天津大学生物化学课件第四章-第三节-修改.ppt

第三节蛋白质的理化性质,一、蛋白质的分子量,二、两性游离和等电点,三、蛋白质的胶体性质,四、蛋白质的沉淀反应,五、蛋白质的变性和复性,六、蛋白质的颜色反应,一、蛋白质的分子量,蛋白质的分子量一般在1万100万道尔顿由于是生物大分子，因此在溶液中极不稳定，不能用测定小分子物质的方法（如冰点降低、沸点升高）来测定一般以渗透压法、凝胶过滤、聚丙烯酰胺凝胶电泳及超离心法来测定其分子量。超离心法较准确，但实验条件要求很高,二、两性游离和等电点1,pHpI47,pH=pI7=7,pHpI97,由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸所具有的两性游离性质，蛋白质也同样具有,二、两性游离和等电点2,肽与氨基酸都有COOH，NH2，但肽还含有侧链R基上的可解离基团，且其为主要解离基团。肽链中的COOH与NH2相距较远，因此它们之间的静电引力较弱，可离子化程度较低。大的肽比小肽的离子化程度低，即大肽完全质子化所需pH比小肽低。N端NH2的pK，值比游离氨基酸的小，C端的COOH的pK，值比游离氨基酸的大，侧链R基的pK，值在两者之间。,蛋白质两性游离的特点,二、两性游离和等电点3,在同一pH溶液中，由于各种蛋白质所带电荷的性质和数量以及分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有差别，可以利用这种性质来分离和分析蛋白质，称为蛋白质电泳分析法。常用的有纸上电泳、醋酸纤维膜电泳、聚丙烯纤维的凝胶电泳,蛋白质两性游离的应用1,二、两性游离和等电点3,蛋白质两性游离的应用2,电泳,三、蛋白质的胶体性质1,由于蛋白质分子大，且球状蛋白质分子中亲水的氨基酸残基多位于颗粒表面，故在水溶液中能与水起水合作用。因此，蛋白质的水溶液具有亲水胶体的性质,为什么蛋白质具有胶体性质,三、蛋白质的胶体性质2,蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有二个稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外力条件作用，不致互相凝集。如除掉这两个稳定因素，蛋白质便容易凝集析出。因此，可用此原理提取蛋白质，如常用中性盐硫酸胺来竞争水而使水化膜破裂，产生沉淀。,蛋白质胶体稳定的原因,三、蛋白质的胶体性质3,蛋白质具有许多高分子溶液的性质。如扩散、粘度大、不能透过半透膜。利用不能透过半透膜的性质可以将蛋白质和其他一些小分子分开，常用方法有渗析和超滤。,三、蛋白质的胶体性质4,渗析,血液透析,小分子被带出,透析机,透析液,血液,加压,三、蛋白质的胶体性质4,超滤,四、蛋白质的沉淀反应1(概述),定义:使蛋白质从溶液中析出的现象。原理:蛋白质稳定因素有水化层和带电层,水化层是蛋白质分子表面的许多亲水基团与水分子结合形成的一层水膜，它使蛋白质颗粒不能相互接触聚集成大颗粒；带电层是蛋白质分子表面的可解离基团在一定pH环境下解离产生的。由于带同性电荷的蛋白质颗粒相互排斥，也使蛋白质颗粒不能聚集，当改变这些稳定因素，蛋白质分子相聚集而从溶液中析出。特点:一般沉淀出的蛋白质是变性的。如果控制实验条件（如低温、温和沉淀剂），便可得到不变性的蛋白质。,四、蛋白质的沉淀反应2(方式1),定义:加入大量中性盐(硫酸胺)以破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质从水溶液沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质的等电点(溶解度最小，易沉淀)则效果最好。各种蛋白质分子的颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。因此，调节混合蛋白质的溶液中的中性盐的浓度，可使各种蛋白质分段沉淀。,1盐析1,四、蛋白质的沉淀反应2(方式1),1盐析2,蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，它们被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀,四、蛋白质的沉淀反应2(方式2),pH稍大于等电点为宜，因为此时蛋白质带负电，易与金属离子结合成盐。通常这种沉淀为变性的，如控制温度（低温）并控制重金属离子浓度，则可用于分离制备不变性的蛋白质。,2重金属盐沉淀蛋白质,四、蛋白质的沉淀反应2(方式3),某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、鞣酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、水杨磺酸、硝酸等）与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。沉淀条件应当是pH小于等于电点，这样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。,3生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质,四、蛋白质的沉淀反应2(方式4),可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。如酒精的消毒作用。在低温条件下，变性进行较缓慢，可以用来制备蛋白质。其优点在于：不像盐析那样存在有大量盐类，必须经透析除去，而且有机溶剂很易通过稀释透析及蒸发等方法除去。,4有机溶剂沉淀蛋白质,四、蛋白质的沉淀反应2(方式5),将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热可使蛋白质发生凝固而沉下。鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都变成固体样的东西了。这是蛋白质凝固作用应用于食品加工的典型例子。,5加热凝固,五、蛋白质的变性和复性（变性1）,定义:以某些物理或化学因素的作用，使蛋白质严格的空间构象破坏（不包括肽键的断裂），而引起蛋白质若干理化和生物学性质的改变。影响蛋白质变性的因素:紫外线照射、加热煮沸、强酸、强碱、重金属盐和有机溶剂处理等。原理:维持蛋白质二级、三级和四级结构的严格构象的力只是一些弱的次级键，它们很容易被破坏。特点:天然构象被破坏，蛋白质失去了生物学活性。,五、蛋白质的变性和复性（变性2）,五、蛋白质的变性和复性（变性3）,五、蛋白质的变性和复性（复性）,复性:某些变性蛋白质，再除去变性因素后，可以重新获得其天然结构和生物活性，称为蛋白质的“复性”。如有一些球蛋白被热或极端pH变性后，若缓慢冷却或缓慢恢复到正常pH时，将重新获得其天然结构和生物活性。这种复性现象，即蛋白质折叠研究中的所谓“折叠”。,六、蛋白质的颜色反应1,1.双缩脲反应1,原理:蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色混合物。应用:可以用此反应来定性测定蛋白质；也可在540nm处比色，定量测定蛋白质。,六、蛋白质的颜色反应1,2H2NCNH2,H2NCNCNH2NH3,1320C,O,O,H,O,尿素,双缩脲,双缩脲,CuSO4+NaOH,紫红色物质,1.双缩脲反应2,六、蛋白质的颜色反应2,2.酚试剂（福林试剂）反应,原理:蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物）应用:常用此反应来定量测定蛋白质含量。最近普遍使用的Brodford法,（考马思亮兰G-250法）将会在以后的实验接触。,六、蛋白质的颜色反应3,含有芳香族氨基酸，特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，加盐则白色沉淀变成黄色，再加碱呈橙黄色。因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物,3蛋白质的黄色反应1,六、蛋白质的颜色反应3,3蛋白质的黄色反应2,硝基酚（黄色）,邻硝醌酸钠（橙黄色）,六、蛋白质的颜色反应4,4米伦化反应,米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。当蛋白溶液中加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。由于酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故有此反应。,六、蛋白质的颜色反应,5乙醛酸反应1,在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环。凡含有吲哚基的化合物都有此反应，由于色氨酸含有类似结构，因此含有色氨酸或含色氨酸的蛋白质都有此反应