ClC3上调Pgp促进肿瘤耐药的研究-微生物生化药学硕士论文

广东药学院硕士研究生学位论文 广东药学院广东药学院 硕士研究生学位论文硕士研究生学位论文 题目： ClC-3 上调上调 P-gp 促进肿瘤耐促进肿瘤耐 药的研究药的研究 姓 名： 王施思 学 号： 2111240044 院 系： 生命科学与生物制药学院 专 业： 微生物与生化药学 导师姓名： 徐彬（副教授） 二二一五年五月一五年五月 广东药学院硕士研究生学位论文 分类号：分类号：_ 密级密级: _ UDC: _ ClC-3 上调上调 P-gp 促进肿瘤耐药的研究促进肿瘤耐药的研究 ClC-3 promote tumor drug resistance by raising P-gp 姓 名： 王施思 学 号： 2111240044 院 系： 生命科学与生物制药学院 专 业： 微生物与生化药学 研究方向： 肿瘤分子生物学 导师姓名： 徐彬（副教授） 论文提交日期： 2015 年 4 月 论文答辩日期： 2015 年 5 月 学位授予单位： 广东药学院 二二一五年五月一五年五月 广东药学院硕士研究生学位论文 目录目录 中文摘要中文摘要 . I Abstract III 前言前言 1 第一部分第一部分 ClC-3 参与参与肿瘤耐药肿瘤耐药 . 6 1 材料材料 6 1.1 细胞株、质粒及主要试剂 . 6 1.2 Si-ClC-3 序列 . 7 1.3 实验动物 . 7 1.4 主要设备 . 8 2 方法方法 8 2.1 细胞培养 . 8 2.2 Western blot 检测细胞中 ClC-3 蛋白及 P-gp 的表达. 9 2.3 体外转染 Si-ClC-3 11 2.4 体外转染 pcDNA3.1/ClC-3 表达质粒 . 11 2.5 MTT 法检测抗癌药物紫杉醇对细胞增殖的影响 . 11 2.6 双转基因乳腺癌小鼠模型的建立 . 13 2.7 转基因小鼠分组和给药方案 . 14 2.8 数据统计与处理 . 15 3 实验结果实验结果 15 3.1 ClC-3 蛋白和 P-gp 在耐药细胞株中的表达高于非耐药细胞 15 3.2 耐药细胞 ClC-3 表达抑制可增加细胞对抗癌药物的敏感性、非耐药细胞 ClC-3 表达增加可降低细胞对抗癌药物的敏感性 16 3.3 各组小鼠及瘤体的生长情况 . 17 3.3.1 各组小鼠体重、肿瘤生长情况及不同时间点的抑瘤率 18 3.3.2 各组小鼠瘤重、瘤体积、抑瘤率差异 21 3.4 各组小鼠生存期差异 . 23 4 讨论讨论 24 5 小结小结 28 广东药学院硕士研究生学位论文 第二部分第二部分 ClC-3 通过调控通过调控 P-gp 介导介导肿瘤耐药肿瘤耐药 . 28 1 材料材料 29 1.1 荧光定量 PCR 引物序列及主要试剂 . 29 1.2 Si-ClC-3、Si-MDR1 序列 . 29 1.3 实验动物 . 30 2 方法方法 30 2.1 体外转染 Si-ClC-3、Si-MDR1 30 2.2 体外转染 pcDNA3.1/ClC-3 表达质粒、pcDNA3.1/MDR1 表达质粒 30 2.3 免疫荧光检测细胞中 ClC-3 蛋白及 P-gp 的表达 30 2.4 Western blot 检测细胞中 ClC-3 蛋白及 P-gp 的表达 . 31 2.5 Real-Time PCR 检测肿瘤组织中 ClC-3 及 MDR1 mRNA 的表达 32 2.6 Western blot 检测肿瘤组织中 ClC-3 及 P-gp 蛋白的表达 34 2.7 瘤体病理组织学观察 . 34 2.8 免疫组化检测肿瘤组织 ClC-3 蛋白及 P-gp 的表达 34 2.9 数据统计与处理 . 35 3 实验结果实验结果 36 3.1 耐药细胞中 ClC-3 表达抑制可降低 P-gp 的表达，MDR1 表达抑制对 ClC-3 蛋 白的表达无影响 36 3.2 非耐药细胞中 ClC-3 表达增加可提高 P-gp 的表达，MDR1 表达增加对 ClC-3 蛋白的表达无影响 38 3.3 耐药细胞 ClC-3 表达抑制可降低 P-gp 的表达，非耐药细胞 ClC-3 表达增加可 提高 P-gp 的表达 41 3.4 耐药细胞 P-gp 表达抑制及非耐药细胞 P-gp 表达增加对 ClC-3 蛋白的表达无影 响 42 3.5 MMTV-PyMT/CLCN3 双转基因小鼠肿瘤组织中 MDR1 及 ClC-3 mRNA 的表达 都明显高于 MMTV-PyMT 单转基因小鼠 43 3.6 MMTV-PyMT/CLCN3 双转基因小鼠肿瘤组织中多药耐药蛋白 P-gp 及 ClC-3 蛋 白的表达都明显高于 MMTV-PyMT 单转基因小鼠 45 3.7 瘤组织病理学观察 . 46 广东药学院硕士研究生学位论文 3.8 MMTV-PyMT/CLCN3 双转基因小鼠肿瘤组织中 P-gp 及 ClC-3 蛋白的表达都明 显高于 MMTV-PyMT 单转基因小鼠 47 4 讨论讨论 48 5 小结小结 51 全文结全文结论论 52 展望展望 52 References: 53 附录一附录一 硕士期间发表的论文 61 附录二附录二 中英文缩写词对照表 62 致谢致谢 63 广东药学院硕士研究生学位论文 I 中文摘要中文摘要 目的目的： 研究 ClC-3（voltage-gated chloride channel 3）氯通道蛋白在肿瘤耐药中的作用， 确定其是通过调控 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）来介导肿瘤细胞耐药，为 ClC-3 蛋白功能的研究开辟新的方向以及基于逆转肿瘤耐药的肿瘤治疗提供理论依据。 方法方法： Western blot 检测人肺腺癌细胞株 A549 及其紫杉醇耐药株 A549/T 和人乳腺 癌细胞株 MCF-7 及其阿霉素耐药株 MCF-7/ADR 中 ClC-3 蛋白和 P-gp 的表达。 A549/T 和 MCF-7/ADR 细胞转染 ClC-3 小干扰 RNA（Si-ClC-3）抑制 ClC-3 的表 达，A549 和 MCF-7 细胞转染 ClC-3 表达质粒（pcDNA3.1/ClC-3）增强 ClC-3 的表 达，MTT 法检测抗癌药物紫杉醇对 ClC-3 表达干预后细胞增殖的影响。 A549/T 和 MCF-7/ADR 细胞转染 Si-ClC-3，A549 和 MCF-7 细胞转染 pcDNA3.1/ClC-3，细 胞免疫荧光结合激光共聚焦技术和 Western blot 检测 ClC-3 蛋白和 P-gp 的表达水 平。 A549/T 和 MCF-7/ADR 细胞转染多药耐药基因（multi-drug resistance gene 1, MDR1）小干扰 RNA（Si-MDR1）抑制 P-gp 的表达，A549 和 MCF-7 细胞转染 MDR1 表达质粒（pcDNA3.1/MDR1）增强 P-gp 的表达，细胞免疫荧光和 Western blot 检测 P-gp 和 ClC-3 蛋白的表达水平。 繁育 MMTV-PyMT 单转基因小鼠，建 立和繁育 ClC-3 过表达的自发乳腺肿瘤 MMTV-PyMT/CLCN3 双转基因小鼠，给予紫 杉醇和阿霉素化疗干预；紫杉醇化疗方案分为 M-N1（单转基因小鼠给予生理盐 水）、M-PTX（单转基因小鼠给予紫杉醇）、MC-N1（双转基因小鼠给予生理盐 水）和 MC-PTX （双转基因小鼠给予紫杉醇）共 4 组；阿霉素化疗方案分为 M-N2 （单转基因小鼠给予生理盐水）、M-ADM（单转基因小鼠给予阿霉素）、MC-N2 （双转基因小鼠给予生理盐水）和 MC-ADM （双转基因小鼠给予阿霉素）共 4 组；测量小鼠体重、肿瘤重量、肿瘤体积和小鼠生存期。 实时荧光定量 PCR 法 检测肿瘤组织中 MDR1 和 ClC-3 mRNA 的表达； Western blot 和免疫组化法检测肿 瘤组织中 P-gp 及 ClC-3 蛋白的表达。 结果结果： MCF-7/ADR 与 MCF-7 相比，A549/T 与 A549 相比，耐药细胞株 ClC-3 和 P- gp 的表达量明显高于非耐药细胞株。下调 A549/T 和 MCF-7/ADR 细胞 ClC-3 的表 广东药学院硕士研究生学位论文 II 达，紫杉醇对细胞增殖的抑制作用明显增强；增强 A549 和 MCF-7 细胞 ClC-3 的表 达，紫杉醇对细胞增殖的抑制作用明显减弱。抑制 A549/T 和 MCF-7/ADR 细胞 ClC-3 的表达引起 P-gp 的表达下调；增强 A549 和 MCF-7 细胞 ClC-3 的表达则上调 P-gp 的表达。抑制 A549/T 和 MCF-7/ADR 细胞 MDR1 的表达或增强 A549 和 MCF-7 细胞 MDR1 的表达都对 P-gp 的表达水平无明显影响。 MC-N1 和 MC-N2 组肿瘤体积和重量分别显著高于 M-N1 组和 M-N2 组；MC-PTX 组与 M-PTX 组相 比，紫杉醇对肿瘤生长的抑制率降低；MC-ADM 组与 M-ADM 组相比，阿霉素对肿 瘤生长的抑制率降低；紫杉醇治疗可以提高 MMTV-PyMT 单转基因小鼠小鼠生存 率，而对 MMTV-PyMT/CLCN3 双转基因小鼠小鼠生存率无影响。与 MMTV- PyMT 单转基因小鼠相比，MMTV-PyMT/CLCN3 双转基因小鼠 MDR1 mRNA 和 P- gp 表达增加。 结论结论： 肿瘤细胞中 ClC-3 与 P-gp 的表达水平呈正相关，ClC-3 在肿瘤细胞耐药中起着 重要的作用，其介导肿瘤细胞耐药与上调 P-gp 的表达有关 关关键词键词：ClC-3; P-gp; 多药耐药多药耐药; 转基因小鼠转基因小鼠; 肿瘤肿瘤 广东药学院硕士研究生学位论文 III ClC-3 promote tumor drug resistance by raising P-gp Shisi Wang (Microbial and Biochemical Pharmacy) Supervisor: Associate professor XuBin Abstract Objective: To explore the role of ClC-3 (voltage-gated chloride channel 3) in drug-resistant tumor; to set a new direction for researches on ClC-3 and provide theory basis for reverse of drug- resistant tumor treatment, through determination on the fact that the reglation of P- glycoprotein (P-gp) mediates drug-resistant tumor. Methods： (1) Western blot was used to detect ClC-3 and P-gp in human lung adenocarcinoma cell line A549, paclitaxel-resistant cell line A549/T, human breast cancer cell line MCF-7 and adriamycin-resistant cell line MCF-7/ADR. (2) A549 and MCF-7/ADR cells were transfected with ClC-3 small interfering RNA (Si-ClC-3), which inhibited ClC-3 expression; A549 and MCF-7 cells were transfected with ClC-3 expression plasmid (pcDNA3.1/ClC-3), which enhanced ClC-3 expression; MTT assay was used to detect the effects of paclitaxel on proliferation of cells intervened by ClC-3. (3) A549/T and MCF-7/ADR cells were transfected with Si-ClC-3 while A549 and MCF-7 were transfected with pcDNA3.1/ClC-3. Immunofluorescence was combined with laser confocal technology and Western blot to detect ClC-3 and P-gp. (4) A549/T and MCF-7/ADR cells were transfected with multi-drug resistance gene 1 (MDR1) small interfering RNA (Si-MDR1) to inhibit P-gp expression. A549 and MCF-7 cells were transfected with MDR1 expression plasmid (pcDNA3.1/ MDR1) to enhance P-gp expression. Immunofluorescence and Western blot were to detect ClC-3 and P-gp. (5) MMTV-PyMT single transgenic mice were raised. MMTV- PyMT/CLCN3 double transgenic mice with spontaneous breast tumor and overexpression of ClC-3 were established and bred. The mice were given chemotherapy intervention with paclitaxel and adriamycin. According to paclitaxel chemotherapy regimens, the mice were divided into 4 groups, including M-N1 group (single transgenic mice given saline), M-PTX group (single transgenic mice given paclitaxel), MC-N1 group (double transgenic mice given saline) and MC-PTX group (double transgenic mice given paclitaxel); while according to adriamycin chemotherapy regimens, the mice were divided into 4 groups, including M-N2 group (single transgenic mice given saline), M-ADM group (single 广东药学院硕士研究生学位论文 IV transgenic mice given adriamycin), MC-N2 group (double transgenic mice given saline) and MC-ADM (double transgenic mice given adriamycin); the mice were measured for body weight, tumor weight, tumor size and survival period. (6) Real-time PCR was used to detect mRNA expression of MDR1 and ClC-3 in tumor tissues; Western blot and immunohistochemistry were used to detect protein expression of P-gp and ClC-3. Reslts： (1) With regarded to comparison between MCF-7/ADR and MCF-7 as well as between A549/T and A549, expression of ClC-3 and P-gp were obviously higher in drug-resistant cell line than non-resistant cell line. (2) If down-reglateed the expression of ClC-3 in A549/T and MCF-7/ADR cells, the inhibition role of paclitaxel on cell proliferation was obviously increased; while if up-reglateed the expression of ClC-3 in A549 and MCF-7 cells, the inhibition role of paclitaxel on cell proliferation was obviously decreased. (3) Inhibition on the expression of ClC-3 in A549/T and MCF-7/ADR cells leaded to down- reglation of P-gp expression, while enhancement on expression of ClC-3 in A549 and MCF-7 cells leaded to up-reglation of P-gp expression. (4) Inhibition on MDR1 expression in A549/T and MCF-7/ADR cells or enhancement on MDR1 expression in A549 and MCF-7 cells had no obvious effects on P-gp expression. (5) Tumor size and weight of MC-N1 group and MC-N2 group were significantly higher than those of M-N1 group and M-N2 group. For comparison between MC-PTX group and M-PTX group, inhibition rate of paclitaxel on tumor growth was decreased, while for comparison between MC-ADM group and M-ADM group, inhibition rate of adriamycin on tumor growth was also reduced. Paclitaxel treatment improved the survival rate of MMTV-PyMT single transgenic mice, but had no effect on MMTV-PyMT/ CLCN3 double transgenic mice. (6) Compared to MMTV-PyMT single transgenic mice, MDR1 mRNA and P-gp expressions were both increased in MMTV-PyMT/ CLCN3 double transgenic mice. Conclusion： There is a positive correlation between ClC-3 and P-gp expression in tumor cells. ClC- 3 plays an important role in drug resistance of tumor cells. Its medication on drug-resistant tumor cells is related to up-reglation on the expression of P-gp. Keywords: ClC-3; P-gp; multi-drug resistant; transgenic mice; tumor 广东药学院硕士研究生学位论文 1 前言前言 1. 研究背景研究背景 1.1 ClC-3 氯通道蛋白氯通道蛋白 ClC 氯离子通道( ClC chloride channel)是三类氯离子通道中一个家族的总称，共 9 个家族成员，用 ClC-x 命名。ClC-3 是其中家族成员之一，近年来备受关注。ClC- 3 蛋白的推荐名为 H+/Cl- exchange transporter 3，基因符号为 CLCN3，短名为 ClC- 3。ClC-3 氯通道蛋白有 13 个跨膜区域，其 N 末端和 C 末端都位于细胞内，有长短 型之分。短型 ClC-3 蛋白由 760 个氨基酸组成，在其氨基末端加上 58 个氨基酸残基 后便成为长型 ClC-3 氯通道蛋白。广泛分布于脑、肝、肾、心脏、骨骼肌、肾上腺 和胰腺等组织。原位杂交还显示 ClC-3 蛋白在大脑海马区域有高表达1。 研究发现新合成的 ClC-3 蛋白约 75% 是直接运输至胞内囊泡膜上，约 25%是运 输至细胞膜上并随即通过与网格蛋白间的相互作用发生内吞，约 19%是通过内吞转 运至胞内囊泡膜上, 剩余的 6%定位在细胞膜上2 。 位于细胞膜上的氯通道功能之一是调节细胞体积。低渗刺激下，细胞体积膨 胀，位于胞膜上的容积激活性氯离子通道( volume activated chloride channel VACC ) 和容积激活性钾离子通道会开启，质子泵负载的 H+外流导致细胞外 pH 降低使 K+、 C1 外流动力学特征不同，从而使细胞回复原有容积，即调节性细胞容积减少 ( reglatory volume decrease, RVD )。有关学者研究结果显示1,3,4，在等渗条件下，容 积激活性氯电流可通过自分泌/旁分泌 ATP 嘌呤受体途径被激活，参与维护基底细胞 体积，推测 ClC-3 蛋白很可能作为 VACC 的主要成分，具有调节 RVD 的能力，同时 也可能和相关蛋白构成复合物，行使 VACC 的功能。而位于胞内囊泡膜上的氯通道 功能之一是保持膜腔内电中性1。胞内囊泡膜上的 H+ ATPase 可以将胞浆内的 H+泵 到腔内，维持膜腔内较低的 pH，同时膜上的 ClC-3 氯通道开放，使胞浆内的 Cl 内 流到腔内以维持膜腔内的电中性，而 Cl 流动引起的内膜体积膨胀则由 K+外流到胞 浆来调节5-6。因此很多研究表明 ClC-3 蛋白在正常细胞生长和增殖中扮演着重要的 角色。 1.2 肿瘤耐药与肿瘤耐药与 P-gp 恶性肿瘤的治疗已经有一个多世纪的历史。随着手术方案与技术的改善、智能 广东药学院硕士研究生学位论文 2 化精确定位放疗的发展及化疗药物从非特异杀伤到靶向药物的问世，癌症的疗效有 了明显的提高，但是我们不可否认的是，即使是在早期诊断并及时治疗，对于恶性 肿瘤的疗效仍旧不能令人满意7-8。 总的看来，目前癌症的治疗之所以失败除了难以防治癌的转移，就是其耐药性9- 12。有学者认为 90%以上恶性肿瘤患者的死亡在不同程度上与耐药因素有关13 ，使 病人对化疗药物的耐受成为恶性肿瘤治疗的主要障碍，在最近由来自 16 个国家的科 学家合作完成的癌症基因组图谱计划中，对靶向那些突变的药物进行测试时发现： 癌症往往会通过激活不同的基因绕过药物想要阻断的的细胞过程，从而很快产生抗 药性，因此对肿瘤耐药现象的研究具有重要的意义。 近年来研究表明多药耐药（MDR）是一种由化疗药物诱发，而同时对其他多种 结构和作用机制完全不同的药物产生交叉耐药的一种典型的获得性耐药14。根据其 发生机制，主要分为三类：一是多药耐药基因 P-糖蛋白、MRP、LRP 介导的 MDR；二是 DNA 拓扑异构酶活性增高介导的 MDR；三是谷胱甘肽、GST 和金属巯 基解毒酶系统介导的 MDR；而其中由 P-糖蛋白介导的多药耐药是遗传控制的专一解 毒途径，也是目前研究最充分及在 MDR 中最为重要的部分15。 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)，是多药耐药性基因 1(Multidurg Resistance Gene 1, MDR1) 编码的分子量为 170 KD 的胞膜糖蛋白，是 ABC 转运体超家族的一个成 员，主要分布在细胞膜上15。有学者研究认为 P-gp 本身形成单一药物通道，具有药 泵功能，并可在细胞内控制药物浓度，当药物进入细胞后，P-gp 结合药物分子，同 时其 ATP 位点结合 ATP 后释放能量使药物转移到细胞外，也可以直接从细胞膜排除 药物，使细胞内药物浓度始终维持于低水平，细胞由此获得耐药性16-18，其运输药 物的活性受多个位点丝氨酸磷酸化（如 661，667 和 671 位丝氨酸）的调节19-20。 同时，P-gp 也与容积激活性氯通道密切相关21，研究发现：P-gp 有调节容积激 活性氯通道的功能22,23。细胞肿胀后都能激活容积激活性氯电流（Icl,vol），Icl,vol被低 渗所激活后，在去极化时表现为时间和电压依赖性失活，有轻微的外向整流特征 24，也有报道指出蛋白激酶 C 介导的磷酸化可以影响 P-gp 的运输和调节25，通过对 氯离子通道的调节作用，可以增加容积激活性氯通道对渗透压变化的敏感性，并可 缩短通道开放的时间。大量的实验结果提示 P-gp 参与了容积激活性氯通道的调控， 但其调控机制目前尚未明确26-28。 广东药学院硕士研究生学位论文 3 1.3 ClC-3 与肿瘤与肿瘤 近年来研究发现 ClC-3 氯离子通道不仅是正常细胞生长和增殖必不可少的元 件，它在肿瘤细胞的生命活动中也起着重要作用29。有多项研究显示 ClC-3 被检测 到在多种肿瘤细胞中表达异常，并且发现在宫颈癌癌变过程中 ClC-3 氯离子通道的 功能较为活跃，且随细胞分化程度的降低，细胞恶性程度增加，ClC-3 mRNA 表达 越强30；在恶性胶质瘤中 ClC-3 的表达量甚至高出正常脑组织 10 倍31。因此推测， ClC-3 的表达与肿瘤的发生密切相关。 除此之外，ClC-3 在肿瘤细胞发生、凋亡、侵袭转移、增殖等恶性生物学行为方 面也扮演着重要角色32,33。细胞凋亡最显著的特征之一是细胞体积的减小(AVD )， 与 RVD 相似34。氯离子通道阻断剂可通过抑制氯电流，阻滞 AVD 从而保护大鼠肾 上腺髓质嗜铬瘤细胞（PC12）免于 H2O2诱导的细胞凋亡35 ，提示与细胞容积调控 相关的氯离子通道可能参与了肿瘤细胞的凋亡过程；在紫杉醇诱导鼻咽癌 CNE-2Z 细胞凋亡早期的研究36中也同样发现，当下调 ClC-3 表达后，紫杉醇诱导肿瘤细胞 产生的具有明显外向优势且能被氯通道阻断剂抑制的电流明显降低，说明 ClC-3 参 与了紫杉醇诱导的 CNE-2Z 细胞早期凋亡的过程；同时研究37 又发现，抑制 ClC-3 表达可以增加顺铂对人卵巢癌细胞存活率的抑制作用，增加凋亡相关蛋白 cyt-c 和 cleaved Caspase-3 的表达，进一步提示 ClC-3 在细胞凋亡过程中可能通过多途径参与 凋亡的调控。 细胞在迁移的过程中会产生形状的改变和体积减小，离子通道和细胞骨架(肌动 蛋白纤维)分别扮演着重要角色，二者通过相互作用共同调节细胞的整个迁移过程38- 40 。嗜中性粒细胞在机体防御过程中其膜上 ClC-3 通道打开，细胞体积减小，细胞 收缩，进而顺利跨过内皮层而发挥防御功能41。笔者发现当抑制鼻咽癌 CNE-2Z 细 胞和 Hela 细胞中 ClC-3 表达后，容积激活性氯电流和 RVD 也同时被显著性抑制， 细胞迁移率也随之下降42-43，说明 ClC-3 很可能通过调节 RVD 来参与细胞迁移的过 程。 而在 ClC-3 与肿瘤细胞增殖的相关研究中，学者 Cuddapah VA44等人发现一个 哺乳类细胞在分裂为两个子细胞之前会出现形状上的改变，而这种改变是通过细胞 骨架收缩和渗透压调节两者的相互协调完成的，这种改变被证明与容积激活性氯通 道密切相关，而这种氯通道很可能由 ClC-3 蛋白调控，从而引起细胞有丝分裂期间 广东药学院硕士研究生学位论文 4 胞质体积的减少。赵维45等人采用氯通道的阻断剂三氯氧胺（TAM）可有效的抑制 乳腺癌细胞株 MCF-7 的增殖，且 ClC-3 反义核苷酸可以增强这种作用，并随 TAM 浓度的增加，两者之间的协同作用显著性增大。 当然进一步的研究发现 ClC-3 的表达不仅与肿瘤的发生演进密切相关，还可能 参与肿瘤的多药耐药性形成。Weylandt 等人46 研究了 ClC-3 与神经内分泌肿瘤细胞 鬼臼乙叉甙耐药的关系，编码 ClC-3 的质粒转染肿瘤细胞，筛选稳定过表达 ClC-3 的肿瘤细胞进行培养，发现细胞对化疗药物鬼臼乙叉甙的耐药性增强；另外 Su J47 等人用 siRNA 特异性抑制 ClC-3 后发现，胶质瘤细胞 U251 对化疗药物顺铂的敏感 性也显著性增加，提示 ClC-3 在癌细胞的耐药性中可能发挥着重要作用。但具体机 制还尚未阐明。 本课题组在前期的研究中发现 ClC-3 和 MDR1 mRNA 在人肺腺癌紫杉醇耐药细 胞株 A549/T 和人乳腺癌阿霉素耐药细胞株 MCF-7/ADR 中都呈高表达，提示 ClC-3 有可能与肿瘤细胞耐药性形成密切相关。 综上所述，ClC-3 可能是容积激活性氯通道（细胞发生渗透性肿胀时该通道开放 产生氯离子电流）的构成蛋白或该通道的调控者48-50，在细胞容积调节中发挥重要 作用51-52；P-gp 也参与了容积激活性氯通道的调控，二者都与肿瘤细胞耐药相关； 而课题组前期研究中发现 ClC-3 mRNA 的表达与肿瘤细胞耐药也相关，由此我们推 测，ClC-3 与 P-gp 两者之间可能有密切关联，并最终介导了肿瘤的耐药。国内外尚 没有关于 ClC-3 与 P-gp 两者关系的研究报道。因此本论文拟进一步探索 ClC-3 与肿 瘤耐药的相关性，阐明 ClC-3 在肿瘤耐药中的作用以及其是否通过调控 P-gp 介导肿 瘤的耐药，为肿瘤耐药的逆转提供新的靶点和理论依据。 2. 研究目的研究目的 (1) 研究 ClC-3（voltage-gated chloride channel 3）氯通道蛋白与肿瘤耐药的相关 性及在肿瘤耐药中的作用。 (2) 确定 ClC-3 是否通过调控 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）来介导肿瘤耐 药。 (3) 为 ClC-3 蛋白功能的研究开辟新的方向以及基于逆转肿瘤耐药的肿瘤治疗提 供新的靶点和理论依据。 广东药学院硕士研究生学位论文 5 3. 研究思路研究思路 4. 研究内容研究内容 (1) ClC-3 参与肿瘤耐药参与肿瘤耐药 1. ClC-3 蛋白与肿瘤细胞耐药的相关性蛋白与肿瘤细胞耐药的相关性 1.1 人肺腺癌细胞株 A549 及其紫杉醇耐药株 A549/T 和人乳腺癌细胞株 MCF-7 及其阿霉素耐药株 MCF-7/ADR 中 ClC-3 蛋白的表达差异。 1.2 人肺腺癌细胞株 A549 及其紫杉醇耐药株 A549/T 和人乳腺癌细胞株 MCF-7 及其阿霉素耐药株 MCF-7/ADR 中 P-gp 的表达差异。 2. ClC-3 在肿瘤耐药中的作用在肿瘤耐药中的作用 2.1 ClC-3 参与肿瘤细胞耐药：ClC-3 表达质粒（pcDNA3.1/ClC-3）转染非耐药 肿瘤细胞株 A549、MCF-7 以及 ClC-3 SiRNA（Si-ClC-3）转染耐药肿瘤细胞株 A549/T、MCF-7/ADR 后对细胞对化疗药物敏感性的影响。 2.2 ClC-3 参与体内肿瘤耐药：MMTV-PyMT/CLCN3 双转基因小鼠中 ClC-3 高表 达对肿瘤耐药的影响。 (2) ClC-3 通过调控通过调控 P-gp 介导肿瘤耐药介导肿瘤耐药 1. 调控肿瘤细胞耐药调控肿瘤细胞耐药 1.1 耐药细胞株 A549/T、MCF-7/ADR 下调 ClC-3 的表达和非耐药细胞株 广东药学院硕士研究生学位论文 6 A549、MCF-7 上调 ClC-3 的表达对 P-gp 表达的影响。 1.2 耐药细胞株 A549/T、MCF-7/ADR 下调 P-gp 表达和非耐药细胞株 A549、 MCF-7 上调 P-gp 表达对 ClC-3 蛋白表达的影响。 2. 调控体内肿瘤耐药：调控体内肿瘤耐药：MMTV-PyMT/CLCN3 双转基因小鼠中 ClC-3 高表达对 P-gp 表达的影响。 第一部分第一部分 ClC-3 参参与与肿瘤耐药肿瘤耐药 研究已显示53-57电压门控氯离子通道 ClC-3 在多种肿瘤细胞中表达异常，并与 肿瘤的多药耐药相关。 在前期研究结果显示 ClC-3 在人肺腺癌耐药细胞株 A549/T mRNA 水平高表达的 基础上，本研究部分 1）选择了两对细胞株（人肺腺癌细胞株及其紫杉醇耐药株 （A549 与 A549/T、人乳腺癌细胞株及其阿霉素耐药株 MCF-7 与 MCF-7/ADR）作 为研究对象，在蛋白水平观察 ClC-3 蛋白及 P-gp 的表达差异，同时对高表达 ClC-3 的 A549/T、MCF-7/ADR 细胞和低表达 ClC-3 的 A549、MCF-7 细胞，分别应用 RNA 干扰技术设计 Si-ClC-3 沉默 ClC-3 的表达和重组 DNA 技术构建重组质粒 pcDNA3.1/ClC-3 增强 ClC-3 的表达后，观察抗癌药物紫杉醇对 ClC-3 表达干预后细 胞增殖的影响；2）通过模拟人体内的肿瘤生长环境，构建 MMTV-PyMT/CLCN3 双 转基因乳腺癌小鼠模型在动物水平进一步观察 ClC-3 的高表达对乳腺癌小鼠肿瘤多 药耐药的影响，从而探讨 ClC-3 蛋白与肿瘤细胞耐药的相关性以及在肿瘤耐药中的 作用。 1 材料 1.1 细胞株、质粒及主要试剂 人肺腺癌细胞株 A549 及人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株 A549/T 均购自协和医科大 学细胞中心 人乳腺癌细胞株 MCF-7 购于中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院细 胞中心，人乳腺癌阿霉素耐药细胞株 MCF-7/ADR 购于南京凯基生物科技发展有限 广东药学院硕士研究生学位论文 7 公司 pcDNA3.1/ ClC-3 质粒由芝加哥大学 Deborah J. Nelson 教授惠赠 真核表达质粒 pcDNA3.1 为本实验室保存 试剂 公司 RPMI 1640、DMEM 培养基 Gibco 胎牛血清（FBS） Gibco 胰蛋白酶、青霉素和链霉素 天津灏洋生物制品科技有限公司 PMSF、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫 酸胺、TEMED、Tris base 等 广州威佳科技有限公司 小鼠抗人甘油醛-3- 磷酸脱氢酶（GAPDH）单 抗 碧云天生物技术研究所 Western blot ECL 发光试剂盒、蛋白预染 Marker Bio-Rad 兔抗人 P-糖蛋白(P-gp)多抗 GeneTex 辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔或山羊抗 小鼠 IgG 碧云天生物技术研究所 HiPerFect Transfection Reagent QIAGEN X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche 兔抗人 ClC-3 多抗 Abcam 1.2 Si-ClC-3 序列 Si-ClC-3：sense：5-CAAUGGAUUUCCUGUCAUATT- 3 antisense：5-UAUGACAGGAAAUCCAUUGTA- 3 1.3 实验动物 品系为 FVB 的野生型和 FVB/N-Tg(MMTV-PyVT)634 Mul/J 转基因型小鼠购自南 京大学模式动物研究院，CLCN3 转基因小鼠由 Cyagen biosciences 公司构建 广东药学院硕士研究生学位论文 8 1.4 主要设备 设备 公司 倒置相差显微镜 OLYMPUS CKX41/CKX31 日本 荧光显微镜 Olympus 日本 多用途台式高速离心机 Thermo 德国 酶标仪 Bio-Rad 美国 LightCycler480 System Real Time PCR 扩增仪 Roche 瑞士 二氧化碳培养箱 SANYO 日本 超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司 中国 BS 200S 型电子分析天平 Sartorius 德国 电泳仪 Bio-Rad 美国 垂直电泳槽 Bio-Rad 美国 GelDoc 凝胶成像系统（T2-A） Bio-Rad 美国 琼脂糖凝胶电泳仪 Tanon 中国上海 激光共聚焦显微镜 Nikon 日本 2 方法 2.1 细胞培养 用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液(其中含 100U/mL 青霉素和 100g/mL 链 霉素)于 37、5% CO2饱和湿度条件下常规培养，培养体系中加入终浓度为 180ng/mL 的紫杉醇（PTX）及 1000ng/mL 的阿霉素（ADM）以维持细胞 A549/T 及 MCF-7/ADR 的耐药性，0.25%胰蛋白酶消化传代，每两到三天更换一次培养液或传 代。 广东药学院硕士研究生学位论文 9 2.2 Western blot 检测细胞中 ClC-3 蛋白及 P-gp 的表达 1）贴壁细胞蛋白提取： 去掉培养液，预冷 PBS 洗 2-3 次 根据培养体系大小加入适量的裂解液（裂解液：PMSF（100mM）=100:1） 用细胞刮刮下细胞，连同裂解液转移至 1.5mlEP 管，置于冰上冰浴 20min 4，12000 g，离心 15min，上清转移至另一 1.5mlEP 管 取少量进行 BCA 定量，其余按样品：LB=4:1 的比例加入 5 LB，混匀，封好，煮 沸 5min，-80 保存； 2）BCA 蛋白定量： 取 1.2ml 蛋白标准配制液加到蛋白标准（30mg）中，充分溶解 取 20l25mg/ml 蛋白标准加入 980l 稀释液 PBS，配成 0.5mg/ml 蛋白标准 配制相应体积的 BCA 工作液，A:B=50：1，混匀 将 0.5mg/ml 标准品按 0,1,2,4,8,12,16,20l 加到 96 孔板中，加稀释液到 20l 加 1l 样品到孔板中，加 PBS 到 20l 各孔加入 200lBCA 工作液，37，30min 酶标仪 570nm 处读吸光值 A，并绘制标准曲线，计算蛋白样品浓度； 3）SDS-PAGE： 洗净玻璃板、梳子、烧杯等，配制电泳液及电转液 配胶：按比例配 5ml 分离胶/ 3ml 浓缩胶 一块，灌分离胶，加水液封静置约 1h， 将液封水倒掉，滤纸吸干，灌浓缩胶，插梳子，静置约 1h。可按照下面配方配制分 离胶与浓缩胶： 广东药学院硕士研究生学位论文 10 单位：ml，Total： 10% （5ml） 5%（3ml） 1.5mol/L Tris 1.3(PH8.8) 0.38(PH6.8) 30% Gel.sol 1.7 0.5 ddH2O 1.9 2.1 TEMED 0.002 0.003 10%APS 0.05 0.03 10% SDS 0.05 0.03 点样及电泳（浓缩胶 70V 约 30min，分离胶 120V 约 60min）； 4）转膜： 将剥离的胶、滤纸、海绵垫、夹子放入电转 buffer 中浸泡 20min 将膜放在甲醇中活化 2min，然后浸泡于电转 buffer 将夹子打开，一面保持水平，垫一张海绵垫+滤纸+PVDF 膜+胶+滤纸+海绵垫，去 除气泡将夹子放入装有电转 buffer 的转移槽，低温，恒流 350mA 60min ； 5）封闭： 将膜取出移至含有 5%脱脂奶粉的封闭液中，室温，脱色摇床，封闭 2h； 6）洗膜与免疫杂交： 加一抗：将封闭好的膜用 TBST 漂洗一下，沥干，放入盒中，蛋白面朝上，加入 稀释好的 1 抗，4过夜孵育 加二抗：弃去 1 抗，用 TBST 脱色摇床洗 3 次，5min/次，再用 TBS 洗一次，加二 抗，室温，摇床 1h；弃 2 抗，用 TBST 脱色摇床洗 3 次，5min/次，再用 TBS 洗一 次； 7）化学发光、显影、定影： 将两种显色底物 1：1 等体积混合 将发光液加到膜上 1-2 分钟，沥干，在暗室中将 X 光片，覆盖在膜的上面夹好夹 子，曝光 1-10min。 广东药学院硕士研究生学位论文 11 打开夹子，取出 X 光片，迅速浸入显影液及定影液中，用水冲洗后晾干 根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。 扫描胶片，采用 Image J 软件对蛋白条带进行灰度值分析，并计算相对表达水平， 实验重复 3 次。 2.3 体外转染 Si-ClC-3 1）转染前 3-6 小时给细胞换液（无双抗的完全培养基），待单层细胞汇合率为 50%-70%时适宜转染 2）配制转染复合物：无血清培养基稀释 SiRNA 至终浓度为 50nM，轻混，加入 2.25l 转染试剂，涡旋混匀，室温静置 8min（转染体系根据不同实验进行调整） 3）将转染复合物逐滴加入细胞中，轻摇混匀，37, 5%CO2饱和湿度培养箱培 养 48-72 小时，同时设立对照实验。 注：全部使用 RNase Free 的枪头、EP 管、DEPC 水等 2.4 体外转染 pcDNA3.1/ClC-3 表达质粒 1）转染前 3-6 小时给细胞换液（无双抗的完全培养基），待单层细胞汇合率为 70%-90%时适宜转染 2）将转