GB-T19439-2004H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法.pdf

I C S 1 1 . 2 2 0一一B 疡 J中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G B / T 1 9 4 3 9 -2 0 0 4 H 5 亚型禽流感病毒 N A S B A检测方法 P r o t o c o l o f d e t e c t i n g a v i a n i n f l u e n z a v i r u s s u b t y p e H 5 u s i n g N A S B A2 0 0 4 - 0 2 - 1 4 发布2 0 0 4 - 0 2 - 1 5实施 率 督豁臀 撬 嘘 臀 蓬 臀 臀 暴 发 “免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 4 3 9 -2 0 0 4 月 ii胃 高致病性禽流感 由正粘病毒科流感病毒属中 A型流感病毒引起 ， 世界动物卫生组织（ O I E ） 列为 A类疾病 ， 我国将其列为一类动物疫病 。 依赖核酸序列的扩增技术（ N A S B A） 检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当， 并具有检测速度快、 特异性强、 与鸡胚病原分离方法符合率高、 易于操作的特点。 本标准是在综合我国科研成果的基础上， 参考 O I E 诊断试验和疫苗标准手册 ( 2 0 0 0 年版） ， 并结合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感 的相关政策和措施制定的。 本标准附录 A、 附录 B 、 附录 C为规范性附录， 附录 D为资料性附录。 本标准由上海市质量技术监督局和中华人民共和国上海出人境检验检疫局提出。 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位： 中华人民共和国上梅出人境检验检疫局、 上海市质量技术监督局、 香港基因晶片开发有限公司。 本标准起草人 ： 单松华 、 陈家华、 谢燕、 杨锡全 、 倪旦红、 刘乐庭、 刘俊平 。标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 4 3 9 -2 0 0 4 H 5 亚型禽流感病毒N A S B A检测方法1 范围 本标准规定了N A S B A快速检测H5 亚型禽流感病毒技术规范的材料准备、 操作方法和结果判定。 本标准适用于禽类、 禽肉产品中 H5 亚型禽流感病毒的快速检测、 诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有的修改单（ 不包括勘误的内容） 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 1 8 9 3 6 -2 0 0 3 高致病性禽流感诊断技术3 原理 N A S B A ( N u c l e i c a c id s e q u e n c e - b a s e d a m p l i f i c a t io n , N A S B A ， 依赖核酸序列的扩增技术） 是一项连续、 等温、 基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶（ 反转录酶、 核糖核酸酶 H, 噬菌体T 7 核糖核酸聚合酶） 和两条寡核昔酸引物。上游引物5 末端含有噬菌体r 7的依赖于D N A的R N A聚合酶的启动子序列， 下游引物的5 末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列。在扩增步骤中， 两个5 端都整合进扩增序列中， 这样既成为产生互补R N A序列的模板， 又能特异性结合检测步骤中的E C L探针。扩增底物与E C L探针形成复合物， 携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光（ E C L ） 反应。已杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的 R N A 扩增产物总量成比例对应。4 材料准备4 . 1 试验环境 干净的环境， 最好分区。分为核酸提取、 核酸扩增和核酸检测三个区，4 . 2 器材 采用常规的分子生物学器材， 包括： 一次性手套、 移液器（ 量程5 p L 到2 0 0 p L ) 、 枪头、 无R N A酶的1 . 5 m L塑料离心管、 1 . 5 m l . 离心管架、 5 M L试管架、 旋涡振荡器、 计时器、 高速台式离心机、 温度计（ 精度士2 C) 、 加热器 、 水浴锅、 5 m L聚丙烯试管（ V WR ) 、 封 口膜等。 如果采用E C I . 方法， 需要N u c l i S e n s 阅读器或者等同的仪器。 如果采用E L I S A方法， 需要酶标仪。4 . 3 引物 上游引物 A A T T C T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G A G A A G G C C A I A A A G A ( C / T ) A GACC AGC TA 下游引物 G A T G C A A G G T C G C A T AT G A G G A G A G A A G A A G A A A A A A G A G A G G A C4 . 4 检测试剂 所有检测试剂在使用前 ， 使其达到室温。 a ） 裂解缓冲液： 5 m o l / I . 异硫氰酸肛, 1 0 写T r i t o n X - 1 0 0 , 1 0 m m o l / L T r i s - H C 1 , p H 8 . 3 ; b ） 冲洗缓冲液： 5 m o l / I . 异硫氰酸肌， I O m m o l / L T r i s - H C I , p H 8 . 3 ; 0 5 0 0 m g / mI , 硅土： 5 0 0 m g / m l , 盐酸活化的二氧化硅；标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 4 3 9 -2 0 0 4 d ） 洗脱缓冲液： 1 0 m m o l / L T r i s - H C I , p H 8 . 3 ; e ) 酶溶液（ 参见附录A) ; f ) H5 捕捉探针： 1 0 m m o l / L生物素化寡聚核昔酸； 探针序列为 B i o t i n - G C ( A / G ) A G T T C ( C / T ) C T A G C A C T G G C A A T g ） 电化学发光法属别检测探针（ 1 0 m Mg e n e r i c E C L d e t e c t i o n p r o b e ) ： 钉标记的D N A寡聚核 昔酸 ； E C L序 列 为 G A T G C A A G G T C G C A T A T G A G G T G A ( C / T) A A T G A A T G ( C / T )ATG GAA h ） 仪器调试参照液： 1 0 m m o l / l . N A S B A C P ; 1 m m o l / L T r i s - H C I p H 8 . 3 ; 3 m m o l / L N A S B A - E C L; i ) 检测稀释液： 1 5 m m o l/ L T r is - H C 1 , p H 8 . 3 ; ） 分析缓冲液： 5 0 m m o l/ L T r i s - HC 1 , p H 8 . 3 ; 1 X P B S ( 1 3 7 m m o l / L N a C l , 2 . 7 m m o l / L K C I , 1 0 m m o l / L N a t H P O , ， 2 m m o l/ L K HZ P O , ） ； k ） 清洗液 ： 1 0 0 m mo l / L K O H, 1 0 0 o S D S , 1 0 % T r i t o n X - 1 0 0 ; 1 ) 无水乙醇 。4 . 5 样 品采集、 保存、 处理 按 G B / T 1 8 9 3 6 -2 0 0 3中 2 . 1 进行。5 操作方法5 . 1 核酸释放和提取 按以下顺序 ： a ) 将0 . 1 m L 样品加入盛有。 . 9 m L 裂解缓冲液的 管中并振荡混合； b ) 振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加人5 0 p .L ; c ) 振荡混合均匀 ； d ) 室温下温育1 0 mi n ( 每2 m i n 振荡混合一次， 防止硅土沉淀） ， e ） 在 1 2 0 0 0 r / m i n 下离心裂解缓冲液管3 0。 ； f ) 小心移除上清液（ 不要搅动沉淀） 后， 向每个管中加人1 mL冲洗缓冲液； 9 ） 振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止； h ） 在 1 2 0 0 0 r / m i n 下离心3 0 s ， 然后移除上清液； 0 重复第f ) 步到第h ) 步的步骤。依次为一次使用冲洗缓冲液； 两次使用 7 0 乙醇， 最后一次使 用 1 0 0 写乙醇； 1 ） 最后一次洗涤步骤后 ， 用移液器小 L , 移除残余乙醇； k ) 使用加热器在5 6 敞口干燥硅土1 0 m i n ( 用薄纸覆盖每个管避免污染） ； 1 ) 干燥后向每个管加人5 0川J 洗脱缓冲液； m ） 振荡试管直至沉淀物再次重新完全悬浮； n ) 5 6 *C 温育硅土悬浮液 1 0 m i n以洗脱核酸（( 5 min后开始振荡试管） ； 0 ） 在 1 2 0 0 0 r / m i n 下离心 2 mi n ; p ） 将5 f i L核酸上清液转移至新试管， 在1 h内开始扩增反应口 以上步骤也可采用 Q ia g e n或者等同的其他试剂盒进行。5 . 2 核酸扩增 按以下顺序 ： a ) 向上述 5 IA L核酸 5 . 1 p ) 中加人 1 0 u L扩增试剂（ 参见附录 A ) ; b ) 6 5 C温育5 m i n ;标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 GB / T 1 9 4 3 9 -2 0 0 4 c ) 4 1 C温育 5 m i n ; d ) 加入5 j c L酶溶液（ 参见附录B ) ， 并用手指轻轻扣击试管促使混合均匀； e ） 放回试管， 并继续在4 1 0C 温育5 mi n ; f ) 将试管稍作离心后， 在4 1 0C 温育9 0 m i n ; g ） 检测扩增产物； h ） 在一7 0 下保存扩增产物不超过 3 0 d ,5 . 3 核酸检测 按照以下步骤或用 E L I S A进行检测 ： a ) 将（ N - - 2 ) 个5 m L聚丙烯试管进行编号。试管1 一作为空白对照； b ) 振荡混合， 除了试管1 外， 其余试管各加人2 0 It L杂交溶液（ 参见附录C ) ; c ) 试管2中加人5 pi L检测稀释液作为空白对照； d ) 其余试管各加5 p L R N A扩增产物； e ) 封口 膜封住所有试管， 振荡混合； f ） 所有试管 4 1 C温育 3 0 m i n 。每 1 0 m i n 混合一次； 8 ） 除了试管1 外， 其余试管各加入0 . 3 m L分析缓冲液； h ) 振荡仪器调试参照液直至不透明， 然后加0 . 2 5 m L I R S到试管l ; i ) 把试管放在转盘式传送盘的适当位置上； j ） 运行N u c l i S e n s 阅读器， 对数据进行分析和解释（ 参见附录D ) ,6 结果判定 通过大量分析已知阴性对照样品后 ， 确定 N A S B A / E C L的临界值为 0 . 1 5 X仪器参照溶液的数值。样品的读数超过临界值 时， 判为 H 5亚型禽流感病毒阳性 ， 低于临界值时 ， 判为 H5 亚型禽流感病毒阴性 。 1 ) N为样品数。标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB / T 1 9 4 3 9 -2 0 0 4 附录A （ 规范性附录） 扩增试荆的配制A . 1 配制材料 a ） 球状骨针： 单个球状骨针为1 0 m g , 4 m m o l / L N T P , 1 5 m m o l / L D T T, 4 0 m mo l / L Mg C 12 ； b ） 球状骨针稀释剂： 1 0 0 mm o l / L T r i s - HC I p H8 . 3 , 2 m m o l / L d N T P ; c ) 1 0 0 mm o l / L氯化钾溶液 ； d ) 1 0 m m o l / L H 5引物混合物； e ) D E P C水。A . 2 配制过程 a ) 单个球状骨针中加人8 0 川J 球状骨针稀释剂， 并迅速振荡均匀； b ) 稀释的球状骨针中加入1 6 p .L氧化钾溶液和1 4 p t L D E P C水， 振荡均匀； c ) 加人1 0 Ii L H5 引物混合物， 振荡混合； d ) 不能离心； e ） 在 3 0 m i n内使用 。 附录B （ 规范性附录） 酶溶液的配制B . 1 配制材料 a ) 酶球： 单个酶球（ 6 . 5 mg ） 含1 . 3 U / 川. A MV - R T, 0 . 5 U小L R N a s e H, 1 . 3 U / p L T 7 R N A聚合酶， 1 0 0 mm o l / L T r i s - HC 1 ， p H 8 . 3 ， 1 0 % B S A; b ) 酶球稀释剂： 0 . 4 2 p g / r .L B S A.B . 2 酶溶液的制备 a ) 单个酶球中加人 5 5 p L酶稀释液 ， 将此溶液放置室温至少 2 0 m i n ; b ) 用手指轻轻扣击试管让酶球充分溶解； c ) 不能剧烈振荡任何含酶的溶液 ； d ） 使用前 ， 稍作离心； e ） 在 6 0 m i n内使用 。 附录C （ 规范性附录） 杂交溶液的配制C . 1 配制材料 a ) H5 捕捉探针： 1 0 m m o l / l , 生物素化寡聚核昔酸；免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 4 3 9 -2 0 0 4 b ） 电化学发光法属别检测探针（ 1 0 mMg e n e r i c E C L d e t e c t io n p r o b e ) ： 钉标记的D N A寡聚核 昔酸。C . 2 杂交溶液制备 a ) 振荡 H 5 捕捉探针和 E C L探针直到形成不透明溶液。 b ) 对于N次特异性检测反应， 在新试管中混合（ N十2 ) X 1 0 p L H5 捕捉探针和（ N+2 ) X 1 0 ti L E C L探针。 c ) 使用前稍作振荡。 d ） 在6 0 m i n内使用。 附录D （ 资料性附录） N u c l iS e n s 阅读器的操作运行D . 1 建立一个新的运行程序。D . 1 . 1 打开N u c l i S e n s 阅读器的个人电脑。D . 1 . 2 在开始界面点击“ P r ime ” 来执行系统校准。D . 1 . 3 机器准备好后 ， 点击“ S t a r t 。校准步骤大约持续 3 mi n ,D . 1 . 4 在登人（ l o g - in ） 界面的用户名（ u s e r n a m e ） 上选择“ S e r v i c e e n g i n e e r ” 并且点击“ L o g i n 。不需要输人密码。D . 1 . 5 在屏幕左上方选择“ R o u t i n