集成免疫磁珠富集和免疫层析的黄曲霉毒素M1快速检测法.pdf

第 4 2卷 2 0 1 4年 5月 分析化学 ( F E NX I H UA X U E ) 研究报告 Chi n e s e J o ur n a l of An alyt i c a l Ch e mi s t r y 第 5期 6 5 4 6 5 9 DOI：1 0 3 7 2 4 SP J 1 0 9 6 2 0 1 4 3 0 9 0 2 集成免疫磁珠富集和免疫层析 的黄 曲霉毒素 M 快速检 测法 黄艳梅 刘道峰 赖卫华 熊勇华 杨万春 刘 坤 王树颖 ( 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室， 南昌 3 3 0 0 4 7 ) ( 江西中德生物工程有限公司， 南昌 3 3 0 0 4 7 ) 摘要以喷涂了检测抗原黄曲霉毒素 M 一 B S A和驴抗鼠二抗形成检测线和质控线的硝酸纤维膜制备免疫 层析试纸条， 采用 E D C N HS 法制备偶联 了抗黄曲霉毒素 M 单克隆抗体的免疫磁珠。免疫磁珠与待检样本 混合 ， 经捕获、 磁分离后 ， 浓缩重悬液直接用免疫层析试纸条检测， 首次建立了集浓缩样本与免疫层析于一体 的黄曲霉毒素 M 快速检测法。该方法用于检测原料乳中黄曲霉毒素 M。 ， 检出限为 0 1 g L， 低于我国制定 的黄曲霉毒素 M。 限量标准( 0 5 g L ) ， 与其它真菌毒素和原料乳中常检违法添加物无交叉反应 ， 分析结果 与酶联免疫吸附法( E L I S A) 结果一致。本方法适合现场快速检测原料乳中黄曲霉毒素 M 。 关键词黄曲霉毒素 M。 ； 免疫磁珠 ； 富集； 免疫层析； 原料乳 1 引 言 黄曲霉毒素 M， ( A fl a t o x i n M ， A F M ) 是D $- L 动物摄人污染 了黄 曲霉毒素 B ( A fl a t o x i n B ， A F B ) 的 饲料后在体内代谢的产物 ， 常分泌到乳汁中H J 。A F M 可能存在于原料乳及其他乳制品中 ， 具有高毒性 及致癌性 ， 各国均制定了 A F M 在原料乳及乳制品中残留量的严格标准 ， 美 国F D A_ 2 和我国卫生部 规 定 A F M 限量标准均为 0 5 L 。目前 ， 常用的 A F M 的检测方法主要有薄层色谱法 J 、 荧光分光光度 法 、 高效液相色谱( 质谱) 法 及包括酶联免疫分析 、 免疫层析 、 免疫传感器 。 。 在内的免疫学 检测方法 ， 其 中免疫层析法因快速 、 简便和经济在 A F M 的筛查 中表现出了较强的优势 。 内含 F e ， 0 的纳米磁珠 的表面修饰官能团可与抗体结合构成免疫磁珠 ( I m m u n 0 m a g n e t i c n a n o b e a d s ， I MB s ) ， 可通过外加磁场富集和分离 目的物 l 1 J ， 提高检测方法的灵敏度。纳米磁珠的信号穿透性强 ， 作为免疫层析标记物也逐渐受到关注。Ma r q u i n a等H 以超顺磁核壳型磁珠标记 ， 并通过构建 自旋 阀巨 磁阻传感器来监测信号变化 ， 实现 了对人绒膜促性腺激素的灵敏检测； x u等 采用超顺磁纳米磁珠标 记单克隆抗体对心肌肌钙蛋白I 进行检测， 方法线性范围宽， 磁性信号在 1 4 0 d内无明显衰减； Z h e n g 等 也建立了基于磁l 生 标记物的免疫层析法用于检测鱼过敏原小清蛋白， 方法仅需 2 0 mi n 。然而 ， 以上研究中 检测信号的采集均需稳定和灵敏的读取设备， 限制了磁珠作为层析标记物在快速检测中的应用。 本研究在前期工作 的基础上建立了集成免疫磁珠富集和免疫层析分析的 A F M 的快速筛查法 ， 可用于原料乳中 A F M 的现场检测 。 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 X Y Z 3 0 5 0点膜仪( 美国B i o D o t 公司) ； 紫外一 可见分光光度计( 上海棱光技术有限公司) ； 硝酸纤维 膜( N C膜) 、 结合垫( 美国 G E H e a l t h c a r e集团 ) ； 样本垫、 吸水纸及 P V C底板 ( 上海金标生物技术有限 公司) 。 纳米磁珠( P M 3 -0 2 0 ， 上海奥润公司) ； 鼠抗 A F M 单克隆抗体、 A F M 一 B S A ( 江西中德生物工程有限 公司) ； 驴抗鼠二抗( 北京中衫金桥生物技术有限公司) ； 2 吗啉乙磺酸( M E S ) 、 乙基- ( 3 - 二甲基丙基) 碳 2 0 1 3 - 0 9 1 7收稿 ； 2 0 1 4 -01 1 3接受 本文 系国家科技支撑计划 ( N o 2 0 1 1 B A KI O B 0 1 -03 ) 、 江西省主要学科学术和技术带头人培 养计划 ( N o 2 0 1 1 3 BC B 2 2 0 0 7) 和江西 省教育 厅落地项 目( N o K J L D1 3 0 0 9) 项 目资助 E ma i l ：t a l k t o l a i wh 1 6 3 t o m 6 5 6 分 析 化 学 第 4 2 卷 一 一 卜 珠V A n t i - A FM 槌 a n t i b o d y 一。 l 。 图 2 磁富集示意图 F i g 2 S c h e ma t i c o f i mmu n o ma g n e t i c e n r i c h me n t 合在层析系统中稳定地泳动。 由紫外- 可见光扫描图谱 ( 图 4 ) 可知， 不同于单一物质透明溶液的吸收谱线， 免疫磁珠在 2 0 0 5 0 0 n m有较强的带状吸收， 是 由构成免疫磁珠 的多种物质 ( F e 。 0 内核 、 聚合物外壳 、 单克隆抗 体分子 等 ) l 的吸收 、 共振发光 以及致密的磁珠颗粒形成的光散射共同作用的结果。免疫磁珠在 日光下显棕色 ， 且在较低浓度下颜色强度依然可以被裸眼有效地识别 ， 磁珠颜色深度与免疫磁珠浓度呈正相关。 图3 免疫磁珠透射电镜图 F i g 3 T EM i ma g e o fI MB s 3 2 磁珠免疫层析法的灵敏度 图4 不同浓度的免疫磁珠紫外- 可见扫描图谱 F i g 4 UV- VI S s p e c t e r a o f I MB s a t d i ff e r e n t c o n c e n t r a t i o ns 经确 证 为 阴性 的原 料 乳 中添 加不 同浓 度 的 A F M。 标准品 ， 样本与免疫磁珠在离心管中孵育 3 0 mi n后滴人样本垫 ， 结果表明( 图 5 ) ， 阴性原料乳 的 T、 C条带清晰， 随原料乳中 A F M 浓度的升高 ， T线逐渐变淡 。故所构建 的免疫磁珠层 析法能有效显示 原料乳中 A F M 含量的变化并被裸眼准确识别判读 。当原料乳中 A F M 浓度 I0 5 g L时 T线条带消 失， 样本判定为 阳性 ， 因此磁珠免疫层析法的灵敏度为 0 5 g L 。 3 3磁富集- 免疫层析法的灵敏度 当增大受检样本体积 ， 外加磁场富集免疫磁珠及其复合物后 ， 用 P B S缓冲液重悬 ， 免疫层析试 纸条 检测磁珠浓缩样本后的重悬液 ， 结果如图6所示 ， 当 A F M， 浓度 t0 1 g L ， C线条带清晰 ， T线条 带均 消失 ， 样本均显示为阳性 ， A F M 浓度 0 1 g L时 ， 结果为阴性 ， 故磁富集与免疫层析法联用时， 免疫磁 珠的特异性捕获实现了样本 的浓缩 ， 方法的检测灵敏度为 0 1 g L 。 3 4 磁富集- 免疫层析法的准确性 1 6个原料乳样本 ， 分别用磁富集一 免疫层析法和 E L I S A法进行检测 ， 结果表 明( 表 1 ) ， 本方法 应用 于原料乳检测时 ， 与 E L I S A法结果保持一致 ， 未见假阳性及假阴性结果 ， 具有较高的准确性。 6 5 8 分 析 化 学 第 4 2卷 本研究建立了快速检测原料乳 中 A F M 的磁富集- 免疫层析法 ， 方法集样本浓缩和免疫层析 于一 体。原料乳中 0 1 g L A F M 即可检 出， 优于现有报道非机读方式免疫层析法检测 A F M 的检出限 。 磁珠所具有的超顺磁特性使其在没有外加磁场时不具有磁性， 能呈现良好的单分散性， 均匀分布于样本 溶液 中， 充分与待检物接触并结合 ， 外加磁场后磁珠得以捕获 ， 用缓冲液重悬 ， 能有效地去除牛奶样本中 影响检测的蛋 白、 脂肪等 ， 既消除了免疫层析方法检测实际样本时常有 的基质效应又有效地浓缩 了样 本 ， 提高了方法 的检测灵敏度。 磁珠作为层析标记物已有报道 n J ， 但常无浓缩富集过程 ， 且需要专 门的仪器读取结果 ， 本研究利 用磁 珠 的 可见 性 ， 裸 眼判 断 结果 ， 无 需 仪器 ， 更 加 适 合 于基 层应 用。另外 ， 本 研 究 中 的免 疫磁 珠 ( 1 8 0 n m) 单分散性好 ， 可在 N C膜上顺利地泳动。大颗粒的免疫磁珠在 T线聚集更易于被裸眼识别 ， 这 可能是本方法灵敏度高的原 因之一。 Re f e r e nc e s 1 P r a n d i n i A， T a n s i n i G， S i g o l o S ， F i l i p p i L ， L a p o r t a M， P i v a G F o o d C h e mT o x i c o 1 ， 2 0 0 9 ， 4 7 ( 5 ) ： 9 8 4 - 9 9 1 2 Wa n g J J ， L i u B H， Hs u Y T ， Y u F Y Foo d C o n t r o 1 ， 2 0 1 1 ， 2 2 ( 6 ) ： 9 6 4 - 9 6 9 3 Ma x i mu m l e v e l s o f m y c o t o x i n s i n f o o d s N a t i o n a l S t a n d a r d s o f t h e P e o p l e s R e p u b l i c of C h i n a G B 2 7 6 1 - 2 0 1 1 食品中真菌毒索限量中华人民共和国国家标准G B 2 7 6 1 2 0 1 1 4 F a l l a I l A AF 0 o d C o n t r o l ， 2 0 1 0 ， 2 1 ( 1 1 ) ： 1 4 7 8 1 4 8 1 5 H u s s a i n I ， A n w a r J Foo d C o n t r o l ， 2 0 0 8 ，1 9 ( 4 ) ： 3 9 3 - 3 9 5 6 Wa n g Y T ， L i u X B， X i a o C X， Wa n g Z L， Wa n g J G， X i a o H F ，C u i L ，X i a n g Q s ，Y u e T L Foo d C o n t r o l ， 2 0 1 2 ， 2 8 ( 1 ) ： 1 3 1 1 3 4 1 0 1 1 l 2 1 3 1 4 1 5 1 6 X i o n g J L ， Wa n g S P ， Ma M R，I j u J X o d C o n t r o l ， 2 0 1 3 ， 3 4 ( 2 ) ： 7 0 3 - 7 0 6 Z h e n g N，S u n P ， Wang J Q， Z h e n Y P， H a n R W ， X u X MFoo d C o n t r o l ， 2 0 1 3 ， 2 9 ( 1 ) ： 1 9 8 - 2 0 1 S U N C u i P i n g ， WA N Y u P i n g ， WA N G X i a o - D o n g J i l i n A n i m a l H u s b a ndr y a nd V e t e r i n a ry Me d i c i n e ， 2 0 1 3 ，( 3 4 ) 1 ： 1 9 2 1 孙翠萍， 万宇平 ， 王效东吉林畜牧兽医， 2 0 1 3 ，( 3 4 )1 ： 1 9 2 1 B a c h e r G，P a l S，Kan u n g o L，B h an d S S e n s o r A c t u a t B C h e m， 2 0 1 2，1 6 8：2 2 3 2 3 0 Wa n g Z L ， Y u e T L ， Y u a n Y H， C a i R， N i u C， G u o C Foo d R e s I n t ， 2 0 1 3 ， 5 4 ( 1 ) ： 3 0 2 3 1 0 A b r a m s s o n Z e t t e r b e r g L ， C a r l s s o n R， S a n d S Mu t a t R e s G e n T o x E n ， 2 0 1 3 ， 7 5 2 ( 1 - 2 ) ： 8 1 3 Ma r q u i n a C， D e T e r e s a J M， S e r r a t e D，Ma r z o J ，C a r d o s o F A， S a u r e l D Ma g n Ma g n Ma t e r ， 2 0 1 3， 3 2 4 ( 2 1 ) ： 3 4 9 5 -3 4 9 8 X u Q F ，X u H， G u H C， L i J B， Wa n g Y Y， We i MMa t S c i E n g C B io S ， 2 0 0 9 ， 2 9 ( 3 ) ： 7 0 2 7 0 7 Z h e n g C ，Wang X C ，L u Y，L i u YFoo d C o n t r o l ， 2 0 1 2 ， 2 6 ( 2 ) ： 4 4 6 - 4 5 2 C U I Xi ，X I O N G Q i R o n g ，X I O N G Y o n g H u a ，S H A N S h a n ，L A I We i H u a C h i nes e A n a 1 C h e m ， 2 0 1 3 ， 4 1 ( 1 2 ) ： 1 8 1 2 -1 8 1 6 崔 希 ， 熊齐荣，熊勇华 ，山 珊，赖卫华分析化学， 2 0 1 3， 4 1 ( 1 2 ) ：1 8 1 2 1 8 1 6 X I O N G X i a o T h e E s t a b l is h m e n t ofD i r e c t C o m p e t i t i o n E L I S A a nd n o n t o x i c s y s t e m o fA F M1 N ane h ang U n i v e r s i t y ， 2 0 0 7 熊 啸黄曲霉毒素M 直接竞争 E L I S A与无毒体系的建立南昌大学 ， 2 0 0 7 Ra p i d De t e c tio n o f Afla t o x i n M 1 b y I m mun o c h r o m a t o g r a p h y Co m b i ne d wi t h Enr i c h me n t Ba s e d o n I m mu no ma g n e t i c Na no b e a ds HUANG Y an Me i ，L I U Da o F e n g ，LA I W e i - Hu a ，XI ONG Yo n g Hu a ， YAN G W an C h u n ，L I U Ku n ，W ANG S h u - Y i n g ( S t a t e K e y L a b o r a t o ry o fF o o d S c i e n c e a nd T e c h n o l o g y ， N a n c h a ng U n i v e r s i t y ， N a n c h a n g 3 3 0 0 4 7 ，C h i na) ( J i a n g x i Z o d o l a b s B io t e c h C o 1_ t d ， N a neh a n g 3 3 0 0 4 7 ， C h i na )、 Ab s t r a c t I m mu n o c h r o ma t o g r a p h i c s t r i p w a s a s s e mb l e d w i t h c o n j u g a t e p a d ， s a m p l e p a d ， a b s o r b e n t p a d ，a n d 第 5期 黄艳梅等 ： 集成免疫磁珠富集和免疫层析的黄曲霉毒素 M 快速检测法 6 5 9 t h e n i t r o c e l l u l o s e me mb r a n e o n wh i c h a n a t o x i n M1 一 BS A a n d d o n k e y a n t i 。 mo u s e a n t i b o d y wa s s p r a y e d a n d s e r v e d a s t e s t l i n e a n d c o n t r o l l i n e，r e s p e c t i v e l y An t i a fla t o x i n M 1 c o a t e d i mmun o ma g n e t i c n a n o b e a ds wa s s y n t h e s i z e d b y a n ED C NHS me t h o d I mmu n o ma g n e t i c n a n o b e a d s w e r e mi x e d wi t h s a mp l e f o r c a p t u ri n g a n d s e p a r a t i o n T h e e n ric h me n t s a mp l e w a s d e t e c t e d b y i mmu n o c h r o ma t o g r a p h i c s t rip A r a p i d d e t e c t i o n me t h o d o f a f l a t o x i n M 1 c o n t a i n i n g s a mp l e e n ric h me n t a n d i mmu n o c hr o ma t o g r a p h i c a s s a y wa s fir s t l y s e t u p Th e l i mi t o f d e t e c t i o n o f t h i s a s s a y for a fla t o x i n M1 i n r a w mi l k wa s 01 L，wh i c h wa s l o we r t h a n t h e l e g a l l i mi t o f 0 5 g L s e t b y C h i n a N o c r o s s r e a c t i o n s w e r e f o u n d w i t h o t h e r m y c o t o x i n s a n d c o mm o n i l l e g a l a d d i t i v e s Th e r e s u l t o f t he me t h o d wa s i n g o o d a g r e e me n t wi t h t h a t o f ELI S ATh e a s s a y c a n b e a p p l i e d for f a s t d e t e c t i o n o f a fl a t o x i n M1 o n s i t e i n r a w mi l k Ke y wo r d s Afl a t o x i n Ml ；I mmu n o ma g n e t i c n a n o b e a d s ；E n r i c h me n t ；I mmu n o c h r o ma t o gra p h y ；Ra w mi l k ( R e c e i v e d 1 7 S e p t e mb e r 2 0 1 3 ；a c c e p t e d 1 3 J a n u a r y 2 0 1 4 ) T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e N a t i o n a l K e y T e c h n o l o g y S u p p o rt P r o g r a m ( N o 2 0 1 1 B A K 1 0 B 0 1 - 0 3 ) ， t h e J i a n g x i P rov i n c e Ma i n S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y L e a d e r P r o j e c t ( N o 2 0 1 1 3 B C B 2 2 0 0 7 ) ， a n d t h e J i a n g x i E d u c a t i o n B u r e a u T e c h n o l o gy P u t I n t o U s e P re j e c t( N o K J L D1 3 0 0 9) 第三届全国原子光谱及相关技术学术会议 ( 第一轮通知) 由中国仪器仪表学会分析仪器分会原子光谱专业委员会主办 ， 广西师范大学承办的第三届全国原子光谱及相关技 术学术会议定于2 0 1