肺炎链球菌荚膜改良染色法研究.doc

肺炎链球菌荚膜改良染色法研究蒋莲秀，黄光玲，何义，吴丹，钟毓娟*（桂林医学院基础医学实验中心广西桂林541004）摘要：目的探索一种新的细菌荚膜改良染色法，提高细菌荚膜染色质量。方法涂片用A液60水蒸汽蒸染、B液媒染、C液固定脱色、D液复染。结果改良法菌体紫红色，背景浅蓝，荚膜无色透明，涂片背景干净，菌体、荚膜、背景三者对比明显。结论改良法荚膜染色荚膜清晰，菌体与荚膜之间对比明显，方法简便，重复性好，便于批量教学标本制作。关键词：荚膜；染色法；改良荚膜是某些细菌的特殊结构，具有黏附、抗吞噬作用，与细菌的致病性有关，在细菌的鉴定中有重要意义。荚膜的形成主要受遗传因素决定，但也与环境条件有关，如在动物体内和营养丰富（含大量血清和糖）的培养基中容易形成，而在普通培养基上极易消失1。细菌的荚膜染色在微生物学教学实验和某些细菌学诊断中是一种常用的也是较难掌握的染色技术。目前常用的染色法有Hiss、Muir，Olt、湿（干）墨水负染法以及改良染色法等，但这些方法仍然存在染色繁琐、效果不理想等缺点。我们在传统的染色技术的基础上经过多次实验，探讨建立一种新的肺炎球菌荚膜染色法，现报道如下。1材料和方法1.1肺炎链球菌（本室保存菌种）。1.2实验动物小白鼠（本院动物中心清洁级）。1.3荚膜染色液A液（鞭毛染色液）：甲液为5%石炭酸5份，20%饱和钾明矾溶液2份，20%鞣酸2份混合，乙液为碱性复红酒精饱和液1份，甲、乙两液混合过滤后第三天使用；B液：碘液（革兰染色第二液）；C液：20%甲醇；D液：乳酸酚棉兰（石炭酸20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉蓝0.05g，蒸馏水20mL）。1.4荚膜保护液15%葡萄糖溶液9份，无菌灭活兔血清1份，临用时混匀。1.5培养基血清肉汤培养基（普通肉汤培养基，临用时加5-8%的无菌灭活兔血清）。1.6方法1.6.1细菌涂片的制备将肺炎链球菌接种于血清肉汤培养基中，培养24h，以比浊法稀释菌液浓度为3108CFU/ml，取1ml培养物注射于体重约20g小白鼠腹腔内，16h发病后，在濒死的小白鼠腹腔内注射1ml荚膜保护液，轻揉腹部，无菌条件下取腹腔液，再注射至另外健康小白鼠腹腔内，每只0.3ml，连续转种2次，待最后一次小鼠发病时，于小鼠腹腔内注射1ml无菌生理盐水，轻揉腹部2min，最后取腹腔液涂片。1.6.2染色方法涂片先滴加A液60水蒸汽蒸染（60水浴箱）5min，水洗；B液作用5min，水洗；C液作用30s，水洗；D液复染2-5min，水洗，干燥，油镜观察。2.结果背景沉渣较少，肺炎链球菌菌体染成紫红色，菌体外为一无色透明荚膜区，背景浅蓝或浅红（因染色时间不一而不同），菌体、背景、荚膜对比非常明显。3.讨论荚膜的形成使大多数致病菌在动物体内起到保护细菌抵抗吞噬细胞的吞噬和消化作用，使细菌在体内不易被杀灭，因此细菌的荚膜与其致病力有着密切的关系。有文献报道2-3将荚膜保护液直接滴在载玻片上与细菌混合以保护荚膜，但这种方法存在一定的缺点：如血清干燥固定后蛋白质凝固黏附在玻片上，染色背景不干净等。本实验将荚膜保护液注射到小白鼠体内，细菌在大量血清和糖的环境中形成更厚、更明显的荚膜，染色后菌体和荚膜容易分辨，与凌体淑等报道的相一致4。大多数细菌的荚膜是多糖，与一般碱性染料结合力低，不易着色；而且可溶于水、易在用水冲洗时被除去5，因而荚膜染色法是一种较难掌握的特殊染色技术。传统的Hiss、Muir，Olt等染色法，采用酒精灯火焰直接加热，火焰温度过高，温度难以控制且加热过程不稳定，染液易在玻片上干涸附着6；另若加热的温度和时间掌握不好，容易使荚膜破坏和皱褶，在菌体的周围出现残缺及模糊不清的环圈，即出现假荚膜现象7。我们对传统的染色法做了改进，采用鞭毛染色液60水蒸汽蒸染，由于温度适中，没有破坏荚膜结构，无假荚膜现象；另外鞭毛染色液，可增强染液的着色性；碘液媒染，使菌体与媒染剂结合紧密，再滴加20%甲醇起到固定和温和脱色作用；乳酸酚棉兰是真菌孢子的特殊染色剂，能使有荚膜的菌体周围出现一圈无色透明的光圈，菌体、荚膜和背景对比分明，更易于分辨；乳酸酚棉兰中的甘油有保湿封片作用，制片不易干燥，便于长期保存。本文探讨的荚膜染色法，增加了媒染、脱色、复染的步骤，使菌体着色好；荚膜厚而肥大，背景及菌体之间对比鲜明，易于观察；操作过程的每一步骤均有定量指标，适合一次性制作大量教学标本片；本细菌荚膜染色法效果明显、稳定，成功率高，较易掌握，值得在教学、科研、临床中广泛推广。参考文献1周正任主编.医学微生物学M.第六版.北京：人民卫生出版社，2004：132于江，杨靖，曹慧.细菌荚膜染色法的改进J.济宁医学院学报，1993，（1）：43张鹏程.细菌荚膜染色法的改进J.微生物学通报，1984，（2）：834凌体淑，赵世鸿，夏世萍.细菌荚膜染色的创新J.现代检验医学杂志，2004，19（4）：355管远志、王艾玲、李坚主编.医学微生物学实验技术M.2006:186陈文文，张维，沈况敏等.恒温水浴加热染色法检测结核分枝杆菌效果分析J.中外医疗，2011，（16）：727卢嘉，张昌菊.荚膜染色法的改进及与应用J.宜昌医学专科学校学报，1991，18（1）：68基金项目：作者