Ca离子和CaM在乙烯诱导的紫花擎天凤梨花芽孕育及发端中的作用机理研究-硕士论文

S t u d y o nt h eW o r k i n gM e c h a n i s mo fC a 2 + a n d C a M d u r i n gt h eE t h y l e n e - i n d u c e dF l o w e r B u d P h y s i o l o g i c a l D i f f e r e n t i a t i o na n dI n i t i a t i o ni n G ： ，Amaranthuzmanla m a r a n t l l ， ， AT h e s i s S u b m i t t e di nP a r t i a lF u l f i l l m e n to ft h eR e q u i r e m e n t F o rt h eM a s t e rD e g r e ei nL a n d s c a p eP l a n t sa n dH o r t i c u l t u r e B y Y iZ i l i n P o s t g r a d u a t eP r o g l 。a m C o l l e g eo fH o r t i c u l t u r ea n dL a n d s c a p e A r c h i t e c t u r e H a i n a nU n i v e r s i t y S u p e r v i s o r ：M i a n j i aH u a n g A c a d e m i cT i t l e ：P r o f e s s o r S i g n a t u r e A p p r o v e d J u n e 2 0 1 0 海南大学学位论文原创性声明和使用授权L , , 呲y 州1 m 7 m 9 帆8 叭眦7 帆5 3 I 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成 果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品 或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法 学位论文版权使用授权说明 日期：7 Jf o 年占月罗日 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学和中国 热带农业科学院。 保密论文在解密后遵守此规定。 敝储躲易船枸新躲弼统 日期：加；口年万月7 日。日期：力叮矿年乡月、7 日 本人已经认真阅读“C A L I S 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文 提交“C A L I S 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。 回童途塞握銮厦溢厦i 旦圭生i 旦二生；旦三生蕉查。 论文作者签名：岛粥幸碜 日期：函f 年月9 卣 导师签 日期： 摘要 C a 是植物许多重要生理过程的调控者，是细胞内信息传递物质，被称为“第二信 使。有研究者对钙在植物花发育过程中的作用展开了研究，认为钙信使系统在植物 的成花诱导、花芽分化及开花调控中都起着非常重要的作用，但目前关于C a 寸和C a M 是否参与花芽分化还存在争议：乙烯能诱导菠萝等凤梨科植物开花，但乙烯的催花机 理还不是很明确，内源乙烯激活营养分生组织向花原基分化的途径尚不清楚。在这样 的研究背景下，本研究以紫花擎天风梨为试材，在乙烯催花的基础上，使用C a 2 + 载体 A 2 3 1 8 7 ，钙离子专一性螯合剂E G T A 、钙调素( C A M ) 拮抗剂W 7 和T F P 进行处理，采 用石蜡切片方法观察各处理顶端分生组织形态学特征；同时采用酶联免疫法测定不同 处理的样品中的生长素( I A A ) 、赤霉酸( G A 3 ) 、玉米素( Z R ) 和脱落酸( A B A ) 及C a M 的含量；利用原子吸收法测定C a 含量；利用同源克隆得到C a M 基因，结合 N o r t h e r n 印迹杂交和半定量R T - P C R 检测分析不同时期C a M 基因表达量的变化。通过分 析对比在花芽分化前后C a 和C a M 以及与之相伴随的内源激素的动态变化，探讨 C a 2 + C a M 是否参与了乙烯诱导的花芽分化过程及其作用的机理。 主要研究结果如下： ( 1 ) 通过对顶端分生组织形态学变化特征观察，发现乙烯处理紫花擎天风梨， 在1 - - 8d 为花芽孕育期，在第9d 后茎尖下部明显伸长，花芽发端；1 4d 后花原基开 始分化： 3 0d 后初步形成花芽。用C a 2 + 载体A 2 3 1 8 7 处理使紫花擎天凤梨花芽分化提 前，分化时间缩短；C a 2 + 专一性螯合剂E G T A 、钙调素( C A M ) 拮抗剂W 7 和T F P 处理均可延缓或抑制乙烯诱导的花芽分化。说明c a 2 + 和C a M 可能参与了乙烯诱导的 花芽分化过程，调节了花芽分化进程。 ( 2 ) 本试验研究发现内源激素水平与花芽分化进程密切相关。所有处理，在花 芽生理分化阶段Z R 、I A A 含量逐渐增加，在花芽形态分化阶段Z R 、L 认含量较高。 紫花擎天凤梨花芽生理分化阶段A B A 含量较低，而花芽形态分化期A B A 含量较高； G A 3 在紫花擎天凤梨花芽孕育期处于低水平，在花芽发端期出现波峰，进入花芽形态 分化期G A 3 含量开始下降；Z R + A B A G A 3 、Z R + I A A G A 3 的平衡关系及其变化动 态，在乙烯诱导紫花擎天凤梨花芽分化过程中起着重要的调控作用。C a 2 + 载体A 2 3 1 8 7 、 C a 2 + 专一性螯合剂E G T A 、钙调素( C A M ) 拮抗剂W 7 和T F P 处理均显著影响乙烯诱 导的花芽分化过程中激素含量的峰值，及其出现的时间。推测C a 2 + C a M 信号系统可 能是通过调节植物内源激素水平或者与其协同作用，最终来实现对乙烯诱导花芽分化 的调控作用。 ( 3 ) 本试验发现紫花擎天凤梨花芽中C a 和C a M 在花芽孕育期积累，在花芽发 端期降低。A 2 3 1 8 7 处理可显著提高总C a 和C a M 的含量，提早C a M 峰值出现，促进花 芽分化，而E G T A 、T F P 、W 二7 处理可显著降低C a 和C a M 的含量，延缓花芽分化。 这也都充分说明成花的启动过程需要C a 2 + 和C a M 参与。 ( 4 ) 克隆了紫花擎天凤梨中编码C a M 基因的e D N A 序列片段，长度为4 5 4b p 。 ( 5 ) 本试验通过运用R T - P C R 和N o r t h e r n 杂交对乙烯处理后C a M 基因的表达情 况进行了分析，结果表明乙烯处理导致紫花擎天凤梨的C a M 基因表达量增加。在乙 烯处理1d 后C a M 基因表达量开始增加，3d 时表达量最大，而后第4d 表达量下降。 而纯水( 对照) 处理的C a M 基因表达量一直维持在较低的水平，没有出现表达增强 的趋势。R T - P C R 与正向N o r t h e r n 杂交检测结果吻合。在分子水平的研究直接证明了 C a M 基因参与了在紫花擎天凤梨花芽分化过程。 以上试验从生理水平和分子水平证实了C a 2 + C a M 参与了乙烯诱导的紫花擎天凤 梨花芽分化过程。同时对不同处理伴随的植物内源激素的变化规律的研究，都为进一 步探讨植物激素a 2 + C a M 系统一花芽分化三者的相互作用及调控机理的研究奠定 了基础。 关键词：钙调素激素花芽分化花芽发端基因克隆基因表达分析 A b s t r a c t C ai st h ei n t r a c e l l u l a ri n f o r m a t i o nt r a n s f e rs u b s t a n c e s ，r e g u l a t i n gan u m b e ro fi m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e si np l a n t s ，a n dk n o w n 嬲t h e ”s e c o n dm e s s e n g e r ”M o s to ft h e r e p o r t so nf o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o nw e r el i m i t e dt oc h a n g e si nt h el e v e l o fs u b s t a n c e s S t u d i e so nt h ei n t e r n a lm a c h a n i s mw e r es e l d o m T h i sp a p e rw a st oc l a r i f yt h ed y n a m i c sa n dt h em e c h a n i s mo fC aa n dC a Mi nt h ep r o c e s s o ff l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o nb yu s i n gG u z m a n i a A m a r a n t h a sm a t e r i a l s T r e a t e d 、航m t h eC a 2 + a c c e l e r a t o rA 2 3 1 8 7 ，c a l c i u mi o n - s p e c i f i cc h e l a t i n ga g e n tE G T A ，c a l m o d u l i n ( C A M ) a n t a g o n i s t sW - 7a n dT F Pr e s p e c t i v e l y ，t h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fG u z m a n i a A m a r a n t h m e r i s t e mw e r eo b s e r v e db yp a r a 伍ns e c t i o n A n dt h ec o m e n t so fL A AG A s ，Z R , A B Aa n dC a Mw f f i ed e t e c t e db yE L I S A C ac o n t e n t sw e r ea n a l i z e db yA t o m i cA b s o r p t i o n S p e c t r o p h o t o m e t r y ( A A S ) mC a Me x p r e s s i o nc h a r a c t e r i s t i c sw e r es t u d i e db yu s i n g N o r t h e r nb l o ta n dR T P C Rm e t h o d s 1 n h em a j o rr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) A b o u t9d a y sa f t e re t h p h o nt r e a t m e n t , t h es h o o tt i p so fG A m a r a n t h b e g a nt o e x p a n d i n g A f t e rf u r t h e rd e v e l o p m e n t so f14d a y s ，t h e r ea p p e a r e dt h ef o r m a t i o no ff l o r a l p r e m i u m n 圮f l o w e rb u d sw e r eo b v i o u sa f t e r3 0d a y s T h ef u n c t i o n s o fe x o g e n o u s e t h y l e n ei n c r e a s e dw i t ht h et r e a t m e n to fc a l c i u mi o n o p h o r eA 2 3 1 8 7 T h i sr e s u l ti n d i c a t e dt h a t C a 2 十a n dC a Mm a yp a r t i c i p a t ei nt h ep r o c e s so fe x o g e n o u se t h y l e n eo nf l o w e ri n d u c t i o no f G A m a r a n t h C a l m o d u l i na n t a g o n i s tt r i f l u o p e r i z i n e ( T F P ) ，W 一7a n dC ：a 2 + c h e l a t o rE G T A a l li n h i b i t e do rd e l a y e dt h ef l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o ni n d u c e db ye t h y l e n et os o m ee x t e n t s I ts h o w st h a tC a 2 + a n dC a Mm a yb ei n v o l v e di nt h ep r o c e s so fe t h y l e n e i n d u c e df l o w e rb u d d i f f e r e n t i a t i o n , r e g u l a t e sb u dd i f f e r e n t i a t i o np r o c e s s ( 2 ) E n d o g e n o u sh o r m o n e sl e v e l sa n df l o w e rb u dd i f f e r e m i a t i o nh a dc l o s e l yr e l a t i o n s L o wl e v e lo fA B Ap r o m o t e dt h ed i f f e r e n t i a t i o no fG A m a r a n t h f l o w e rb u d s ，w h i l eh i g l l l e v e lo fA B Ac a ni n c r e a s et h ed e v e l o p m e n to ff l o w e rb u d s T h e r eW a sac e r t a i nn e g a t i v e c o r e l a t i o nb e t w e e nG A 3c o n t e n t sa n df l o w e rb u dd i f f e r e n t i o na tt h ee a r l ys t a g eo ft h e f l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o n , w h i c hw a s1 0 Wl e v e l so fG A 3w a sg o o da tt h et h ef l o w e rb u d p h y s i o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o n H i g hl e v e l so fZ R , I A Ah a dt h ef u n c t i o n so fp r o m o t i n gt h e f l o w e rb u d sd i f f e r e n t i a t i o n T h i sr e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h eb a l a n c ea n dd y n a m i c so fZ R + A B A J G A 3 ，Z R + I A A G A 3p l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a t i n gt h ee t h y l e n e i n d u c e d f l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o n W es p e c u l a t e dt h a tC a Z + _ C a Ms i g n a Js y s t e mu l t i m a t e l ya c h i e v e t h er e g u l a t i o no fe t h y l e n e i n d u c e df l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o nb yr e g u l a t i n gt h el e v e lo f e n d o g e n o u sh o r m o n e so rt h e i rs y n e r g i e s ( 3 ) A 2 3 1 8 7t r e a t m e n te n h a n e e dt h ec o n t e n t so fC aa n dC a Mo fd u r i n gt h ef l o w e rb u d d i f f e r e n t i a t i o n , a n dp r o m o t e dt h e f l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o n E G T A W 一7a n dT F P I I I t r e a t m e n tr e d u c e dt h ec o n t e n t so fC aa n dC a M d u r i n gt h ef l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o n , a n d d e l a y e dt h ea c c u m u l a t i o no fC aa n dC 舒江w h i c hi n h i b i tt h ef l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o n T h i s f u l l ys h o w s t h eb o o tp r o c e s sn e e d st ot h ei n v o l v e m e mo fC a 2 + a n dC a M ( 4 )Ac D N Af r a g m e n tw i t h4 5 4b po fc a l m o d u l i ni nG A m a r a n t h w a sf t r s t l yi s o l a t e d ( 5 ) ，n l ee x p r e s s i o nl e v e lo fC a Mg e n eW a sa n a l i z e dw i t hs e m i q u a n t i t a t yR T - P C R t e c h n i q u e sa n dN o r t h e r nb l o t 1 1 l er e s u l t ss h o w e dt h a te t h y l e n et r e a t m e n ta c c e l e r a t e dt h e e x p r e s s i o no fC a Mg e n e T r e a t e dw i t he t h y l e n e ，t h eC a Mg e n ee x p r e s s i o nb e g a nt oi n c r e a s e a f t e ra t1dw i t hd e a l e d A f t e r , r e a c h e dt h ep e a ka t3d ，t h eC a M g e n ee x p r e s s e dt h el a r g e s t a m o u n t , a n dt h e nt h ef i r s te x p r e s s i o no fad e c l i n e df r o m4d 1 1 1 et r e a t m e n to fb l a n ke x p r e s s i o no fC a Mg e n e sh a sb e e nm a i n t a i n e da tar e l a t i v e l yl O Wl e v e lo f e x p r e s s i o na n dh a sn o tt h et r e n do fi n c r e a s e de x p r e s s i o n T h er e s u l t so fS e m i - q u a n t i t a t i v eI m P C Rw e r e c o n s i s t e n tw i 廿1t h o s eo fN o r t h e r nb l o t T h er e s e a r c hp r o v e da tt h em o l e c u l a rl e v e lt h a tt h eC a Mg e n e s i n v o l v e di nt h ef l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o np r o c e s so fG A m a r a n t h A tp h y s i o l o g i c a la n dm o l e c u l a rl e v e l s ，t h ea b o v et w oe x p e r i m e n t sc o n f i r m e dt h a tt h e C a 2 + C a Mc h a n n e l si n v o l v e di nt h ee t h y l e n e i n d u c e df o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o np r o c e s so f G A m a r a n t h a n ds u p p l i e dr e f e r r e n c e sf o rt h er e s e a r c ho ft h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e np l a n t h o r m o n e C 矿+ C a Ms y s t e ma n df l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o n K e yw o r d s ：c a l m o d u l i n , h o r m o n e ，d i f f e r e n t i a t i o no ff l o w e rb u d ，f l o w e r - b u di n i t i a t i o n , g e n e c l o n e ，g e n ee x p r e s s i o na n a l y s i s 目录 摘要I A b s t r a c t I I I 目录V 第一章前言1 1 1 钙在植物细胞中的研究l 1 1 1 钙在植物细胞中的分布1 1 1 2 钙作为植物信号转导中第二信使的作用1 1 2 钙调素的研究2 1 2 1 植物钙调素的结构及其作用原理2 1 2 2 植物钙调素的生理功能3 1 2 3C a M 在植物细胞中的分布及基因表达4 1 2 3 1C a M 在植物细胞中的分布4 1 2 3 2 在植物中C a M 基因的表达4 1 3C a 2 + _ C a M 信号系统与乙烯的关系5 1 4C a 2 + C a M 信号系统与花芽分化6 1 4 1 外源c E + 浓度变化对花芽分化的影响6 1 4 2C a 2 + _ C a M 与花芽分化7 1 5 乙烯催花的研究7 1 6 花芽分化的研究概况8 1 6 1 花芽孕育、发端及花芽分化的概念8 1 6 2 激素调控花芽分化的假说9 1 6 2 1 激素平衡控制花芽分化假说9 1 6 2 2 激素调控成花基因表达假说9 1 6 2 3 激素调控营养转向假说1 0 1 6 2 4 激素信号调节花芽分化假说l O 1 6 3 植物激素与花芽分化1 1 1 7 研究目的及意义1 2 1 8 研究的技术路线1 2 第二章紫花擎天风梨顶端分生组织形态学变化特征。1 3 2 1 材料与方法1 3 2 1 1 材料、试剂及仪器1 3 2 1 1 1 实验材料1 3 2 1 1 2 实验仪器1 3 2 1 1 3 实验试剂1 3 2 2 实验方法1 3 2 2 1 紫花擎天凤梨的药剂处理1 3 2 2 2 石蜡切片与显微观察方法1 4 V 3 4 本章小结2 5 第四章花芽分化过程中C a 和C a M 含量测定2 6 4 1 材料与方法2 6 4 1 1 材料、试剂及仪器2 6 4 1 1 1 实验材料“2 6 4 1 1 2 实验仪器2 6 4 1 1 3 实验标样及试剂- 2 6 4 1 2 实验方法2 6 4 1 2 1 紫花擎天凤梨的药剂处理方法2 6 4 1 2 2C a 测定方法2 6 4 1 2 3C a M 的测定方法2 6 4 2 结果与分析2 6 4 2 1 各处理不同花芽中C a 含量的变化动态2 6 4 2 2 各处理不同花芽中C a M 含量的变化动态2 8 4 3 讨论2 9 4 4 本章小结3 0 第五章C a M 基因克隆及表达分析。31 5 1 材料与方法31 5 1 1 植物材料及处理方法3l V I 5 1 2 菌株和载体31 5 1 3 培养基3l 5 1 4 试剂盒和主要试剂3 1 5 2 总R N A 的提取( C ”出法) 31 5 3e D N A 模板的合成3 2 5 4P C R 反应3 2 5 4 1 内参选择与R T - P C R 引物设计3 2 5 4 2P C R 反应。3 3 5 4 3 大肠杆菌感受态的制备。3 3 5 4 4 连接转化3 4 5 4 5 菌落P C R 并测序3 4 5 5C a M 基因表达的R T - P C R 分析3 5 5 6 正向N o r t h e r n 印迹杂交3 6 5 6 1 探针的制备3 6 5 6 2 杂交膜的制备3 6 5 6 3 杂交3 6 5 6 4 杂交结果的检测3 6 5 7 结果与分析3 7 5 7 1R N A 质量检测3 7 5 7 2 紫花擎天风梨钙调素基因序列克隆与分析3 7 5 7 3R T - P C R 分析4 0 5 7 4 正向N o r t h e m 印迹杂交4 1 5 8 讨论4 1 5 9 ，J 、结z I ：! 第六章结论与展望。4 3 6 1 结论与推测4 3 6 2 研究中尚未解决的问题4 4 6 3 展望4 4 参考文献4 5 附录l ：实验仪器5 3 附录2 ：实验药剂5 3 致谢5 4 V I I 第一章前言 1 1 钙在植物细胞中的研究 1 1 1 钙在植物细胞中的分布 细胞内的C a 2 + 浓钙在细胞中以多种形式存在。细胞中的钙，即总钙，含量在0 1 1 0m m o l L 1 。其可分为游离钙、结合钙和贮存钙。植物细胞内的钙分布不均匀，在非 激活静止状态时，细胞内自由C a 2 十浓度约为1 0 审1 0 。7m o l L - 1 ，一般认为在0 1 - 一0 6l l m o l L ，胞夕b C a 2 + 浓度约为0 1 1 0 I tm o l L ，C l c n d 和E v e n s 估计胞夕b C a 2 + 浓度为 1 0 。5 - 1 0 4m o l L ，但T r c w a v e s 等认为只有1 0 。6m o l L ，甚至更少( T r c w a v a s 等，1 9 9 5 1 A l i e n 等，2 0 0 1 ) 。 细胞内的C a 2 + 浓度不能太高，溶质中C a 2 + 浓度如果太高，会与细胞内的磷酸根产 生沉淀，而磷酸根是细胞能量及物质代谢所必须的，所以细胞P 勺C a 2 + 浓度( t c a 2 lc y t ) 过高对细胞有害，甚至会致死。细胞内的钙绝大部分以结合态的形式存在，如与钙结 合蛋白、内质网、线粒体、叶绿体，特别是与液泡结合，这些都是细胞内的“钙库。 结合钙和某些物质的亲和力很强，在细胞中常与其它结构成分紧密结合。贮存钙占总 钙的大部分，含量在1 0 6m m o l L 。1 以上，常位于细胞器和细胞壁中，当细胞的生理 活动需要增加钙浓度时，这些暂时贮存的钙则从贮存位点释放出来，运输到细胞所需 部位或个体的其他部位；它与结合钙的区别在于亲和力较弱，与碳水化合物、磷化合 物等结合得不紧密，可转换成其他形式的钙或被输送到细胞其他位置。不同形式的钙 具有不同的生理功能，在组织、细胞中的分布位点不同，在一定生理条件下，这三类 型的钙也可相互转化换。“钙库 中钙含量很高，但游离C a 2 + 浓度不高。C a 2 + 平时以 结合态的形式结合在这些细胞器上，它的迅速释放和螯合对维持细胞内C a 2 + 浓度的稳 定平衡及C a 2 + 的信使作用起一个很大的钙缓冲作用( B u s h ，1 9 9 5 ) 。“钙库 q C a 2 + 的缓冲能力主要是由于存在一类对C a 寸高容量、低亲和力的贮钙蛋白有关。由于它们 对C a 2 + 的低亲和力，故当“钙库中钙通道开放时，钙蛋白能迅速地和钙解离，将C a 释放到胞质中去，使C a z + 信号能准确、迅速的传递。 。1 1 2 钙作为植物信号转导中第二信使的作用 许多试验已经证明，胞质C a 2 + 浓度的变化启动是C a 信使系统的中心环节。杨宏远 ( 1 9 9 9 ) 将研究结概括为以下几点：( 1 ) 钙在植物生理活动中起广泛的作用。有各 种外界与内在的信号因子( 如光、温度、盐、触动、重力、辐射、激素等) 所导致的 植物反应，大多和钙信号转导有关。钙在细胞分裂、极性形成、生长、分化、衰老凋 亡等生命过程中均起到重要的调节功能。( 2 ) 胞质游离钙( C a 2 + 】c ) 的瞬间变化， 是细胞响应各种刺激信号的初始事态，由此而诱发以后一系列信号转导的下游事态。 【c a l c 的瞬间增加有两种可能来源：一是胞# b C a 2 + 通过C a 2 + 通道的开启进入胞内；二 是胞内钙库( 如内质网、液泡等) 向胞质释放出C a 2 + ；( 3 ) 钙信号通过钙靶蛋白进行 信号转导。钙靶蛋白又通过和其他靶蛋白分子( 如各种蛋白激酶) 结合而启动基因表 达与细胞生命活动，从而构成钙信号转导的复杂体系。( 4 ) 钙信号系统中的各种分 子在细胞中具有严格的空间分部，他们在细胞壁、胞质、胞质溶胶、细胞器、细胞骨 架、细胞核等部位定位，是复杂的细胞网络( c y t o n e t ) 中的重要组成成分，以保证各 项细胞生命活动的平衡，实现细胞结构与功能的统一。 1 2 钙调素的研究 钙调蛋白( C a l m o d u i n ，简称C a M ) 是一种分布最广、多功能的钙受体蛋白，C a M 是1 9 6 7 年美籍华人张槐耀在研究细胞内c A M P 的浓度变化中环腺苷酸磷酸二脂酶 ( P D E ) 的调节作用时发现的。K r o s t i n g e r 建议命名( C a l m o d u l i n ，C a M ) ，我国于 1 9 8 7 年正式被命名为钙调素( 顾永清，1 9 9 4 ) 。因此，C a M 又称钙调素，作为细胞 中多功能的C a 2 + 受体在细胞信号转导过程中发挥着非常重要的功能，可以通过与其下 游C a M 结合蛋白( C 心仍P s ) 作用而参与动植物细胞中多种酶和生理过程的调节( 毛 国红等，2 0 0 4 ) 。 1 2 1 植物钙调素的结构及其作用原理 C a M 是一种由1 9 种1 4 8 个氨基酸组成，氨基酸序列保守，耐热的小分子量单链可 溶性球蛋白，分子量约1 6 7 - 1 6 8k D a ，有4 个E F 臂，能结合4 个C a 2 + ，分别被称之为 结合域I 、I I 、I V 。E F 臂是由一个中央螺旋连结两个球状结构所形成的螺旋线 螺旋的结构，每两个E F 臂由一条长的可自由伸展的a 螺旋连结成一组。C a M 具热稳 定性、酸性( 等电点3 9 - 4 3 ) ，其中1 3 是带有侧链的谷氨酸和天冬氨酸，具疏水性， 结合C a 2 + 后分子构象发生改变，由哑铃状变为球状，其疏水区呈激活态，能与多种靶 蛋白结合( R a y m o n de ta 1 ，1 9 9 8 ；A n i r e d d ye ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 E F 臂结构具有结合钙离子的能力，每个E F 臂结构可以结合1 个钙离子。C a M 分子 的整体的构象变化是其执行生理功能的必要条件。钙调素本身没有酶活性，同C a 2 + 的 结合是C a M 活化的重要条件，只有在结合3 4 个C a 2 + 以后才具有生物活性，发挥其调 控功能。细胞内C a M 的水平最终是由胞内C a 2 + 浓度控制的，当胞内浓度高于1 0 。5m o l - L 一， 时，C a 2 + 就结合C a M 。当细胞接受环境刺激后，胞外钙离子的涌入和胞内钙库的释放 会使胞质自由C a 2 + 浓度升高，C a 2 + 浓度的改变可以引起C a M 构象定量变化，产生 C a 2 + C a M 复合物以下列方式调节代谢：( 1 ) 直接与靶酶作用，C a 2 + C a M 复合物结合 在靶酶如P D E 、环化酶，C a 2 + A T P a s e 的变构位上，诱导靶酶形成活性的构象。 ( 2 ) 通过活化依赖钙调素的蛋白激酶，磷酸化许多靶酶，影响其活性。蛋白激酶的活化会 导致代谢的关键酶或转录因子活化，从而完成对细胞代谢活动或某些基因表达的调节。 2 1 2 2 植物钙调素的生理功能 钙调素( C a l m o d u l i n ) 是一种小分子酸性、耐热性蛋白，等电点在3 9 4 3 之间， 结构比较保守、变异小，普遍存在于生物体中的一类结构保守的调节蛋白。钙调素做 为C a 2 + 的受体，在C a 2 + 信号系统传导中起着关键的作用，它通过和C a 的结合而激活 一系列的靶酶和非酶蛋白质，从而调控生理代谢及基因表达。在植物生理学、发育生 物学、细胞生物学研究中，C a C a M 一直是热点。目前对C a M 生理功能的研究涉及面 相当的广泛，研究表明C a M 参与调控多种的生理功能。如参与了酶活性调节、细胞分 裂与分化、细胞骨架与细胞运动、光合作用、激素反应、核内酶系统及基因表达等生 理过程中。 W i t i s u w a n n a k u l ( 1 9 9 0 ) 研究证明C a M 参与了乙烯利刺激巴西橡胶树乳胶增产过 程中的分子调控和信号转导。G u n t h e r ( 1 9 9 3 ) 等在对光敏素调控基因表达的研究中发 现了，C a M 参与了光敏素调控的基因表达过程。王启明等( 1 9 9 8 ) 用2 ，4 D 或6 B A 处理向日葵下胚轴愈伤组织后，C a M 含量上升，随后诱导愈伤组织的生长与分化。对 大豆C a 2 + - A T P 酶S C A I 进行的研究发现C a 2 + _ A T P 酶S C A I 的活性会随着C a + 浓度的增加 而增加。C a M 和C a 2 + A T P 酶S C A I 的N 端结合，如果S C A I 的N 端的两个C a M 结合位点缺 失，整个S C A I 蛋白就会失活。研究表明大豆的C a A T P 酶S C A I 可被C a M 激活，不能 被渗透胁迫调控( W o oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在研究拟南芥气孔运动时，对其施加外源C a M ， 检测出细胞内H 2 0 2 和钙离子浓度有所增加，最终导致气孔关闭。随后在实验中对三聚 体G 蛋白( 一种帮助外源C a M 运输的蛋白质，可增加H 2 0 2 和钙离子的含量) 缺失株和 高表达的拟南芥植株施加外源的C a M ，发现外源C a M 对缺失株无显著影响，细胞