膜表面的正常菌群混合存在，其在外分泌液中以双链和四 链的形式存在，具有多链性、粘膜亲和性与抵抗蛋白酶作用的特性，比单链i g a 更有抗原结合力t 与i g a 和i g g 相比，s i g 可以从空间构象上阻止病毒的附着，从而中和细菌毒素，限制细菌的繁 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 殖，维持肠道内的正常菌群平衡，在局部抗感染过程中起关键作用( 李树鹏等，2 0 0 4 ) “当s i g 抗体分泌增强时，提高免疫识别力，并诱导t 、b 淋巴细胞和巨噬细胞等产生细胞因子，通过淋 巴细胞再循环而活化全身免疫系统，从而增强机体的免疫功能。 乳酸双歧杆菌能增强小鼠对鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌0 1 5 7 h 7 感染的抵抗力，特异性i g 抗体升高( 蓝景刚等，2 0 0 幻“”马雪云( 2 0 0 6 ) “1 通过体外培养和动物饲养试验，证明了乳酸 杆菌对鸡肠道上皮细胞具有较强的粘附作用，能够提高鸡肠道黏膜s i g 的滴度，增强鸡的抗病能 力 1 3 3 3 细胞免疫 研究表明乳酸菌能够激活巨噬细胞、b 淋巴细胞和n i ( 细胞，增自0 1 l - i 、i 卜2 、i l - 6 、i l - 5 t n f a 等细胞因子的产生量，其中i l 一6 和t n f a 是被激活的巨噬细胞分泌的两种重要的细胞因子， i l - 6 可以促进淋巴细胞的增殖并参与t 淋巴细胞、c t l 、n k 细胞和l a k 细胞的活化。k a t o ( 1 9 8 4 ) “” 报导在小鼠腹腔内注射乳酸杆菌可以增加噬菌体的活性及n k 细胞的活性。s e h i f f r i n 等( 1 9 9 5 ) “” 发现约氏乳杆菌和乳酸双歧杆菌b 1 2 能在体外增强吞噬细胞对大肠杆菌的吞噬作用 i 4 乳酸菌类微生物添加剂在畜牧业中的应用 1 4 1 在猪生产中的应用 张常明( 2 0 0 6 ) 等报道在断奶仔猪日粮中分别添加金霉素3 0 0 m g k g 、乳酸菌l o m l 头d 、 乳酸菌3 0 r a l 头d 、乳酸菌6 0 m l 头d 结果得出乳酸菌的晟佳添加量为3 0 m i 头d ，与对照组相 比，该组能够提高血清t 4 和i g f - i 的水平，并且在1 4 d 时淋巴细胞转化率显著提高( p 0 0 5 ) ，2 8 d 时i g g 显著提高( d 0 0 5 ) 目前大多数猪场主要采用抗生素治疗仔猪腹泻，而抗生素的结果往往会 造成动物肠道内菌群的失调，而微生物添加剂却与抗生素恰恰相反它和猪只肠道菌群本身具有 较强的抗感染作用，能抑制肠道病原菌的繁殖并使其逐渐减少，使有益微生物在竞争中占优势， 从而防止仔猪腹泻，进而提高其生产性能。v a s s a l o 等( 1 9 9 7 ) “”报道乳酸菌制剂可以提高仔猪 对干物质和能量利用率，降低腹泻率的发生。s i u t a ( 2 0 0 0 ) ”报道，双歧杆菌、乳酸菌、链球 菌和酵母菌可极显著提高仔猪增重，降低死亡率。王平等( 2 0 0 0 ) 以初生仔猪作为试验动物， 试验组每头仔猪口服i m l 试药，对照组不投喂试药，在第5 及第7 日龄时，试验组的大肠杆菌数明显 低于对照组( p o 0 5 ) 而在改善肠道菌群结构和提高血清球蛋白方面效果显著( p 0 0 5 ) 1 4 3 在反刍动物生产中的应用 微生物添加剂在牛瘤胃中对微生物调控，强化瘤胃环境，提高了反刍动物的生产性能( 张景 玉，2 0 0 1 ) 2 ”乳酸苗类微生物添加剂应用于新生反刍动物的较多，也主要在增重、降低腹泻等 方面具有明显作用。w a l l a g e ( 1 9 9 8 ) 对l 5 日龄犊牛使用嗜酸性乳酸杆菌和粪链球菌混合物 犊牛下痢发病率减少7 0 死亡率降j l 9 0 。r a t a a n ( 1 9 9 8 ) ”1 等用乳酸菌、酵母菌等比例混合 添加在饲料中，饲喂犊牛1 4 周，可以显著( p 0 0 5 ) 提高犊牛增重和总干物质进食量，腹泻发生 率比对照组低3 5 肼c e r n a ( 1 9 9 1 ) 也报道乳酸菌类微生物添加剂可显著提高犊牛增重，粪p h 值比对照组低，但差异不显著。b o m b a ( 1 9 9 7 ) ”用干酪乳杆菌可以降低牛血浆脂蛋白的水平， 显著( p o 0 5 ) 提高干酪乳杆菌的含量 1 5 乳酸菌类微生物添加剂应用效果的影响因素 乳酸菌是人和动物肠道的常见菌群之一，从口腔、胃、小肠以及阴道中都能分离得到 ( h a r t e m i n k 等，1 9 9 7 ) ”1 。它对人畜具有优良的生物学功能，近年来关于这方面的研究越来越 多，现已成为微生物添加剂的研究热点。然而，乳酸菌类微生物添加剂作为一种有活性的饲料添 加剂，其质量及使用效果必然受到多种因素的影响，主要包括以下几个方面： ( 1 ) 菌种：生产 菌种是微生物添加剂应用效果及产品质量的关键。它要求具有生长快、定植力强，对畜禽胃肠道 能起到维持菌群平衡的特征：( 2 ) 活菌含量：研究认为在使用过程中一般要求预防剂量最低为 l o f u m l ，治疗剂量不低于1 0 8 c f u m l 。只有达到足够的剂量，微生物添加剂才能在动物肠道定 植并形成优势菌群，发挥其抑制病原菌的作用；( 3 ) 保存期：微生物添加剂在运输、贮存等过 程中不易存活因此有效地防止话菌数的衰减，提高活菌数量并延长活菌保藏期，已成为微生物 添加剂产品研究开发的技术关键：( 4 ) 促菌生长物质：促菌生长物质是指不能被有害菌利用，而 能为有益菌利用的低聚寡糖等。 本研究正是基于以上理念，从北京油鸡盲肠黏膜和粪便中分离得到乳酸菌，并对所获得的乳 酸杆菌菌株的生长曲线、产酸性能进行了比较，筛选出优良乳酸杆菌：在培养基优化方面，研究 了菊粉对乳酸杆菌生长情况的影响，为进一步提高乳酸杆菌的保存性能，试验将优良乳酸杆菌的 发酵产品经过冷冻干燥制成冻干菌粉，并测定了冻干菌粉对肉鸡盲肠黏膜和粪中乳酸菌和大肠杆 菌的数量，这为研制禽用微生物添加剂奠定基础。 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 1 原始菌种的分离与收集 2 材料与方法 北京油鸡盲肠黏膜和粪便一无菌水分散菌种一1 0 倍系列稀释菌液一涂布平皿一挑选单 菌落一接种斜面培养基保存 2 2 培养基 m r s 培养基：蛋白胨l o 0 9 ，牛肉膏1 0 0 9 ，酵母膏5 0 9 ，葡萄糖2 0 0 9 ，三水合乙酸 钠5 o g ，柠檬酸二氨2 0 9 ，吐温( t w e e n ) 一8 0 1 0 m ，k 2 i p o 2 o g ，m g s o , 7 h z 0 0 0 2 9 ，m n s 0 4 h z o o 0 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p i 为6 5 ，1 2 1 c 灭菌2 0 m i n 2 3 生化试剂： 吲哚试剂、硝酸盐还原试剂、双氧水等，l 一精氨酸液，萘氏试剂。革兰氏染色液孔雀绿 染色液。 2 4 鉴定培养基： 明胶培养基、淀粉培养基、各类糖发酵培养基。 以上所用试剂和培养基均按乳酸菌要求由本实验室制备 2 5 菊粉 菊粉从内蒙古亿利生物技术有限公司购买。菊粉含量9 0 ，单糖含量- 一- - 1 0 ，干物质9 5 ， 蛋白质3 ，大肠杆菌0 g ，细菌总数5 0 0 0 c f u g ，颜色微黄。 2 6 试验所用仪器 6 1 1 6 0 0 0 型生物显微镜 z h 吖一2 1 0 2 型全温震荡培养箱 h z o _ c 型双层空气恒温振荡器 p h 2 1 3 型酸度计 1 0 1 a - 2 型电热鼓风干燥箱 u v 一4 8 0 2 型紫外可见分光光度计 y 哟一l 3 l - - 4 0 0 型立式压力蒸汽灭菌锅 j r r 一1 3 0 0 型洁净工作台 重庆光电仪器有限公司 上海智城分析仪器制造有限公司 哈尔滨市东明医疗仪器厂 北京哈纳科仪科技有限公司 上海市实验仪器总厂 上海尤尼柯仪器有限公司 山东安得医疗科技有限公司 北京冠鹏净化设备有限责任公司 鸡源乳酸杆菌的分离鉴定及保存技术研究 g l 一2 0 b 型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂 f d - 8 0 型真空冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司 m d f - 3 8 2 e 日本三洋超低温冰箱北京东迅天地医疗器械有限公司 f u s 5 0 t a ) 生物反应器 上海国强生化工程装备有限公司 f u s 5 0 u a ) 生物反应器由蒸汽发生器、空气压缩机，空气过滤系统、冷却水循环系统、酸一 碱一消泡剂及补料流加器件组、发酵罐和在线发酵控制系统组成，发酵控制系统可以对发酵培养温 度、p h 值、搅拌速度以及酸、碱、消泡剂和发酵液的自动补料流加系统进行在线的自动监测控 制和记录，便于及时观察、分析和调整，确保发酵过程的稳定运行。 2 7 菌种的分离 活鸡剖杀，采用无菌操作，从盲肠黏膜上刮取内容物和收取粪各l g ，置于盛有9 m l 无菌生理 盐水的带有玻璃珠的三角瓶中，充分震荡摇匀，然后吸取0 5 m l 菌液于盛有4 5 m l 无菌生理盐水 的试管中，此稀释度为1 0 ，重复以上过程，依次制成1 0 、1 0 一、1 0 1 、1 0 一、1 0 “的菌液。选择 1 0 1 、1 0 、1 0 - 三个稀释度，吸取0 i m l 茵液分别滴于m r s 培养基平板上，采用烛缸法3 7 c 培 养2 4 4 8 h 。挑取形态不同的菌落分别在其选择培养基上划线接种做纯培养，而后置于4 c 冰箱 保存备用 2 8 菌种形态的观察 取干净玻片，用接种环取一环生理盐水于玻片上，而后挑取少量细菌，均匀涂于玻片上，待 干燥后，革兰氏染色和孔雀绿染色，镜检。 2 9 乳酸菌的鉴定 2 9 1 属的鉴定 革兰氏阳性兼性厌氧无芽孢杆菌：过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲 哚试验、硫化氢试验等，如均为阴性。则可初步定为乳酸杆菌属。 革兰氏阳性兼性厌氧球菌：细胞形态学检查，葡萄糖产酸产气试验、i o c 、4 5 c 、6 0 c 3 0 m i n 生长试验，p h 9 2 和p h 9 6 生长试验，根据上述试验结果进行初步鉴定。 2 9 2 种的鉴定 乳酸杆菌属鉴定：进行葡萄糖产酸产气、葡萄塘酸盐发酵和其他各类糖发酵试验1 5 c 生长 试验，精氨酸产氰试验，结果与乳酸细菌分类鉴定与实验方法和常见细菌系统鉴定手册 1 对照，进行鉴定。 球菌鉴定：在初步鉴定的基础上，根据各属的生理生化特征做各类糖发酵试验，精氨酸产氨 试验等结果与乳酸细菌分类鉴定与实验方法和常见细菌系统鉴定手册1 对照，进 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 行鉴定 2 1 0 优良乳酸杆菌的筛选及最佳培养条件的确定 采用_ 啜液体培养基，乳酸杆菌m 3 和乳酸杆菌姗( 以下简称m 3 、鹏) 的接种量均为1 0 ，3 7 下采用三角瓶通气( 加棉塞震荡) 培养和密闭( 恒温静置) 培养。分别在培养的第0 ，4 ，8 ， 1 2 ，1 6 ，2 0 ，2 4 ，2 8 ，3 2 ，3 6 ，4 0 ，4 4 4 8 ，5 2 h ，取一定量菌液测定m 值，并测定菌液p h 值 根据结果筛选出优良乳酸杆菌及确定其最佳培养条件。 2 1 1 培养基的优化 根据2 1 0 结果，以优良乳酸杆菌为菌种，在培养基中使总体上单糖比例为2 ，按菊粉中单 糖含量为1 0 计算，改变原有培养基( m 骼) 的碳源成分，以菊粉替代部分葡萄糖共分为i 组 ( 菊粉1 ，葡萄糖1 9 ) 、i i 组( 菊粉2 ，葡萄糖1 8 ) 、i i i 组( 菊粉3 ，葡萄糖1 7 ) 、 组( 菊粉4 葡萄糖1 6 ) 2 1 25 0 l 发酵罐扩大培养 2 1 2 1m 8 最佳收菌期的确定 本试验根据所用菌株晟适温度为3 7 ，控制发酵罐温度为3 7 ，发酵培养基采用m r s 培养 基，接种量为1 0 ，装液量为5 0 ，转速为1 0 0 r r a i n ，消泡剂为p d a 0 1 0 针有机硅o 0 2 最 初p h 6 4 6 5 ，自始至终维持罐压在0 0 8 m p a 。分别在发酵的第7 ，i l ，1 5 ，1 9 ，2 l ，2 3 ，2 5 ，” 2 9 ，