活体成像技术实验设计与应用介绍.ppt

活体成像技术实验设计与应用介绍,内容简介,一、活体成像技术简介,定义: 活体状态下在细胞和分子水平上应用影像学方法对生物过程进行空间和时间上的定性、定量分析研究的一门科学。,活体成像定义,Dr. Ralph Weissleder,细菌感染模型建立,金黄色葡萄球菌,荧光标记探针靶向细菌,DPA-Cy7,荧光成像在细菌研究中的应用,Leevy, W. M.; Marquez, M.; Piwnica-Worms, D.; Smith, B. D. Bioconjugate Chem.2008,19,686692.,终极方法 无损伤性 直观形象,活体成像的优点,活体成像技术的应用方向,常用活体成像模式,功能成像（荧光）与结构成像（X光）的组合运用,X光成像 Kodak X-Sight 761 overlay,数码X光成像的精确定位 -结构成像与功能成像相结合,Courtesy Dr. B. Bednar , Merck Co. Inc.,数码X光成像的精确定位 -结构成像与功能成像相结合,多模式活体成像,多模式活体成像：成像过程中至少同时采用一种结构成像和一种功能成像的组合成像方式。,结构成像,功能成像,多模式成像,X光 荧光成像 + 生物发光 + 同位素成像,结构成像 功能成像,CT PET+SPECT,例如：,多模式活体成像应用举例 -生物发光、荧光与X光的组合运用,Backer MV, et al., 2007. Vol13(4), April 2007. p504-9.,生物发光、荧光成像和X光成像组合运用的成功范例，已成为肿瘤等研究的经典方法,Nature Medicine,Zhi Yang, Chun Li, Biomacromolecules 2007，8（11）,In111-DTPA-CCPM,多模式活体成像应用举例 -荧光与同位素成像的组合运用,生物发光（ fire），近红外成像（ rainbow ），同位素成像（111In-LS308）,Mol Imaging, 2009. 8(2): p. 101-10,多模式活体成像应用举例 -发光、荧光与同位素成像的共定位,1、荧光成像,标记生物大分子：蛋白、抗体、多肽、核酸； 标记小分子化合物：小分子化合物； 标记细胞：肿瘤细胞、干细胞等； 标记纳米化药剂：脂质体、胶束等； 标记其他纳米材料：金属氧化物等; 标记细菌：各种感染模型; 标记脏器：ICG; 标悍的荧光,荧光成像应用,荧光成像的关键因素穿透率,小鼠不同部位的穿透率,650-850nm是活体成像的核心波段,420 ex / 790 em 440 ex / 790 em 460 ex /790 em 480 ex / 790 em 520ex / 790 em 540 ex / 790 em 570 ex / 790 em 590 ex / 790 em 600 ex /790 em 610 ex / 790 em 620 ex / 790 em 630 ex / 790 em 650 ex / 790 em 670 ex / 790 em 690 ex / 790 em 700 ex / 790 em 710 ex / 790 em 720 ex / 790 em 730 ex / 790 em White Light X-Ray,波长对背景噪音的影响,近红外成像-荧光成像的最佳选择,不同波长激光笔对大拇指的透光实验,定义： 生物发光是荧光素酶（Luciferase）以荧光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2为底物，在Mg 2存在时发生酶促反应中产生光子的过程。 荧光素+ ATP+ O2核黄素磷酸盐+醛化合物 核黄素磷酸盐+醛化合物激发的络合物 激发的络合物氧化核黄素磷酸盐+酸+水+光子 化学能光能,2、生物发光,生物发光的应用,细胞或细菌标记：肿瘤细胞、干细胞等记； 最新技术：生物发光与荧光蛋白双标 基因表达：以融合蛋白的方式标记内源性蛋白，研究基因表达情况； 蛋白相互作用：将荧光素酶基因分为两个片段，分别与要研究的两个蛋白融合表达，两种蛋白相互靠近后产生发光。,3、X-Ray 成像,Binning 1 x 1, Acq. Time 100 s,Bone/Soft Tissue,二、活体成像实验设计,活体成像实验设计,实验设计理论方面： 成像模式的选择：结构成像与功能成像组合 不同研究水平的相互组合：活体、离体、分子水平 实验设计实践方面： 染料的选择：类型、波长 标记方法的选择：共价键、非共价键、脂质体 荧光单一波长与多光谱分析选择: 近红外 荧光素酶基因标记的细胞株,不同研究水平的相互组合,三个水平一致的数据，才是更加真实有效的数据。,活体水平 离体脏器水平,细胞分子水平,近红外荧光染料举例,报告基因的选择,注：荧光蛋白的信息来源于,注射麻醉： 腹腔注射：如戊巴比妥钠（1%，7 L/g） 气体麻醉： 小动物麻醉机：如异氟烷（2-5%）,动物麻醉方式的选择,注意事项： 小动物麻醉程度适度：麻醉过深加大死亡概率、剂量不足会出现抽搐 反复麻醉易导致死亡；注意麻醉动物的保温 小动物存在种属和个体差异，不同动物模型使用剂量不同 戊巴比妥等麻醉剂溶液长时间放置容易失去药效。,脱毛方式： 剃刀、电动剃毛器 化学脱毛剂 脱毛剂： 人用脱毛剂-带自发荧光 自配脱毛剂：8% NaS + 30% 无水乙醇 注意事项： 适量涂抹；清洗；适量配备；低温、 避光、密闭保存； 脱毛原因：荧光拍摄时毛发产生背景噪音 并影响光的穿透,脱毛方法的选择,L O G O,底物注射方式：一般通过腹腔注射打入底物(150g/g)，偶尔也可原位注射; 生物发光时间：注射底物约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光；十五分钟后强度达到最高； 发光持续时间：最高点持续约2030分钟后开始衰落，约三小时后发光全部消失； 最佳检测时间：注射后12到25分钟之间; 麻醉时间：发光底物注射后7-8min开始麻醉;,生物发光成像时间点的选择,L O G O,文献检索染料的激发发射波长和特点 体外用多光谱拍摄模式寻找最佳激发发射波长和最适浓度。使用黑色底透板拍摄（costar，货号3603），EP管对结果有一定影响 体外数据作为参考，在体拍摄预实验也要用多广谱拍摄再优化一下拍摄参数（光的穿透和背景噪音等的影响）,荧光成像实验的注意事项,预实验的重要性,一、预实验前的工作： 动物模型的建立：荷瘤模型、疾病模型 仪器兼容性：配套滤光片 待用的试剂和耗材：麻醉剂、脱毛膏、注射器、手术工具等 二、预实验中的工作： 了解动物：动物模型、荧光背景、麻醉、脱毛等 了解标记物：如荧光及发光强度、纯度、浓度 了解自己的实验操作能力：尾静脉注射 了解仪器：拍摄参数确定和程序设置 了解拍摄时间点：研究对象体内半衰期,L O G O,注意对照的选择，特别是自身对照（给药前拍一下本底）和阴性对照，有条件的还要设置阳性对照 Protocol拍摄后应立即简单做一下叠加，以免动物小幅度爬动影响图像的叠加 动物有可能会排泄，所以看到明显的杂信号时，最好在那个部位用酒精等擦拭一下 拍摄不同脏器时，注意多选几个体位 注意离体脏器数据的收集，必要时固定、切片,正式实验的注意事项,三、活体成像应用举例,荧光成像在纳米材料研究的应用,Medarova Z, et al., 2007. Vol13(3), March 2007. p372-7.,纳米材料介导的肿瘤药物主动靶向,肿瘤药物靶向性实验,肿瘤药物注射11h时生物发光、荧光与X光图像叠加 。,肿瘤药物靶向实体瘤实验 -生物发光、荧光和X光成像三重叠加,Zeng et al. Cancer Research, 2006, 9566-9575,红色荧光蛋白RFP标记的前列腺癌,生物发光在乳腺癌研究中的应用,X光成像,生物发光叠加X光,生物发光在肝癌研究中的作