高效液相色谱荧光检测法测定辣椒及花椒制品中的罗丹明B

化学测定方法高效液相色谱荧光检测法测定辣椒及花椒 制品中的罗丹明 B乔海鸥，胡佳薇，王敏娟陕西省疾病预防控制中心，陕西 西安 710054摘要: 目的 建立液相色谱 荧光检测法测定辣椒及花椒制品中罗丹明 B。方法 样品经甲醇 / 水 / 甲酸溶液( 50 + 50+ 1) 提取，Oasis MCX 固相萃取小柱净化，Waters SymmtryC18 柱( 4 6 mm 250 mm，5 m) ，流速 1 0 ml / min，梯度洗脱，柱温 25 ，进 样量 50 0 l，激 发波长 538 nm，发 射 波 长 573 nm，外 标 法 定 量。结 果 罗 丹 明 B 在 0 1 ng / ml 100 0 ng / ml范围均具有良好的线性( r 0 9999) ，回收率 89% ，最低检出限为 0 3 g / kg 范围。结论 该方法检测灵 敏度高、特异性强、干扰少、检出限低、回收率好，可以用于辣椒和花椒制品中罗丹明 B 的检测。关键词: 罗丹明 B; 辣椒; 花椒; 荧光法; 高效液相色谱中图分类号: O657 7 + 2 文献标识码: A 文章编号: 1004 8685( 2014) 05 0641 04Determination of rhodamine B in capsicum and pepper products by high performance liquid chromatography with fluorescence detectorQIAO Hai ou，HU Jia wei，WANG Min juanShanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Xian 710054，ChinaAbstract: Objective A high performance liquid chromatography fluorescence detection method was developed for rhodamine B detection in capsicum and pepper products Methods The sample was extracted with methanol / water / formic acid( 50 + 50 +1) ，and purified with Oasis MCX SPE cartridges，then separated by Waters Symmetry C18 column( 4 6 mm 250 mm，5 m) with gradient elution at a flow rate of 1 0 ml / min，excitation wavelength( ex ) of 556 nm and emission wavelength( em ) of 573 nm respectively，quantified by external standard method And The column temperature was 25 and the injection volume was 50 0 l esults hodamine B showed good linearity in the range of 0 1 ng / ml 100 0 ng / ml with correlation coeffi- cient greater than 0 9999 The recoveries for rhodamine B were more than 89% ，and the detection limit was 0 3 g / kg Con- clusion Due to advantages of high sensitivity and specificity，less interference，low limit of detection and good recovery，this method can be applied to the determination of the rhodamine B in capsicum and pepper productsKey Words: hodamine B; Capsicum; Pepper; Fluorescence method; High performance liquid chromatography罗丹明 B 又名罗丹明 610，玫瑰红 B，蕊香红 B， 玫瑰精 B 等，英文名: hodamine B，是一种红色的人 工 合 成 染 料，分 子 式: C28 H31 ClN2 O3 ，分 子 量: 479 0175，易溶于水、乙醇，微溶于丙酮、氯仿、盐酸和 氢氧化钠溶液。用于实验室中细胞荧光染色剂，工业 染料，由于具有潜在的致癌性1。2008 年中国卫生 部将其列于食品中可能违法添加的非食用物质和易 滥用的食品添加剂品种名单( 第一批) 中2，禁止其 在食品中使用。但是，由于罗丹明 B 比其它食用水溶 性染料如诱惑红、赤鲜红、等更易于在辣椒制品上染 色且不易褪色，而且成本低，因此一些不法商贩用罗 丹明 B 染料对这些食品进行染色，以次充好，以假冒 真，欺骗损害消费者，危害消费者的身体健康。目前对罗丹明 B 的检测方法有紫外 可见分光作者简介: 乔海鸥( 1974 ) ，男，硕士，主管技师，主要从事卫生检 验工作。光度法3、高效液相色谱法( HPLC) 4、液相色谱 串 联质谱法( LC MS / MS) 5，6。罗丹明 B 为酸碱两性 化合物，易溶于水。本研究采用水提取，经 SPE 小柱 净化并浓缩后，用高效液相色谱 荧光法测定，外标 峰面积法定量，通过对实际 95 份样品同时进行高效 液相色谱 荧光法和液相色谱 串联质谱的检测分 析，发现本方法检测灵敏度高、特异性强、干扰少、检 出限低、回收率好，可以用于调味品中罗丹明 B 的检 测。1材料与方法1 1试剂与材料1 1 1标准物质、罗丹明 B 标准品( hodamine B， CAS 81 88 9) : 纯度均不小于 95% ，美国 Sigma 公 司。1 1 2甲醇; HPLC 级，德国 Merk 公司; Oasis WAX固相萃取小柱( 60 mg，3 ml; Waters 公司) 针式过滤器( 0 22 m) : 天津津腾公司。1 1 3 标准储备液的配制 精确称取罗丹明 B 标准 品 10 mg，用 50% 甲醇水溶液定容至 10 ml 的棕色容 量瓶中，将其作为贮备液，低温下保存。1 1 4标准系列的制备将标准储备液用 50% 甲醇 稀释成 浓 度 为 0 1 ng / ml、1 0 ng / ml、5 0 ng / ml、 10 0 ng / ml、20 0 ng / ml、100 ng / ml 标 准 系 列 溶 液。 置于 0 4 避光保存。1 2 仪器 Waters alliance 2695 高效液相色谱仪( 配 置四元泵溶剂淋洗系统、自动进样系统，2475 荧光检 测器，Empower2 色谱工作站) ，固相萃取装置、高速离 心机( 转速大于 10000 r / min) ，Dionex U3000 高效液 相色谱仪 ( 配置四元泵溶剂淋洗系统、自 动进样系 统) 、3200 Q Trap 质谱仪( 配电喷雾离子源( ESI) 、三 重四级杆质量分析器) ( 美国 AB 公司) 。1 3 色 谱 条 件 Waters SymmtryC18 柱 ( 4 6 mm 250 mm，5 m) ，流速 1 0 ml / min，柱温 25 ，进 样 量: 50 0 l，荧光检测器; 激发波长( Ex) 538 nm，发射 波长( Em) 573 nm。流动相为甲醇( A) ，水( B) ，梯度 洗脱( 0 min 4 min，40% A，4 min 6 min，40% 70% A，6 min 9 min，70% A，9 1 min，40% A) 。1 4 确证 对 96 份实际样品进行液相色谱 串联 质谱确证。液相色谱条件: 色谱柱: Dionex Acclaim SLC 2 1 100 mm C18 ，2 2 m; 流 动 相: A: 乙 腈; B: 含0 1% 甲 酸 的 5 mmol / L 乙 酸 铵 水 溶 液; 流 速:0 6 ml / min; 柱温: 35 ; 进样体积: 10 0 l。质谱条件: 电喷雾 ESI 离子源( 正离子) ; 扫描方 式多反应监测( MM) ; 电喷雾电压: 5500 V; 气帘气 压力: 20 psi; 雾化气压力: 40 psi; 辅助气压力: 50 psi; 离子源温度: 550 ; 碰撞室入口电压( EP) 、碰撞室出 口电压 ( CXP) 、碰 撞 电 压 ( CE) 、去 簇 电 压 ( DP) 见 表 1。文采用固相萃取小柱对提取液进行净化处理。 取 5 0 ml样品提取液，用水释定容至 50 0 ml，过 MCX 固相萃取柱( 提前用 3 ml 甲醇、3 ml 水活化) ，用 3 ml 水、3 ml 甲醇淋洗，5 ml 5% ( V / V) 洗脱，收集洗脱液， 氮气吹至近干，用流动相定容至 1 0 ml，过膜后上机 测定。2结果与讨论2 1提取条件的的选择罗丹明 B 易溶于水、甲醇、 乙腈，微溶于丙酮、氯仿。由于甲醇价格便宜且毒性 小于乙腈，本文考察了甲醇 水体系的提取效率，对 含油脂较少的样品如辣椒面、花椒面，发现甲醇比例 增加时，回收率没有明显的变化，当样品中油脂含量 较高时，加入甲醇回收率明显提高，但甲醇的比例超 过 80% 时，回收率基本不再增加。由于罗丹明 B 是 以氧杂蒽为母体的碱性染料，其分子结构中 C = N 双 键的 N 原子较活泼，在酸性水溶液中易失去电子，从 而处于阳离子状态。利用这一特性，在甲醇 水体系 中加入 1% 的甲酸，结果表明，对于油脂含量较高的样 品加入 1% 的甲酸后能显著提高罗丹明 B 的提取率， 甲醇 水 甲酸( 50 + 50 + 1) 组成的提取液其提取效率 与 80% 甲醇水溶液相当，因 此，选 用甲醇 水 甲酸 ( 50 + 50 + 1) 作为提取液。2 2净化条件的选择罗丹明 B 的分子结构中既含 有疏水性基团又含有离子基团，因此罗丹明 B 的净化 既可以选用 C18 、HLB 等通用型净化柱又可选用特异 性较强的离子型净化柱。我们考察了 HLB 型净化柱 的净化效果和回收率，发现 HLB 净化柱对于辣椒粉、 花椒粉的净化效果还可以，但对于辣椒酱、辣椒油的 净化效果比较差，经常在罗丹明 B 的出峰时间处出现 大的鼓包型峰，严重影响罗丹明 B 的定性和定量。为 此选用混合型阳离子固相萃取小柱 Oasis WAX 进行 净化，结果表明 Oasis WAX 小柱能有效去除样品中的 非极性和极性物质，Oasis HLB 和 Oasis WAX 柱对同 一品牌辣椒油的净化效果见图 1、图 2。表 1 罗丹明 B 质谱参数名称母离子 Q1 子离子 Q3CEDPEPCXP罗丹明 B443 2399 2 a501009 17355 250100917注: a 定量离子对。1 5 样品前处理1 5 1 提取 称取 1 0 g 试样于 25 ml 离心管中，加 入 10 0 ml 甲醇 / 水 / 甲酸( 50 + 50 + 1 ) 溶液，超声提 取 30 min，10000 r / min 离心 10 min，将上清液转移至 25 ml 比色管，残渣中加入 10 0 ml 甲醇 水( 1 1) 再 次提取，合并两次提取液。1 5 2 净化 辣椒用甲醇 / 水( 1 + 1) 提取后，提取液 中有辣椒红素、辣椒玉红素、 胡萝素和玉米黄质等 杂质存在，直接测定会干扰罗丹明 B 的测定，因此本图 1 某品牌辣椒油使用 Oasis HLB 净化后的色谱图2 3 激发波长和发射波长的选择 样品的荧光激发 光谱和荧光发射光谱反映了样品的一定能级结构，因 此样品的荧光激发光谱和荧光发射光谱可用来定性 分析。罗丹明 B 在紫外和荧光都有吸收，但荧光检测 器只对带有荧光基团的物质有响应，因此可有效的去中国卫生检验杂志 2014 年 3 月第 24 卷第 5 期 Chin J Health Lab Tec，Mar 2014，Vol 24，No 5643图 2 相同品牌辣椒油使用 Oasis HLB 净化后的色谱图除不带有荧光基团的杂质对样品测定的干扰，大大提 高了罗丹明 B 的检测灵敏度。为考察罗丹明 B 的最大激发波长，固 定发射波 长，对激发波长进行扫描，结果如图 2 所示，罗丹明 B 最大激发波长在 538 5 nm，为此择 538 nm 作为激发 波固定激发波长，对发射波长进行扫描，结果如图 3 所示，罗丹明 B 的最大发射波长在 573 5 nm，因选择 573 nm 为激发波长( 图 4) 。2 5线性关系与检出限取适量混合标准溶液用流 动 相 稀 释 成 0 1 ng / ml、1 0 ng / ml、5 0 ng / ml、 10 0 ng / ml、20 0 ng / ml、100 0 ng / ml 的系列标准溶 液。在选定的色谱条件下，进样 50 l，测定峰面积， 以峰面积对质量浓度绘制标准曲线，其线性回归方程 为: 1 01 106 x 4 74 104 ，相关系数为 0 9999，检 出限为 0 3 g / kg，实验室比对显示，采用本方法罗丹 明 B 的检出限水平与本实验室 AB 公司的液相色谱串联质谱 3200Q TAP 相当。2 6精 密 度 实 验分 别 制 备 浓 度 为 2 0 g / ml、10 0 g / ml、50 0 g / ml 的罗丹明 B，连续进样 6 针， 进行批内精密度实验，以 峰面积计算 SD，结 果 见 表 2。表 2 方法的精密度实验( 批内精密度实验，n = 6)浓度SD浓度SD浓度SD名称( g / ml)( % )( g / ml)( % )( g / ml)( % ) 罗丹明 B 2 0 1 2 10 0 0 8 50 0 0 6 取上述三种浓度的罗丹明 B 标准，每 天进样 2针，以峰面积计取其平均值，连续 6 d 进样。进行批 间精密度实验，计算峰面积 SD，结果见表 3。浓度( g / ml)SD浓度SD浓度SD名称( % )( g / ml)( % )( g / ml)( % )表 3 方法的精密度实验( 批间精密度实验，n = 6)图 3 罗丹明 B 的激发光谱图图 4 罗丹明 B 的发射光谱图2 4 流动相的选择 流动相的选择参考 SN / T 2430 2010进出口食品中罗丹明 B 的检测方法7，选 用甲醇和水作为流动 相，采 用 梯 度 洗 脱 ( 0 min 4 min，40% A，4 min 6 min，40% 70% A，6 min 9 min，70% A，9 1 min，40% A) 。罗丹明 B2 01 510 01 050 01 0从表 2、表 3 可以看出，罗丹明 B 标准的批内精密 度和批间精密度 SD 均小于 3% ，表明该方法精密度 良好，符合实验要求。2 7 回收率实验 选取辣椒粉代表固体样品，辣椒 油代表含油样品，分别选取高、中、低三个不同浓度做 加标回收试验，实验结果表明，使用改进后的方法，罗 丹明 B 回收率均在 86% 以上，并且固体样品和含油 样品的回收率几乎没有区别，具体实验数据见表 4。表 4 使用改进后的提取方法罗丹明 B 的加标回收率( n = 6)名称加标量( g / kg)实测值( g / kg)回收率( % )辣椒面2018 7493 710097 5897 61000992 6899 3辣椒油2017 9889 910097 3997 41000982 6598 3图 5 1 ng / ml 罗丹明 B 的色谱图2 8实际样品的测定使用本方法对市面上在售的8 份辣椒酱、11 份辣椒油、38 份辣椒面、35 份花椒面、( 下转第 646 页)表 3 准确度试验加标量( g / ml)回收量( g / ml)平均回收率( % )加标量( g / ml)回收量( g / ml)平均回收率( % )加标量( g / ml)回收量( g / ml)平均回收率( % )化合物敌敌畏 1 00 0 738 73 8 0 50 0 364 72 8 0 25 0 195 78 0 甲拌磷 1 00 1 007 100 7 0 50 0 425 84 9 0 25 0 214 85 6 内吸磷 1 50 1 250 83 3 0 75 0 698 93 07 0 35 0 348 99 4 乐果1 50 1 233 82 2 0 75 0 680 90 7 0 50 0 4998 0 毒死蜱 1 00 1 113 111 3 0 50 0 464 92 8 0 25 0 219 87 6马拉硫磷 2 00 1 841 92 05 1 00 0 81 81 0 1 00 0 938 93 8对硫磷 1 00 1 001 100 1 0 50 0 458 91 6 0 25 0 220 88 0从表 2 和表 3 可以得知，7 种化合物重复测定，其 相对标准偏差( SD) 为 1 429% 5 894% ，回收率为 72 8% 111 3% 。结果显示，回收率和精密度良好，完全能满足生活饮用水中有机磷农药残留的检测质 量要求。3结论本实验建立了 2 次液液萃取，FPD CGC 测定生 活饮用水中 7 种有机磷残留的方法。方法对各目标 物均有良好的线性关系。分析了加标水样，回收率和 相对标准偏差分别在 72 8% 111 3% 和 1 429% 5 894% 之间，适合于生活饮用水中痕量有机磷农药 的检测。参考文献1 祁静 有机磷中毒的急救与护理有机磷中毒的种类、症状及诊断J 实用护理杂志，1994，10( 6) : 2 32 中华人民共和国卫生部 GB 5749 2006 生活饮用水卫生标准S 北京: 中国标准出版社，20063 康跃惠，张干，盛国英，等 固相萃取法测定水源水中有机磷农药J 中国环境科学，2000，20( 1) : 1 44 Ahmadi F，Assadi Y，Hosseini SM，et al Determination of organo- phosphorus pesticides in water samples by single drop microextraction and gas chromarography flame photometric detectorJ J Chroma- togr A，2006，1101( 1 2) : 307 3125 王凌，徐晓琴，殷月芬，等 GC FPD 双柱法测定海水中的痕量 有机磷J 现代科学仪器，2007，( 2) : 75 77收稿日期: 2013 09 02( 上接第 643 页)3 份花