重亚硫酸盐测序技术介绍.ppt

重亚硫酸氢盐直接测序技术介绍,DNA甲基化含义,在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5甲基胞嘧啶，这常见于基因的5-CG-3序列。大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5端的非编码区，并成簇存在。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活。DNA甲基化主要形成5甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7甲基鸟嘌呤（7-mG）,启动子的CpG岛,CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度超过200bp。在启动子（promotor）或“起始”区域周围，甲基化经常被抑制。这些区域包含浓度相对较高的CpG对，与此段区域对应的染色体区段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的基因编码有关。,CpG岛的甲基化,CpG岛经常出现在真核生物的house-keeping基因的调控区，在其它地方出现时会由于CpG中的C易被甲基化而形成5-甲基胞嘧啶，脱氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身就会存在于DNA中，因此不易被修复，所以被淘汰。故CpG在基因组中是以岛的形式分布的。,基本原理,重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优点。,重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点,优点：测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区，能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列。缺点：它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故灵敏度较MSP差。,2019/11/18,7,可编辑,酶切法同亚硫酸氢盐联合法,酶切法：限制性酶切后选用对特异DNA片段甲基化序列敏感的限制性内切酶(酶切位点与甲基化位点不重叠)进行酶切后，以待测甲基化位点外侧序列为扩增起始点进行PCR。该DNA片段若存在甲基化，将会有扩增产物出现；若无甲基化，则不会有任何片段扩增出现。当用甲基化不敏感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不论该部位是否甲基化都不应有片段扩出。PCR法比Southem法更为敏感，但只能检测甲基化敏感的限制性位点的CpG甲基化，且DNA必须酶切完全，否则会出现假阳性。,酶切法同亚硫酸氢盐联合法,联合亚硫酸氢盐限制分析(combinedbisulriterestrictionanalysis，C0BRA)亚硫酸氢钠可以使DNA未甲基化的C经脱氨基作用转化为u，通过随后的PcR，u将转化为T，但亚硫酸氢钠对已发生甲基化的C无上述转化作用。故此，DNA经亚硫酸氢钠处理后，进行限制性酶切CpG位点时，限制性位点的保留与否能反应该DNA片段是否发生甲基化。经电泳后电泳条带长度和强度差异观察，可以分析DNA甲基化状态和甲基化程度。COBRA集使用方便，定量准确和与石蜡切片良好的兼容性三种特色于一身，能定量检测微量DNA样品特定基因位点的甲基化状态，但由于涉及PCR和限制性酶的使用，通常只能分析一个特定的序列,SSCP,将亚硫酸氢盐处理和单链构象多态性PCR(PCRSSCP)结合起来，设计了针对转化后DNA序列的引物，同时扩增未甲基化和甲基化的DNA，由此产生的两种不同的扩增产物可以通过SSCP区分。此方法可方便地应用于任何序列的甲基化状态的分析，能对甲基化的等位基因进行半定量，获得甲基化和未甲基化等位基因的比例；并且可以提示甲基化状态的不均匀性。,重亚硫酸直接测序法对启动子测序的应用,CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构。启动子的甲基化能