灵芝制备菌种.doc

灵芝制备菌种菌种是灵芝生产的基础。选用良种是夺取灵芝优质高产的首要环节。一是菌种的遗传性状要好；二是菌种繁育的质量要好。目前生产上广泛使用的是沪芝1号，其表现为适用性广、稳定性好、抗杂菌抗污染能力强、芝大形好、一级品率高、产量较高等特点，是段木栽培灵芝的理想品种。另外，浙江博士园生物技术有限公司选育的BL09、BL11、BL12三个品种也可用作段木灵芝与代料灵芝的主栽品种。除了选育优良菌种外，在培养灵芝的三级菌种中，都要严格把关，注意合理配料，繁育洁白粗壮、生命力强的适龄菌种，为灵芝的优质高产栽培打基础。菌种分级和生产的基本工艺流程：食用菌菌种分为三级，即母种（一级种）、原种（二级种）、栽培种（三级种）。灵芝也不例外。在25C条件下，灵芝母种（亦称一级种、试管种）的培养时间为10天，灵芝原种（亦称二级种）的培养时间为50-60天，灵芝栽培种（亦称三级种）的培养时间为40天。因此，一般在段木接种之前40-60天开始生产灵芝栽培种（三级种）。下面简单介绍灵芝母种、原种与栽培种的制作技术。一、母种的制作母种是采用孢子或组织分离培养获得和保存的灵芝纯菌丝体，并经栽培试验鉴定，具有优良经济性状且相对稳定的试管种。一般芝农可以从科研单位或者菌种保藏机构引进灵芝母种，技术力量较强的生产单位，也可通过组织分离制备灵芝母种。（一）培养基配制（1）培养基配方1、PDA培养基 马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。2、综合马铃薯培养基 马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。3、马铃薯麦麸综合培养基 马铃薯（去皮）200克，麦麸100克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。4、马铃薯酵母粉综合培养基 马铃薯200克，葡萄糖20克，酵母粉4克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。（2）培养基的制作步骤 材料选择准确称量萃取配制定量分装调PH灭菌（121C、30分钟）斜面摆放（培养基长度为试管长度的2/3）。（3）PDA培养基制备方法 称取去皮、切片的马铃薯200克，置于锅内，加入水1000毫升，煮至薯片软而不烂。用4-6层纱布过滤，取滤液。向滤液中加入琼脂20克，继续煮沸至琼脂完全融化，加入葡萄糖20克，补水至1000毫升。趁热分装于试管中，装至试管长度的1/5-1/4，擦净管口，塞上棉塞或者硅橡胶塞。棉塞力求大小规范，松紧适中，不能出现缝隙。然后，在0.11兆帕、121C条件下灭菌30分钟。灭菌后、斜放试管，摆放斜面，使培养基前端蔓延至试管长度1/2，盖上纱布或灭菌的报纸（防冷凝水过多），待培养基凝固（静置24小时）后，取3-5支试管置于30C培养3天，若无杂菌出现，表明灭菌彻底，可供接种用。（二）菌种分离与培养（1）种芝选择 生产中，一般选用无病虫害的6-7分成熟的鲜芝做种芝。种芝表面可经紫外照射消毒、酒精擦拭消毒。（2）组织分离 组织分离之前，先用酒精棉球擦拭种芝的表面，再将菌盖撕开，一分为二。一般选择灵芝菌盖黄白色生长区菌肉组织或者灵芝菌柄上方菌盖中部的菌肉组织为取种部位。组织分离时，可先用无菌手术刀小心切割灵芝菌肉，然后用接种针取5毫米x5毫米的小块菌肉组织，接入试管培养基中上部表面。（3）培养 将上述分离物置于生化培养箱中培养。调温至28-30C，避光培养。经过2-3天，菌肉组织既可开始萌发，出现肉眼可见的菌丝体，并在培养基表面逐渐蔓延。一般7-10天可长满试管斜面。如果分离物（菌肉组织）不到2天就出现肉眼可见的菌丝体，多事杂菌。如果分离物（菌肉组织）培养4天仍为出现肉眼可见的菌丝体，可能是切割灵芝菌肉组织的手术刀或接种针在酒精火焰上方灼烧之后没有充分冷却，或者其它原因导致分离物（菌肉组织）失去活性而不能萌发菌丝体。灵芝菌丝体洁白、纤细、平坦、致密、均匀，随着菌丝的生长、菌落的扩展，接种块处的菌丝逐渐老化形成坚韧的菌皮，并随着菌皮的老化，色泽逐渐变为淡黄色。（4）质量要求 挑选灵芝菌丝体生长整齐，长速正常，菌丝外观饱满，长势旺盛，气生菌丝洁白、纤细、平坦、致密、均匀的分离物作为备用菌种。（三）母种生产过程中的注意事项（1）指定适宜的菌种生产计划，母种在试管长满后可在冰箱中保藏一段时间，但原种和栽培种长满瓶（袋）后要求尽快用于生产。（2）无论是组织分离获得的菌种还是购买的菌种，都要进行栽培试验，符合生产要求的菌种可用于规模化生产。菌种选择有误，将会对生产造成不可估量的损失。（3）进行菌种的组织分离和转管，必须严格遵循无菌操作的有关要求。（4）尽量避免多次转管。在转管过程中可能出现基因突变，使菌种退化，降低菌种的生活里。通常，灵芝母种经过3-4次转管后，就需要重新进行分离复壮，重新进行栽培试验，汰劣存优。二、原种和栽培种的制作灵芝原种是由灵芝母种转接到天然基质（棉籽壳，麦麸等制作的培养料）上经扩大培养而成的菌种，是灵芝菌丝体和天然基质的混合体。原种的作用是用于繁殖栽培种。而灵芝栽培种是由灵芝原种转接到天然培养基上扩大培养的菌种，也是灵芝菌丝体和天然基质的混合体。顾名思义，灵芝栽培种就是用于灵芝栽培的菌种。（一）原种培养基配方阔叶树木屑76千克，麦麸22千克，糖1千克，石膏1千克，水适量（含水量55%-60%）。注（香菇、平菇、金针菇、滑菇、猴头、黑木耳、银耳等都是以木材为生长基质的菌类，它们分解纤维素、木质素的能力较强，可用椴木或木屑作培养料进行栽培。那么，是否所有树种的木屑都可以用来栽培这些食用菌呢？不是的。含有松脂、精油、醇、醚等杀菌物质的松、柏、杉等针叶树以及含有少量芳香性杀菌物质的樟科、安息香料等少数阔叶树种的木屑，一般是不能直接用来栽培食用菌的。一般的阔叶树种如柞、柳、榆、槭、杨、槐、桑、桦、枫、构、椿、栎、桃、梨、苹果、苦楝、悬铃木等的枝条和木屑，都适宜栽培食用菌。近来经过不少单位试验，松、柏、杉等针叶树的木屑只要经过预处理，还是可以用的。预处理的方法是：将经过曝晒23天的新鲜干燥的松、柏、杉等树的木屑盛在容器内，注入沸水浸泡，并加入12的石灰粉拌匀，覆盖旧麻袋保温。浸泡12天，控水后再用清水冲洗，基本上达到无松油味和碱味后，摊在塑料薄膜上晒干，促使木屑中残留的有害物质进一步挥发。然后适量喷水，使含水量达到6070，PH值为77.5，再将四周塑料薄膜卷包盖严，使其发酵。待料温达到6569时，保持23天，然后散开堆料，晾凉后就可使用。也可用堆置发酵的方法，待堆温升高到6070时，维待34天后翻堆，将四周的翻至中间，再发酵一次就可使用。一般松、柏、杉木屑处理后，用于栽培食用菌时，都要加入1020的麸皮或米糠，还要加入12的过磷酸钙） 棉籽壳45千克，阔叶树木屑45千克，麦麸10千克，石膏1千克，尿素0.1千克，水适量（含水量63%左右）。棉籽壳89千克，麦麸或米糠10千克，石膏1千克，水适量（含水量65%左右）。（二）栽培种培养基配方硬杂木屑74%，玉米粉24%，蔗糖1%，石膏粉1%，水适量（含水量55%左右）。硬杂木屑73%，麦麸20%，玉米粉5%，蔗糖1%，石膏粉1%，水适量（含水量55%左右）。硬杂木屑39%，棉籽壳39%，玉米粉20%，蔗糖1%，石膏粉1%，水适量（含水量60%）。棉籽壳83%，玉米粉或麦麸15%，蔗糖1%，石膏粉1%，水适量（含水量65%左右）。花生壳或豆秸78%，麦麸或玉米粉20%，蔗糖1%，石膏粉1%，水适量（含水量65%左右）。玉米芯粉74.5%，麦麸或米糠24.5%，石膏粉0.5%，水适量（含水量65%左右）。（三）原种与栽培种生产工艺流程（1）原种生产工艺流程 配料拌料分装灭菌冷却接种（母种）培养管理质量检验原种。在27-29C下培养25天左右，原种可以长满瓶中培养基（完全吃料）。（2）栽培种生产工艺流程 配料拌料装袋灭菌冷却接种（原种）培养管理质量检验栽培种。在27-29C下培养18-20天，栽培种可以长满袋中培养基（完全吃料）。（四）原种和栽培种生产技术要点（1）配料 参考上述培养基配方，按照廉价易得和节约资源的原则选定原种或栽培种培养基配方。（2）拌料分装 根据当天的生产计划，按照配方比列称料。先将干料（蔗糖除外）搅拌均匀，然后逐步加水（蔗糖溶于水中）继续搅拌，至培养基含水量达到要求时，即可分装。为了保证菌种质量，生产原种（二级种）当用无色或浅色透明的750毫升菌种瓶作为菌种容器。生产灵芝栽培种（三级种）可用15厘米*30厘米*0.055毫米（长*宽*厚度）的PE袋（适于常压灭菌）或者PP袋（可以高压灭菌）作为菌种容器。装瓶时，一边将料灌入瓶中，一边用手捏着瓶颈不断振动，直至将料装至瓶口。用扁形铁钩将表面扒平，压紧到瓶肩处。如装塑料袋则应用力均匀，轻拿轻放，避免塑料袋破损。培养料应上面稍紧，下面稍松，松紧度适当。过紧瓶内空气少，影响菌丝生长，过松虽然发菌快，但菌丝少，且易干缩。洗去瓶口内外残留木屑、麦麸等培养料，稍干后塞上棉塞，或用聚丙烯薄膜和牛皮纸包扎瓶口。料袋可用塑料圈加透气塑料盖封口，或者用封口机封口（类似火腿肠封口技术）。装好料的瓶（袋）称为料瓶（料袋）。（3）灭菌 将料瓶（袋）装入灭菌锅内，灭菌方法有两种：一是高压蒸汽灭菌，二是常压蒸汽灭菌。少量原种、栽培种可以用手提式灭菌锅灭菌，但每次只能灭菌10瓶左右，如果生产大量的原种、栽培种，就要用大型灭菌锅灭菌。常压蒸汽灭菌污染率较高，生产菌种最好使用高压灭菌锅(具体灭菌方法操作，可参考灵芝养生网)。（4）冷却 灭菌后的料瓶（袋）既可以在专用冷却室内冷却，也可以在接种室内冷却。冷却场地必须提前24小时进行消毒处理。当培养料温度下降至30以下（明显低于手心温度时），方可进行接种。而接种之前应进行无菌培养试验，检测灭菌效果。（5）接种 按照无菌操作要求，将母种或原种移接到经过灭菌的培养基上，称为接种。原种和栽培种的接种方法类似，但不同的是原种接入母种，栽培种接入原种。由于打开试管或菌种瓶就可能引起容器内部被环境中其他微生物污染，因此接种的所有操作均应在接种箱（室）或超净工作台进行。接种箱与接种空间应在使用前进行消毒处理。先按每立法米空间用烟雾消毒剂（二氯异氰尿素钠）4克，消毒过夜。在各项接种工作准备完毕后，接种之前4小时，每立方米空间用烟雾消毒剂4克，再进行第二次消毒。在母种接原种时，在无菌条件下，将接种针放在火焰上方充分灼烧、冷却后，在酒精灯火焰附件拔开试管棉塞，钩取一小块带培养基母种，可将母种斜面横切成6-8段，弃去先端，其余每段连同培养基一起接入原种培养基上。原种移接栽培种时，在无菌条件下，将扁形接种钩或接种铲在火焰上方充分灼烧、冷却后，在酒精灯火焰附件拔开试管棉塞，先弃去原种靠近瓶口3厘米左右的表层原种以减少栽培种的杂菌污染。再将适量下层菌种移接到栽培种培养料的表面，一瓶原种可以转接栽培种50-60瓶。虽然料瓶（袋）经过蒸汽灭菌，但是在搬取过程中，瓶（袋）壁上会沾染杂菌，一旦接种时打开料瓶（袋），空气气流和操作人员呼吸气流会传染杂菌，使粘在瓶壁上的杂菌污染料瓶（袋）。因此在接种时要严格无菌操作，接种操作规范、利索，才可能降低污染率，降低成本。当培养料接种后，塞上棉塞或盖上瓶盖，移至恒温室或培养室培养。（6）培养 原种及栽培种接种后置于培养室培养、将接好种的菌瓶（袋）移至恒温室或培养室培养，移动前打扫培养室，保持环境整洁，并提前要消毒处理才能移入菌瓶（袋）。维持培养室温度在25C左右，空气相对湿度为60-70%。避光，坚强通风换气。菌种培养前期，每2-3天严格检查一次，菌丝覆盖培养基表面后，每隔7-10天检查一次。如在瓶壁、聊面或接种块发现红、绿、黄、黑色等孢子，说明有红色链孢霉、青霉、曲霉或根霉等杂菌污染，应予以淘汰，如检查时间间隔过长，杂菌菌