植物多糖分离纯化方案课件.ppt

植物多糖色谱层析纯化方案,组员： 张莉花 蓝倩茹 于雪涵 郑敏慧 黄欢仪,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,植物多糖,植物多糖，又称植物多聚糖，是植物细胞代谢产生的聚合度超过10个的聚糖。是由许多相同或不同的单糖以一或一糖苷键所组成的化合物，普遍存在于自然界植物体中，包括淀粉、纤维素、多聚糖、果胶等。由于植物多糖的来源广泛，不同种的植物多糖的分子构成及分子量各不相同。有些植物多糖如淀粉、纤维素、果胶，早已成为人们日常生活中的重要组成部分。,多糖的物化性质,分子结构：多糖在溶液状态下有着高级结构，代表活性状态。不同植物提取的多糖， 一级结构上有很太差异，采用酸解、色谱、质谱、红外光谱、核磁共振等手段，可以确定单糖的组成及取代基团。 B. 溶解性：难溶于冷水，在热水或碱液中可溶。不溶于丙酮、乙醇、正丁酵、乙醚、醋 酸乙酯等有机溶剂 C. 热稳定性：热不稳定，当温度大于4O 时，分解加快。 D. 酸碱稳定性：pH小于5时开始降解，小于3时有20 降解；大于7时氧化加快。 E. 化学性质：与硫酸蒽酮、硫酸苯酚反应阳性，常用于定量分析；可与部分有机、无机 离子络合，如与十六烷基三溴化铵(CTAB)、氢氧化钡等结合沉淀,色谱层析,色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，现代生物企业生产过程中的核心技术之一。在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,粗多糖提取,将所用的植物制品粉碎、过筛、烘干 加20倍体积蒸馏水，6080水浴回流提取46 h 离心(5 000g，10 min) 【取两滴上清液，稀释后加入4 ml 01蒽酮硫酸溶液，沸水浴7 min，呈现绿色，说明其中含有糖。再取上清液滴于滤纸上喷025茚三酮试液 ，加热后立即呈紫红色，说明其中含有蛋白质，需要除蛋白。】 取上清，70C减压浓缩 加3倍体积95 乙醇沉淀，至醇含量在80以上，不断搅拌 离心收集沉淀，将沉淀置于布氏漏斗中，分别用无水甲醇、丙醇和乙醚洗涤，以除去水分和杂质 冷冻干燥，得粗多糖,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,植物多糖的提取,多糖不同的植物中，有着不同的含量和贮存位置，因此针对不同的植物有着不同的分离方法。,生物酶提取法,酸碱提法,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,部分沉淀法,溶剂提取法,甲醇分级沉淀法,季铵盐沉淀法,水提法,金属盐沉淀法,水提法,水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。,水提法,加水比对多糖提取的影响,酸碱提法,有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为01molL氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。,生物酶提取法,酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。,金属盐沉淀法,提取液中加入中性醋酸铅可沉淀去除大部分酸性、酚性的杂质（如有机酸、氨基酸、蛋白质、树脂酸、黄酮、蒽醌、鞣质等），包括酸性多糖。而用碱式醋酸铅对多糖的沉淀就更为完全。除去杂质后的母液用H2S脱盐后，单糖、低聚糖和水溶性较大的中性苷类仍保留在滤液中。铅盐沉淀法除去杂质比较完全，母液脱铅后可用于单糖和低聚糖的定量，也可用铜盐沉淀法提取多糖。,季铵盐沉淀法,季铵类氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于分离酸性多糖。季铵氢氧化物与中性多糖不生成沉淀，但当调高PH，使某些OH基解离，或加硼酸缓冲液增高糖的酸度，中性糖也能被沉淀。利用季铵氢氧化物在酸性、中性、微碱性、碱性中分级沉淀可以分离多糖。,甲醇分级沉淀法,常用的分级沉淀法是在混合多糖的浓水溶液中（常在PH=7时），逐步加入乙醇，收集不同醇浓度下析出的沉淀。一般各次沉淀需经反复溶解后，再醇析，直到测得的物理常数恒定，最常用的是旋光度测定和电泳检查。用分级沉淀法得到的多糖，常杂有较多的蛋白质，必须予以去除。一般选择那些使蛋白质沉淀而使多糖不沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必须处理时间短，温度低，避免多糖降解。,2019/11/15,15,可编辑,层析分离纯化,溶于最小体积水中，用Sevage法，5：1氯仿、正丁醇溶液以3OOO rmin离心20min脱蛋白 考马斯亮蓝G-250法，重复五次，直至紫外分析无280mm 、260mm 杂蛋白和核酸吸收峰为止检测至无蛋白质被测出 对流水透析3 d，真空冷冻干燥溶于一定量蒸馏水中，离心(8 000 X g，5 min)，取上清 在阴离子交换纤维素DE52柱(40 cm x25 cm)上层析。先以多于一个柱体积的蒸馏水洗脱，再用04 mol/L NaCI(250 mL250mL)线性梯度洗脱，流速为24 mL/h 收集l管，葸酮一硫酸法检测，得到一水洗脱组分。 收集该组分，蒸馏水透析，冷冻干燥 重复加蒸馏水离心层析，再洗脱透析，冷冻干燥得较纯粗品,在多糖提取物中，常会有无机盐、蛋白质、色素及小分子物质等杂质，必须分别除去一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级,A. 除蛋白 蛋白的分离方法较多，如Sevag法、三氯乙酸沉淀法、ZnS04沉淀法、酶法等。Sevag法为实验常用法，谚法以正丁醇与氯仿按4：l混合，再行革取。蛋白酶除蛋白是目前认为较好方法，将蛋白水解，再透析除去。 B. 脱色 植物多糖提取物中含有酚类化合物而使其颜色较深，可用吸附剂(纤维素、硅藻土、活性炭等)、离子交换柱(DEAE一纤维素)、氧化剂(H2O2)等脱除。活性炭比表面积大，吸附能力强，在进行当归多糖的提取时只向多糖液中加入了01左右的活性炭，煮沸后滤过即完成了脱色操作。此法成本低廉，适合工业化生产。 C. 除小分子杂质 小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖的生物活性，需要进一步脱除，提高纯度。传统的方法是透析法，该法操作简单、技术成熟，但周期长，往往需要2一3天，常温下操作有可能造成多糖的霉变，必要时需加入少量防腐剂或需在低温条件下进行。随着膜分离技术的发展，纤维滤器透析法已经发展起来了，它利用不同孔径的膜使大小不同的分子分级，这种方式可缩短生产周期，而且条件温和，无疑是多糖脱除杂质的一条新途径。,多糖提取物的分离纯化,D. 多糖的分级纯化 采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分级的方法可达到纯化的目的可按溶解性不同进行分级、按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等)，也可按分子所带基团的性质分级 a) 按溶解性不同分离 a.1分步沉淀法 分步沉淀法是根据不同多糖在不同浓度低级醇、酮中具有不同溶解度的性质，从小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分步沉淀 a.2盐析法 盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而将其分离的一种方法。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，其中以硫酸铵最佳。,多糖提取物的分离纯化,b) 柱层析法 b.1凝胶柱层析法 凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。 b.2纤维素阴离子交换剂柱层析法 纤维素阴离子交换剂柱层析法常用的交换剂为DEAE一纤维素和ECTEOLA一纤维素，分类硼砂型和碱型两种，洗脱剂可用不同浓度碱溶液、硼砂溶液、盐溶液，其优点可吸附杂质、纯化多糖，并适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙参多糖、太子参多糖等。 b.3活性炭柱层析法 活性炭吸附量大、效率高，是分离水溶性物质的常用吸附剂。柱层析时活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀释剂，以增加溶液的流速。糖溶液上柱后先用水洗脱无机盐、单糖等再依次增加乙醇浓度进行洗脱。,多糖提取物的分离纯化,色谱法鉴定,凝胶色谱法鉴定纯度 多糖取2mg溶于水，上Sephadex G一200(15 mm X 80 cm)凝胶柱层析，以蒸馏水洗脱，体积流量l ml10 min，按2ml每管分部收集，洗脱液用01蒽酮一硫酸法显色，紫外测定吸光度值，依吸光度对洗脱液体积作图。 纸色谱(PC)初步结构鉴定 酸水解：称取l0mg多糖RP置25 ml具塞试管中，加入6硫酸3ml，封管，在120C烘箱中水解6 h，用CaCO3 中和至中性，过滤，用蒸馏水洗涤滤渣34次，每次35ml，滤液浓缩后点样于层析纸，并用标准单糖葡萄糖、D一半乳糖、D一阿拉伯糖、D一木糖、D一甘露糖作对照，展开剂为乙酸乙酯一啶冰乙酸水(5：5：1：2)，显色剂为苯胺邻苯二甲酸，在1l0 喷雾显色10 min。,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,案例,凝胶渗透色谱法表征广东虫草多糖柱层析分离纯化,广东虫草多糖的制备,广东虫草菌丝体干品,经粉碎、过筛(100 目)后 得菌丝体粉末。称取该粉末 20.0 g,先后用用石油 醚、无水乙醇回流脱脂,所得残渣用超声波辅助 提取其中的水溶性多糖,提取条件为:料液比(g/ mL)120,水浴温度 60 C,提取时间 30 min/次, 提取 3 次。合并提取液,蒸发浓缩后用 717 阴离 子交换树脂脱色,Sevage 法除蛋白(6 次),透析 24 h。之后向多糖透析液中加入无水乙醇,调节醇浓 度(体积分数)为 75%,冰箱中醇沉过夜。醇沉物依 次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤一次,真空干燥 至恒质量,即得广东虫草多糖。,虫草多糖的柱层析分离纯化,柱层析路径 1 分离纯化 CGP 按图 1 所示, 流程对 CGP 进行分离纯化.DEAE Sephadex A-50 装柱(1.6 cm30 cm),0.02 mol/L PBS 平衡后上样 CGP 30 mg,进行洗脱收集,流速 0.3 mL/min,每 15 min 收集一管;Sephadex G-200 装柱(1.6 cm40 cm),0.02 mol/L PBS 平衡后上样 CGP-s1 10 mg, 进一步分离纯化,流速 0.2 mL/min,每 15 min 收 集一管。,柱层析路径 2 分离纯化 CGP,按图 2 所示 流程对 CGP 进行分离纯化。DEAE Cellulose 装柱 (1.6 cm40 cm),0.02 mol/L PBS 平衡后上样 CGP 30 mg,进行洗脱收集。流速 1.0 mL/min,每 10 min 收集一管;用过的 DEAE Sephadex A-50 柱经 再生处理后用 0.02 mol/L PBS 平衡,完毕后上样 CGP-c1 10 mg,进一步分离纯化,流速 0.2 mL/ min,每 15 min 收集一管。,分部收集及多糖含量的测定,采用苯酚- 硫酸法测定每管收集洗脱液的吸光值,并以每管 洗脱液的吸光值为纵坐标,对应的管数为横坐标, 绘制虫草多糖各柱层析过程的虫草多糖洗脱曲线。 根据洗脱曲线合并每个波峰相应波宽长度的洗脱 管数,定容后测定多糖含量。,疑,难,疑,点,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,多糖制备过程中蛋白质的脱除是目前分离纯化多糖的难点。Sevag法需要消耗大量的有机溶剂，且操作烦琐；三氟三氯乙烷的沸点较低(bp56)易挥发，不宜大量应用；三氯乙酸可引起多糖的降解，从而影响其生理活性；酶价格昂贵，不适合工业化生产。可以借鉴其它蛋白质脱除的方法，例如用天然澄清剂能简化提取工艺，提高多糖纯度。 脱色也是多糖提取纯化过程中面临的一个难题。活性炭会吸附多糖而造成多糖的损失；H2O2氧化脱色容易引起有些多糖的降解,我国对多糖的研究起步较晚，但近年来的工作取得了较大的进展，愈来愈多的多糖被发现并证实它们具有复杂、广泛的生物活性和功能随着对多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性机理，功效因子会更加明确，它的应