本科毕业论文-利用全氟辛酸反向离子对试剂高效液相色谱法检测茶叶中的茶氨酸.doc

湖湖南南农农业业大大学学全全日日制制普普通通本本科科生生毕毕业业论论文文利用全氟辛酸反向离子对试剂高效液相色谱法检测茶叶中的茶氨酸Availableeasurementoftheaningusingreverse-phaseion-pairhighperanceliquidchromatographywithphotodiodearraydetection学生姓名学生姓名：学学号：号：200641704224年级专业及班级：年级专业及班级：2006级级植物植物资资源工程源工程(2)班班指导老师及职称：指导老师及职称：学学院：院：园园艺艺园林学院园林学院湖南长沙提交日期：20年目录摘要.1关键词：.11前言.11.1分光光度法.21.2高效液相色谱法.21.3毛细管电泳法.42材料和方法.52.1试剂.52.2茶样.52.3仪器.52.4色谱条件.52.5标准样品制备.52.6茶叶样品制备.52.7数据分析.63方法讨论.63.1波长的选择.63.2PDFOA最佳浓度的确定.63.3提取条件的选择.74方法确证.84.1线性范围、检测限、定量限.84.2重现性.94.3回收率.104.4实际样品测定.105结论.11参考文献.11致谢.131利用全氟辛酸反向离子对试剂高效液相色谱法检测茶叶中的茶氨酸学生：指导老师：龚（湖南农业大学园艺园林学院，长沙410128）摘要：通过添加全氟辛酸（PDFOA，2mmolL）为离子对试剂，以乙腈-水为流动相，在200nm检测波长下建立了一种快速测定茶叶中茶氨酸的分析方法。在此分析条件下，茶氨酸的保留时间为9.160min，在10-1000gmL范围内，茶氨酸的峰面积与进样量之间具有良好的线性关系，回归方程为：Y=284889.33+14470.01X，R2=0.9983，最低定量限、最低检测限分别为0.51gml和1.56gml。所建方法准确，灵敏，并具高回收率，适用于茶叶中茶氨酸的检测。关键词：茶氨酸离子对色谱全氟辛酸茶叶Availableeasurementoftheaningusingreverse-phaseion-pairhighperanceliquidchromatographywithphotodiodearraydetectionStudent:PengJinTutor:GongYunshun(CollegeofHorticultureandLandscape，HunanAgriculturalUniversityChangsha410128China)Abstract:Anion-pairreversed-phaseliquidchromatographicfortheanalysisoftheaninehasbeendevelopedinthepresentpaper.2mmollPDFOAaqueoussolution(pairedionreagent)andacetonitrile(82:18vv)wereusedasthemobilephase.Thewavelengthwaskeptat200nm.TheretentiontimeofTheaninewas9.160min.Thecalibrationoftheaninewasingoodlinearityintherangeof10-1000gmLwiththeregressionequationY=284889.33+14470.01X，R2=0.9983.TheestimatedLOQandLODwere0.51gmland1.56gmlrespectively.Thisisaccuratewithhighrecoveryandcanbeappliedfortheanalysisoftheanineincommercialteaandtheanineproducts.Keywords:TheanineIon-pairedchromatographyPentadecafluorooctanoicacidTea1前言茶氨酸（theanine）又名为5-N-乙基-谷氨酰胺（5-N-ethyl-glutamine），其化学结构见图1-1。1949年，日本学者Sakato最早从绿茶（Camelliasinensis）中发现茶氨酸21，随后Casimir和Tsushida在蕈(Xerocomusbadius)和茶梅(Camelliasasanqua)中分别分离得到23。作为绿茶的主要呈味物质之一，茶氨酸具有特殊的鲜爽味，能缓解茶叶的苦涩味4，其含量与茶叶的品质成正相关，相关系数达到0.787-0.876，是评价绿茶品质的重要指标5。茶氨酸占茶叶干重的1.0-2.0%，占整个氨基酸的50%67。高含量的茶氨酸在茶树体内中起着重要的作用，是茶树体内可溶氮的存在和贮藏形式，同时也是儿茶素生物合成时儿茶素环形成的重要前体8。H2NOHNOOH图1L-茶氨酸的化学结构Fig.1ChemicalstructureofL-theanine由于茶氨酸的特殊鲜爽味，1964年日本政府批准茶氨酸作为食品添加剂。1985年，美国FDA认可茶氨酸为一般公认为安全的物质（GRAS），在使用时不作限制用量的规定。目前，在日本、美国已作为食品添加剂并进一步开发为保健品。进一步研究表明，茶氨酸具有提高免疫力、降血压、降血脂、协助抗癌和保护神经细胞等一系列的药理功能9。茶氨酸逐渐成为国外天然药物、天然保健品、功能饮料等行业备受关注的热点成分之一。茶氨酸早期分析检测方法主要有碱式碳酸铜沉淀法、高氯酸滴定法、纸层析法和薄层色谱法等方法10。随着科学技术的发展，不断出现分光光度法、高效液相色谱检测法和毛细管电泳检测法等新的检测方法。1.1分光光度法茶氨酸的水解产物乙胺的氯代衍生物能氧化碘化钾而析出碘在加入淀粉后溶液颜色即可达到最深，10min内吸光度稳定，用紫外检测进行分析定量茶氨酸。高小红等以热水萃取茶氨酸加浓盐酸水解为乙胺利用上述特性建立了分光光度测定茶叶中茶氨酸含量的新方法，其中茶氨酸浓度在1.6-10.0mgL-1范围内与吸光度呈线性关系检出限为310-4gL-111，由于检测灵敏度低，逐渐被高效液相色谱和毛细管电泳所代替。31.2高效液相色谱法大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性，为提高分离检测的灵敏度和分离特性，通常利用异氰酸苯酯(PITC)和邻苯二甲醛(OPA)等衍生试剂将其衍生后用紫外检测或荧光检测分析氨基酸。茶氨酸属于非蛋白氨基酸，因此也可以利用此方法来检测茶氨酸。1996年郭升平采用WatersM344高效液相色谱仪，以PITC为柱前衍生剂反相C18柱梯度洗脱M990二极管阵列检测器波长243nm处测定茶叶中茶氨酸12。2005年朱松等也建立了一种OPA柱前自动衍生、紫外检测茶氨酸的方法，该方法选用HypersilODS色谱柱，醋酸钠溶液和甲醇进行梯度洗脱在UV338nm处检测13。2006年Thippeswamy对比了PITC和OPA两种衍生试剂对茶氨酸测定的影响，结果表明：OPA衍生的方法最低检测限和最低定量限分别为0.12和0.35mg，PITC衍生的方法最低检测限和最低定量限分别为0.25和0.75ng，灵敏度比OPA衍生的方法高出50倍14。1985年MacDonald等人报道，氨基酸类物质与Co2+有配合作用能够抑制Co2+催化鲁米诺(Luminol)与过氧化氢(H2O2)的化学发光反应，利用此原理建立了氨基酸类标准物质的化学发光分析方法15。2002年周光明等应用此方法对茶氨酸进行测定，其条件为：Co2+的质量浓度为2g.L-1，鲁米诺浓度为0.25mmol.L-1，过氧化氢浓度为0.5mmol.L-116。由于衍生的检测方法测定茶氨酸试样衍生操作繁琐干扰因素较多近年来许多学者尝试建立不需衍生直接测定茶氨酸的方法。蒸发光检测器（ELSD）是通用型检测器可以检测没有紫外吸收的物质。1999年Peterson和Petritis等人首先利用蒸发光检测器检测分析氨基酸1718。2005李银花建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定茶叶中茶氨酸方法，最低定量限为4.8ng，最小检测限为1.2ng19。由于茶氨酸在低紫外区有吸收，可以在波长200nm左右选用紫外检测器对茶氨酸进行检测。2003年朱小兰等采用波长203nm、ODS色谱柱、体积分数0.05%三氟乙酸水溶液为流动相检测茶叶中的茶氨酸，最低检出限为1.75ng，并使用电喷雾离子质谱仪对分离物质进行定性鉴定20。施倩利用此方法对六大茶类进行了分析21。2006年唐仕荣改三氟乙酸为磷酸溶液为流动相进行检测，并建立了相应高效液相测定茶氨酸的方法2223。对于普通的ODS柱如果长时间采用0.05%三氟乙酸水溶液或磷酸溶液为流动相，会造成填料塌陷，降低柱子的柱效和缩短柱子的使用寿命。而且每次进样分析后，要用乙腈冲4洗色谱柱10min，然后用流动相平衡色谱柱约10min至基线平稳，造成实际分析时间过长。液质联用（HLPC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。1996年Kiehne等采用热喷雾-液质联用技术测定其准分子离子峰同时测定了茶叶中的儿茶素、生物碱和茶氨酸24。2004年朱小兰等建立了液相色谱-二极管阵列光谱检测电喷雾离子化质谱（HPLC-DAD-ESI-MS）同时测定茶氨酸、绿原酸、生物碱与儿茶素含量的方法25。2009年王虹等采用高效液相色谱-大气压化学电离（HPLC-APCI-MS）联用技术测定茶氨酸，并采用正交试验的方法优化质谱条件：干燥气流3.0Lmin，物化压力1.38105Pa，雾化器温度300，毛细管电压为3000V26。1.3毛细管电泳法毛细管电泳技术的原理是利用带电质点在电场作用下产生定向运动而混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子质量又不尽相同在同一电场的作用下各组分泳动的方向和速度不同因此在一定的时间内各自移动距离不同而可以达到分离鉴定的目的。包括在毛细管中进行的区带电泳（Capillaryzoneelectrophoresis，CZE）、凝胶电泳（Capillarygelelectrophoresis，CGE）、等速电泳（Capillaryisotachophoresis，CITP）、等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing，CIEF）以及电泳与色谱法相结合的毛细管胶束电动色谱（Micellarelectrokineticchromatography，MEKC）和毛细管电色谱（Capillaryelectrochromatography，CEC）。目前以CZE和MEKC的使用最为方便。1997年Hideki等报道采用毛细管区带电泳(CZE)同时测定儿茶素、咖啡碱、茶氨酸和抗坏血酸的含量27。2000年AucampJP等用束胶电动毛细管色谱法(MEKC)在pH7.0的25mmol.L-1磷酸、100mmol.L-1SDS、6%甲醇缓冲体系下，分离电压14KV，温度25，检测波长200nm的条件下同时分析了儿茶素、茶氨酸、咖啡因、没食子酸和抗坏血酸28。2004年李平等以MEKC方法，用24-硝基氟苯为衍生剂缓冲液为pH9.8的0.03mol.L-1四硼酸钠缓冲体系，分离电压28KV，检测波长360nm，建立了茶氨酸的定量方法29。反相离子对色谱法已经广泛应用于生物碱、有机酸、磺胺类药物、抗生素、微生素和氨基酸、多肽及其衍生物的研究30。茶氨酸为谷氨酸的衍生物，极性较强，在ODS色谱柱中保留能力较弱，在三氟乙酸或磷酸的水溶液中就被洗脱下来20。近年来，研究着重于把高序列离子试剂应用到反向离子对色谱中，改善色谱保留行为，增强分离效果。5本文使用挥发性的PDFOA作为离子对试剂，通过探讨离子对条件参数对茶氨酸在色谱保留行为的影响，建立一种PDFOA离子对色谱法测定茶叶中的茶氨酸的检测方法。2材料和方法2.1试剂茶氨酸对照品由日本太阳化学株式会社提供，乙腈（美国Tedia公司）为色谱纯，经过0.45m滤膜过滤，纯水来自于Millipore超纯水器制备，经过0.45m水膜过滤，PDFOA（95%，AlfaAesar公司，lot#10138529）2.2茶样茶叶样品由湖南农业大学茶学系提供，-20保存至使用前。2.3仪器高效液相色谱仪（ShimadzuLC-10AVP液相色谱系统，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC-Solution色谱工作站），Millipore超纯水器，KQ3200超声波提取器(昆山市超声仪器有限公司)，MettlerToledoAG104电子天平。2.4色谱条件色谱柱：KromasilTMC18(5m，150mm4.6mm)；流动相：乙腈(18%)和PDFOA水溶液(82%)；流速：1mLmin；进样量：l0L；检测波长范围：190nm-360nm；温度：35。2.5标准样品制备用纯净水配备浓度为1mgml茶氨酸母液。稀释标准溶液配制了一系列含6个不同浓度的标准溶液（10，25，50，100，250，500gml），标准溶液保存在冰箱中。2.6茶叶样品制备将茶叶样品用植物样本粉碎机粉碎，称取1.00g，加入80mL水室温超声波超声提取10min，离心10min，取上清液，沉淀加10mL水，摇匀后再次离心，取上清液，沉淀再6加5ml水，摇匀后第三次离心，取上清液，合并三次上清液，定容至100mL容量瓶。以上样品溶液均用0.45m滤膜膜过滤，进样l0L。2.7数据分析实验数据采用单因素方差分析法进行分析，数据分析软件采用Orgin7.5软件。3方法讨论3.1波长的选择称取一定茶氨酸标准品，用水溶解配成0.1mgml，在190-360nm波长扫描。结果如图2所示。茶氨酸溶液在193nm处有吸收峰，与文献基本一致31。考虑低紫外溶剂干扰，本实验参考文献选择200nm为检测波长25。3.2PDFOA最佳浓度的确定PDFOA浓度的增加对茶氨酸容量因子K值影响较为明显。对PDFOA浓度Cp的对数值与容量因子K的对数值进行拟合，得方程ln(K)=1.378+0.778ln(Cp)R2=0.999与方程ln(K)=a+bln(Cp)相吻合32。与此同时，随着流动相中PDFOA浓度增加，一方面茶氨酸的分析时间相应增加，另一方面PDFOA的浓度高于2mmolL在室温条件下较难溶解，因此，本实验PDFOA浓度采用2mmolL。图2茶氨酸标样溶液光谱图Fig.2Spectrumoftheaninestandardsolution7图3PDFOA浓度对茶氨酸容量因子的影响Fig.3EffectofPDFOAconcentrationontheretentionfactorKoftheanine图4茶氨酸的高效液相色谱图（A标准品溶液色谱图，B茶叶样品溶液色谱图）Fig4Retentiontimeoftheanine（AChromatogramoftheaninestandardsolution，BchromatographyofteasampleSolution，PDFOAconcentrationwas2mmolL）3.3提取条件的选择为了获取茶叶最佳的提取条件，将茶叶样品用植物样本粉碎机粉碎，称取1g分别按以下方法提取茶叶中的茶氨酸：（1）加入80mL沸水提取30分钟，冷却至室温，过滤，定容至100mL（传统常用提取条件）；（2）加入80mL水，室温超声波超声提取15分钟，8过滤，定容至100mL；（3）加入80mL水，室温超声波超声提取10分钟，过滤，定容至100mL；（4）加入80mL70%的乙醇，室温超声波超声提取15分钟，过滤，定容至100mL。以上样品溶液均用0.45m滤膜过滤，进样10L测定茶氨酸峰面积（每种提取方法设置三个平行样，结果取其平均值），结果如图5所示，试验结果表明：方法3加入80mL水室温超声波超声提取10min能有效快速提取茶叶中茶氨酸。图5提取条件对茶氨酸提取效果的影响Fig5Effectofextractionprocedureontheanine4方法确证4.1线性范围、检测限、定量限精密称取50mg茶氨酸用水溶解，定容至50mL，获得1mgmL茶氨酸母液，依次稀释不同倍数，分别配制成浓度为（10，25，50，100，250，500和1000gmL）7种茶氨酸标准溶液（每个样品设置5个平行样，结果取其平均值），得到回归方程：Y=284889.33+14470.01XR2=0.9983(图6)。结果表明：响应峰面积与浓度都有良好的线性关系。9图6不同浓度标准茶氨酸峰面积曲线Fig6Calibrationcurveeasuringtheanine最低检测限（LOD）和最低定量限（LOQ）分别按公式1和公式2计算，得出茶氨酸的LOD和LOQ分别为0.51和1.56gmL。(1)S3LOD(2)S10LOQ式中代表直线回归曲线截距的标准偏差，S代表直线回归方程的斜率。表1：线性回归方程表Table1:Regressionequtation回归方程相关系数R2线形范围（gmL）最低检测限LOD1)（gmL）最低定量限LOQ1)（gmL）Y=284889.33+14470.01X0.99831010001.560.514.2重现性我们用日内精密度和日间精密度来确定方法的精密性。日内精密度：三天内，每天上下午各测定标准茶氨酸不同浓度样品（50，100，500gmL）三次；日间精密度：三天内同一时间测定标准茶氨酸不同浓度样品（50，100，500gmL）一次，（每个浓度的样品设置平行样三个，结果取其平均值），实验结果采用相对标准偏差法（RSD）分析。结果如表2所示：10表2：不同浓度标准茶氨酸溶液日内精密度和日间精密度值Table2:Intra-andinter-dayprecisionofstanderdtheaninesolution(n=3)浓度（gmL）日内精密度（%）日间精密度（%）50.001.043.24100.001.152.32500.000.351.544.3回收率回收率是在已知含量的茶氨酸（1.25%）茶叶中（准确称取茶样1g），加入不同质量的标准品（5，10，50mg），然后采用图5中方法3进行处理，每个样品平行处理三份，获得的回收率见表3。这些数据表明该方法的回收率令人满意。表3：茶样中添加不同浓度的标准茶氨酸样品后回收率Table3:Recoveryoftheaninefromsamplesspikedwithincreasingconcentrationsofthetheaninestocksolution添加量（gmL）理论值（gmL）检测量（gmL）回收率（%）50.00175.03177.703.43105.34100.00225.03222.653.3897.62500.00625.03610.370.9097.074.4实际样品测定表4：茶叶样品中茶氨酸含量测定结果Table4:TheanineContentinChinesecommercialteasamples(n=3)编号样品名称茶叶类别发酵类型产地含量(%)1涌溪火青绿茶未发酵安徽1.450.052铁观音乌龙茶半发酵福建1.160.083英红红茶全发酵广东0.370.054茯砖茶黑茶后发酵湖南ND1）注：ND:没有检测到Notes1：ND:nodetected.用此方法对绿茶、红茶、乌龙茶和黑茶中的茶氨酸进行实际样品检测，结果见表4。11结果表明：茶氨酸在茶叶加工过程中随着发酵程度的加强，含量逐渐降低。绿茶中茶氨酸保留量最高，红茶下降较为明显，而黑茶在后发酵过程中茶氨酸几乎完全损失。5结论反向离子对色谱法是在反向色谱系统中加入适当的离子对试剂后分离离子性和中性化合物的色谱技术。其方法广泛应用于氨基酸、肽和蛋白质以及其衍生物的分离，可以明显克服这些极性分子在反向色谱中保留值小的问题13。本方法采用常规的紫外检测器便可进行检测，无需特殊检测器。此方法在反相液相色谱中添加离子对试剂PDFOA，色谱的保留得到明显改善，与文献14相比，减少每次进样分析后用乙腈冲洗色谱柱10min，然后用流动相平衡色谱柱约10min，至基线平稳这一步骤，同时可以减轻纯水相对色谱柱造成固相塌陷的影响。该方法样品预处理只需超声提取，过程简单，可用于茶叶和茶叶提取物中茶氨酸的快速检测。参考文献1SakatoY.Studiesonthechemicalconstituentsoftea.PartIII.OnanewamidetheanineJ.NipponNogeikagakuKaishi.194923:262-267.2CasimirJJadotJ.SeparationandcharacterizationofN-ethyl-gamma-glutaminefromXerocomusbadiusJ.Biochimicaetbiophysicaacta.196039:462.3TsushidaTTakeoT.OccurrenceoftheanineinCamelliajaponicaandCamelliasasanquaseedlingsJ.AgriculturalandBiologicalChemistry.198448(11):2861-2862.4AraiMMatsuuraTKakudaT.VariationoftheyieldsandthechemicalcompositioninleavesonnutricultureofteaplantJ.NipponDojoHiryogakuZasshi.198960:157-159.5王泽农.茶叶生物化学M.北京:农业出版社1980:48-56.6Ekborg-OttKHTaylorAArmstrongDW.VarietaldifferencesinthetotalandenantiomericcompositionoftheanineinteaJ.J.Agric.FoodChem.199745(2):353-363.7宛晓春.茶叶生物化学M.北京:中国农业出版社200334-35.8KitoMKokuraHIzakiJetal.TheanineaprecursorofthephloroglucinolnucleusofcatechinsintheteaplantsJ.Phytochemistry.19687(4):599-603.9EschenauerGSweetBV.Pharmacologyandtherapeuticusesoftheanine.J.AmJHealth12SystPharm.200663(1):2628-30.10中国农业科学院茶叶所.茶树生理及茶叶生化实验手册M.北京:农业出版社1983.11高小红章小林袁华.分光光度法测定茶叶中的茶氨酸J.光谱实验室.2005(03).12郭升平.高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸的研究J.色谱.1996(06).13朱松王洪新.OPA柱前衍生高效液相色谱法测定茶氨酸的研究J.食品工业科技.2005(02).14ThippeswamyRGoudaKGRaoDHetal.Determinationoftheanineincommercialteabyliquidchromatographywithfluorescenceanddiodearrayultravioletdetection.J.JAgricFoodChem.200654(19):7014-7019.15MacdonaldATN.Flowinjectionandliquidchromatographydetectorforaminoacidsbasedonapost-columnreactionwithluminolJ.AnalyticalChemistry.198557(4):936-940.16周光明杨光明齐东梅etal.高效液相色谱钴离子催化化学发光抑制法测定茶叶中的茶氨酸J.色谱.2002(06).17PetersonJALorenzLJRisleyDSetal.AminoacidanalysisofpeptidesusingHPLCwithevaporativelightscatteringdetectionJ.JournalofLiquidChromatography&RelatedTechnologies.199922(7):1009-1025.18PetritisKChaimbaultPElfakirCetal.Ion-pairreversed-phaseliquidchromatographyfordeterminationofpolarunderivatizedaminoacidsusingperfluorinatedcarboxylicacidsasionpairingagentJ.JournalofChromatographyA.1999833(2):147-155.19李银花刘仲华黄建安etal.高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定茶叶中茶氨酸J.茶叶科学.2005(03).20朱小兰陈波罗旭彪etal.高效液相色谱法测定茶叶中的茶氨酸J.色谱.2003(04).21施倩陈林张正竹etal.茶叶中L-茶氨酸HPLC-PDAD分析方法的建立J.安徽农业大学学报.200633(3):347-350.22唐仕荣宋慧蒋永红etal.茶氨酸的HPLC快速检测J.中国食品添加剂.2006(04).23施倩陈林张正竹etal.茶叶中L-茶氨酸HPLC-PDAD分析方法的建立J.安徽农13业大学学报.2006(03).24KiehneAEngelhardtU.Thermospray-LC-MSanalysisofvariousgroupsofpolyphenolsinteaJ.ZeitschriftfrLebensmitteluntersuchungund-ForschungA.1996202(1):48-54.25ZhuXChenBMaMetal.Simulta