饲料中粗蛋白的测定课件.ppt

饲料中粗蛋白的测定,常用方法,国标法 凯氏定氮仪法 强碱直接蒸馏法 双氧水法,样品的采集、制备,生产单位有代表性的原料检样：鱼粉、玉米蛋白粉、豆粕 采用四分法将检样缩至500g，粉碎后通过40目筛，装于密闭容器中，防止试样成分变化或变质,国标法,实验原理 国标法测定试样中含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵，加入碱进行蒸馏使NH3 逸出，用硼酸吸收后，再用盐酸滴定，测出含氮量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白的含量。,实验试剂,硫酸：化学纯，含量为98%，无氮； 混合催化剂：0.4gCuSO4，6gK2SO4 或 Na2SO4 均为化学纯，磨碎混匀； NaOH：40% 水溶液，化学纯； 硼酸：2% 水溶液，化学纯； 混合指示剂； 0.1mol/LHCl标准溶液； 0.02mol/LHCl标准溶液； 蔗糖：分析纯； 硫酸铵：分析纯，干燥； 硼酸吸收液。,仪器,实验用样品粉碎机或研钵； 40目分析筛； 分析天平； 电炉； 酸式滴定管； 凯氏蒸馏装置； 凯氏定氮装置,操作步骤,试样的消化 称取试样 0.5 1g（含氮量5 80mg），准确至0.0002g，小心无损的将样本放入 100mL洗净烘干的凯氏烧瓶中。加入 6.4g 混合催化剂与试样混合均匀，再加入 12mL 硫酸和两粒玻璃珠。将凯氏烧瓶置于通风厨里的电炉上加热，开始加热时，先用小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力，消化时经常转动消化瓶，使全部样本浸入硫酸内，如有黑色油在瓶壁，应待烧瓶冷却后加少量蒸馏水冲洗，再继续加热消化。如有黑炭粒不能全部消化，则待烧瓶冷却后，补加少量硫酸加热，直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热至消化完毕。,氨的蒸馏 试样消煮液冷却后加入20mL蒸馏水，转入100mL 容量瓶内，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有 20mL 硼酸吸收液和 2 滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴、硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液1020mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加入10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，以防漏气。蒸馏4min后降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。,空白测定 称取蔗糖0.5g，代替试样，按照前面的消化蒸馏方法进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过 0.2mL，消耗 0.2mol/L 的盐酸标准溶液不得超过0.3mL。,滴定 蒸馏后的吸收液立即用 0.1mol/L 或0.2mol/L标准盐酸溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色。同样滴定试剂空白消化液。,结果计算,粗 蛋 白 质 含 量（%）= （V-V0 ）N 0.0146.25100 M(V 2V 1) 式中： V滴定样品吸收液时所消耗的盐酸标准溶（mL)； V0 空白测定吸收液所消耗的盐酸标准溶液（mL) ； V1 样品消化液总的体积（mL）； V2 从100mL消化分解液中吸取的消化液体积（mL)； 0.014氮的毫克当量数； M样品的质量（g）； N盐酸标准溶液当量浓度,凯氏定氮仪法,试剂 同凯氏定氮测粗蛋白法 仪器 自动或半自动定氮仪,操作步骤 试样的消化 称取试样 0.5 1g（含氮量5 80mg），准确至0.0002g，放入消化管中，加两片消化片（仪器自备）或6.4g混合指示剂、12mL硫酸，于420在消煮炉上消化1h，取出放凉后加入30mL蒸馏水。,氮的蒸馏 采用定氮仪，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以 25mL 硼酸为吸收液，加入两滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消化管中加入 50mL 氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以流出的液体呈中性为宜，可用pH试纸测试。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。,滴定 空白测定 计算 （同国标法）,2019/11/16,16,可编辑,强碱直接蒸馏法,强碱直接蒸馏法 (Direct Distillation，俗称DD法)是间接测定饲料中粗蛋白质的一种简便的方法。,实验原理,其原理是将粉碎的饲料样品在强碱中消煮，使饲料中的 - 氨基、酰氨基以及某些特殊基团上的氮素在强碱的作用下以氨的形式释放出来，直接蒸馏到硼酸中，再用盐酸溶液来滴定，根据盐酸消耗量来计算 DD 法所测得的表观含氮量。但是，由于 DD 法测定过程中的氨量的释放是不定量进行的，因此必须根据经典的凯氏定氮法所标定的校正数值，用一定的回归方程来计算样品中的粗蛋白质的含量。,试验步骤,消化 称量5.000g样品，粉碎经40目筛后放500mL 凯氏烧瓶中，加 50mL 蒸馏水（边加边摇），使充分混合。,蒸馏,向凯氏烧瓶中加入 25mL 10% 氯化钡溶液，振荡摇匀，再加120mL 40% 的氢氧化钠溶液，立即连接蒸馏装置进行蒸馏。把蒸馏装置冷凝管的末端浸入盛有 50mL 2% 的硼酸溶液和 2 滴混合指示剂的锥形瓶中，轻轻摇动凯氏烧瓶使溶液混匀，然后加热进行蒸馏，待蒸馏出的液体体积达到100mL（总体积达到150mL）时停止蒸馏。,滴定,用0.1mol/L的盐酸标准溶液进行滴定。,结果计算,粗蛋白质含量（%）= （V 2V 1）C 0.0146.25 100 M 式中：V2 滴定试样时所需标准酸溶液的体积（mL）； V 1滴定空白时所需标准酸溶液体积（mL）； C盐酸标准溶液浓度（mol/L）； M试样质量（g）； 0.014C(HCl)=1.000mol/L与1.00mL盐酸标准溶液 相当的、以g表示氮的质量； 样品中含氮量用以下的回归方程计算： y=9.2918x-0.2852 式中： x为DD法测定所得到的含氮量； y为样品的实际含氮量。,双氧水法测定,试剂 硫酸：化学纯，含量为98%，无氮； 双氧水：分析纯，含量为30%； 氢氧化钠：双氧水：分析纯，含量为40%（m/v）； 硼酸：化学纯， 2% 水溶液（m/v）； 混合指示剂；盐酸标准溶液； 邻苯二甲酸氢钾法标定液； C（HCl）=0.1mol/L、 8.3mL 盐酸（分析纯）注入 1000mL蒸馏水中； 蔗糖：分析纯； 硫酸铵（GB1396）：分析纯，干燥。,仪器,实验室用样品粉碎机或研钵; 分样筛孔径 0.45mm（40 目）; 分析天平（感量0.0001g）; 消煮炉或电炉; 10mL、25mL 酸式滴定管；250mL 消化管；150mL ；250mL 锥形瓶 ；定氮仪（以凯氏原理制造的各类型半自动蛋白质测定仪）。,原理,浓硫酸和 30% 浓度的双氧水都是强氧化剂。饲料中的有机物接触到浓硫酸便被脱水炭化。但是在高温条件下，向未被硫酸完全氧化的饲料中滴加 30% 的双氧水，会使饲料中的有机物彻底氧化、分解，放出 CO2 、SO2 ，而释放出的氨气则和硫酸结合生成硫酸铵。然后用半微量凯氏定氮装置对接收液进行蒸馏，再用盐酸标准溶液对接收 定氮装置对接收液进行蒸馏，再用盐酸标准溶液对接收的含量。,试验步骤,样品消化 样品粉碎后全部通过40目。称取试样 0.2 2.0g（含氮量 5 80mg），准确至0.0002g，放入消化管中，加 10mL 浓硫酸摇匀，管口上放一只小漏斗（在消化过程中起回流作用，以减少硫酸的损失），放在电炉上消煮20min，当硫酸大量冒烟、消化液呈酱油色时，将消化管取下稍冷却（手摸不烫手），向管内加双氧水 10 15 滴，加热消化。如此反复 2 3 次，直至管内溶液澄清透明为止。取下消化管，冷却后注入30mL蒸馏水备用。,氨的蒸馏,采用定氮仪，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以 25mL 硼酸为吸收液，加入两滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消化管中加入 50mL