杭太俊药物分析抗生素类药物的分析描述.ppt

药物分析,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicines,主讲: 曾金祥,Analysis of antibiotics,第十一章 抗生素类 药物的分析,药物分析教研室,Company Logo,Contents,Company Logo,第一节 概述,1.抗生素（antibiotics） 在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称,Company Logo,第一节 概述,3.来源,生物合成（发酵） 化学合成或半合成,4.特点,化学纯度较低 活性组分易发生变异 稳定性差,Company Logo,第一节 概述,5.抗生素质量分析生物学法、物理化学法,鉴别：理化方法、微生物法 检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等 含量/效价测定： 微生物法 ： 与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大 理化方法：准确度与专属性较高, 且操作简便；但与临床疗效有偏差,Company Logo,第二节 内酰胺类,青霉素(苄青霉素) (penicillins),氨苄西林,阿莫西林,Company Logo,第二节 内酰胺类,头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,Company Logo,第二节 内酰胺类,氢化噻唑环,氢化噻嗪环,Company Logo,第二节 内酰胺类,一、结构与性质,1.酸性（羧基） pKa 2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。,Company Logo,第二节 内酰胺类,2.手性C （旋光性）,3.UV,青霉素类：苯环取代基 头孢菌素类：母核有共轭结构,260nm,Company Logo,4. 内酰胺环(四元环张力+酰胺键 ),第二节 内酰胺类,干燥条件较稳定，溶液不稳定,某些氧化剂、金属离子、温度,Company Logo,第二节 内酰胺类,二、Identification,Company Logo,第二节 内酰胺类,Company Logo,第二节 内酰胺类,Company Logo,第二节 内酰胺类,头孢利定的NMR鉴别法(JP14),取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示 3.8 附近 6.97.5 7.99.0 单峰信号 多重峰信号 多重峰信号 2 ： 3 ： 5,Company Logo,第二节 内酰胺类,(三)呈色反应,1）羟肟酸铁反应内酰胺环,2）茚三酮反应-氨基,Company Logo,第二节 内酰胺类,3）双缩脲反应内酰胺类,Company Logo,第二节 内酰胺类,4）变色酸-硫酸反应,5）重氮苯磺酸反应酚羟基,（偶合）,6）铜盐反应头孢氨苄的专属反应,Company Logo,7）硫酸-甲醛反应(BP),第二节 内酰胺类,青霉素钾和青霉素钠呈红棕色,(四)焰色反应K+、Na+,三、Purity Test(聚合物、有关物质、异构体等),1.聚合物,头孢他啶中聚合物测定,Company Logo,第二节 内酰胺类,色谱条件与系统适用性试验 用葡聚糖凝胶G-10（40120m）为填充剂，玻璃柱内径1.31.6cm，床体积5060ml；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠0.54g，加水100ml使溶解，调节pH至7.0），流动相B为水；流速为0.8ml/min；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液进样200l进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.751.5。两种流动相系统中蓝色葡聚糖的保留时间比应在0.931.07之间。对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200l，峰面积值的相对标准差应小于5.0%。,对照品溶液的制备 取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含头孢他啶100g的溶液，摇匀,Company Logo,第二节 内酰胺类,测定法 取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含头孢他啶20mg的溶液，立即进样200l，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200l注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%,主成分自身对照法 面积归一化法 限量法 自身对照外标法,Company Logo,萄聚糖凝胶 立体网状结构图,原理“分子筛”,第二节 内酰胺类,Company Logo,第二节 内酰胺类,2.有关物质与异构体,头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查,色谱条件与系统适用性试验：ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）为流动相，流速1ml/min；检测波长278 nm。要求头孢呋辛酯A，B异构体之间，头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯2-异构体之间的分离度应大于1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500,异构体 取本品适量，配制成每1ml中约含0.25mg的溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。B异构体峰的相对保留时间约为0.85，A异构体峰的相对保留时间为1.0。,Company Logo,第二节 内酰胺类,供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.480.55。,B,A,3-,E,E,Company Logo,第二节 内酰胺类,有关物质,取本品适量，精密称定，加流动相制成约含0.25mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成2.5 g/ml的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，其中E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)，3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1.5%)，其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。(供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计),Company Logo,3.UV,第二节 内酰胺类,4.有机溶剂,5.结晶性,四、Assay,碘量法 汞量法 酸碱滴定法 羟肟酸比色法 HPLC法,Company Logo,第二节 内酰胺类,阿莫西林克拉维酸钾片,色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.40.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5,测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。,Company Logo,第二节 内酰胺类,Company Logo,第三节 氨基糖苷类,氨基环醇+氨基糖苷,链霉素 (Streptomycin),Company Logo,第三节 氨基糖苷类,巴龙霉素 (paromomycin),D-葡萄糖胺 脱氧链霉胺,巴龙胺,D核糖 巴龙霉糖,巴龙二糖胺,Company Logo,第三节 氨基糖苷类,庆大霉素 (gentamycin),绛红糖胺,(紫素胺),2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺),Company Logo,第三节 氨基糖苷类,一、结构与性质,1）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐 2）溶解度（氨基、羟基）：水溶性 3）旋光性（糖）：多个手性碳 4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解,Company Logo,二、Identification,第三节 氨基糖苷类,坂口反应,麦芽酚反应,N-甲基葡萄 糖胺反应,Company Logo,第三节 氨基糖苷类,1.茚三酮反应羟基胺类,-氨基酸,2. Molisch 试验 五碳糖或六碳糖结构,Company Logo,第三节 氨基糖苷类,蓝紫色,3. N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）,红色,Company Logo,第三节 氨基糖苷类,乙酰丙酮,OH-,Company Logo,第三节 氨基糖苷类,4.麦芽酚反应链霉糖特有反应,H+,5.坂口反应链霉胍特有反应,6.硫酸盐反应,Company Logo,7.色谱法 8.光谱法,第三节 氨基糖苷类,三、Purity Test,1.链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查,来源：发酵中产生,方法：TLC中的对照品法,2.硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC),3.庆大霉素C组分的测定,Company Logo,第三节 氨基糖苷类,色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水冰醋酸甲醇(25:5:70) 配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相（必要时调节甲醇的含量）；检测波长为330nm 。理论板数按C2组分峰计算应不低于2000。C2a 峰和C2峰的分离 度应符合要求。 测定法 取本品适量，精密称定，加水制成每1ml 中含0.65mg的溶液，精密量取4.0 ml，置10ml量瓶中，加异丙醇2ml与邻苯二醛试液1.6ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，置60水浴中加热15分钟，冷却，滤过，取续滤液10l 注入液相色谱仪，记录色谱图； 另取庆大霉素标准品，同法测定。C组分的保留时间依次为：C1、C1a、C2a、C2。量取C1、C1a、C2a、C2的峰面积。 C1应为2550，C1a应为1540，C2aC2应为2050 。,Company Logo,第三节 氨基糖苷类,庆大霉素无紫外吸收，需进行衍生化处理后再进行HPLC测定。,max = 330nm,Company Logo,讨论,第三节 氨基糖苷类,1、柱效：以C2峰计算，理论板数应不低于2000，在此柱效下各组分之间才能达到规定的分离度。为此色谱柱做适当选择。 2、流动相：流动相极性适当控制(适当调节甲醇的比例)。 极性过强，出峰快，分离不佳。C1峰与衍生试剂等杂质峰难分析;极性过弱，出峰太慢。实验表明，C2峰的保留时间控制在20min30min较为适宜。 3、衍生化试剂与衍生物的稳定性：配制后不能久置，时间久了试剂峰峰高增加并影响组分测定，一般避光保存可使用三天。生成的衍生物不稳定。 4、离子对试剂浓度影响：离子对试剂浓度对庆大霉素OPA衍生物保留值有影响。,Company Logo,第三节 氨基糖苷类,BP(2005)HPLC-ECD Ch.PHPLC-ELSD,4.硫酸盐测定EDTA滴定,四、Assay,微生物检定法 HPLC法,Company Logo,第四节 四环素类,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,Company Logo,一、结构与性质,第四节 四环素类,1）两性： -OH酸性 N(CH3)2碱性,Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；Fe3+形成红色配合物； Al3+形成黄色配合物 ；pH3 7.5 多价阳离子与酚二酮荧光,与酸、碱均可成盐； 临床多用盐酸盐； 强酸或强碱中溶解度,2）旋光性 3）UV和荧光 4）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基),Company Logo,弱酸性（pH2-6） A环C-4异构化 差向四环素 酸性（pH 2） C环脱水 脱水四环素 碱性 C环开环，形成内酯 异四环素,5）不稳定性,第四节 四环素类,A.差向异构化,蓝色荧光,淡黄黑,Company Logo,第四节 四环素类,（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）,Company Logo,第四节 四环素类,B.酸性脱水降解,max = 445nm,max = 435nm,Company Logo,C.碱性脱水降解,第四节 四环素类,OH-,Company Logo,第四节 四环素类,二、Identification,1、HPLC,2、TLC (正相分配薄层色谱),EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象,3、IR,4、UV,5、显色法,Company Logo,第四节 四环素类,三、Purity Test,1.有关物质HPLC,2.杂质吸光度UV,268nm,355nm,Company Logo,第五节、高分子杂质的检查,生产过程 贮存过程 使用不当,发酵过程,控制重点,Company Logo,第五节、高分子杂质的检查,1.基本结构,Company Logo,第五节、高分子杂质的检查,2.特点,（1）发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片均可带入产品中，相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子，形成青霉素噻唑多肽类杂质。 （2）有不同聚合度和不同机理聚合反应形成的聚合物，聚合物发生不同程度的降解作用。 （3）以异构体存在样品，同聚和异聚反应可同时发生。 （4）高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关（溶媒结晶、喷雾干燥）,Company Logo,第五节、高分子杂质的检查,3.杂质控制方法,反相高效液相、离子交换色谱和凝胶色谱。 葡聚糖凝胶SephadexC10,自身对照外标法,Thank You !,Company Logo,青霉素的降解反应,Company Logo,Company Logo,1. 熟悉抗生素类药物分析的特点及其 常规检验项目。了解抗生素类药物 的分析现状，熟悉生物学法与物理 化学法测定效价的原理及优缺点。 2. 掌握内酰胺类抗生素的结构、 性质、鉴别及含量测定。,第十一章 复习内容,Company Logo,3. 掌握氨基糖苷类抗生素的结构、性 质及鉴别，了解其检查及含量测定 4. 掌握四环素类抗生素的结构及性质，了解其鉴别、检查及含量测定 5. 了解抗生素类药物的质量考察方法,Company Logo,99：89下列哪个药物会发生羟肟酸 铁反应 A. 青霉素 B. 庆大霉素 C. 红霉素 D. 链霉素 E. 维生素C,Company Logo,99m：71中国药典(2005年版)测定头 孢菌素类药物的含量时，多 数采用的方法是 A. 微生物法 B. 碘量法 C. 汞量法 D. 正相高效液相色谱法 E. 反相高效液相色谱法,Company Logo,95：139属于-内酰胺类的抗生素药 物有 A. 青霉素 B. 红霉素 C. 头孢菌素 D. 庆大霉素 E. 四环素,Company Logo,45能和茚三