GB-T5009.85-2003食品中核黄素的测定.pdf

I CS 6 7 . 0 4 0C 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B / T 5 0 0 9 . 8 5 -2 0 0 3 代替 （ 1 B / I - 1 2 3 9 1 -1 9 9 0食 品 中 核 黄 素 的 测 定De t e r mi n a t i o n o f r i b o f l a v i n i n f o o d s2 0 0 3 - 0 8 - 1 1 发布2 0 0 4 - 0 1 - 0 1实施华 人 民 共 和 国 卫 生国 国 家 标 准 化 管 理 委 员部2卜窝发 布中中免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 8 5 -2 0 0 3前 ， ， 曰本标准第一法对应于 A O A ( 4 5 . 1 0 8 ( 食物和维生素制品中核黄素的荧光测定法 ( 1 9 9 5 年版） 。本标准与 A O A C 4 5 . 1 . 0 8的一致性程度为非等效。本标准代替 G B / T 1 2 3 9 1 -1 9 9 0 食物中核黄素的测定方法本标准与 G B / T 1 2 3 9 1 -1 9 9 0 相 比主要修改如下：一 一 修改了标准的中文名称， 标准中文名称改为 食品中核黄素的测定 ；按G B / T 2 0 0 0 1 . 4 -2 0 0 1 标准编写规则第 4部分： 化学分析方法 对原标准的结构进行 了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归日。本标准起草单位： 中国预防医学科学院营养 与 食 品卫生研究所。本标准主要起草人： 王光亚、 曲宁、 李晶、 周瑞华 、 王竹。原标准于 1 9 9 0 年首次发布， 本次为第一次修订 。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载. e 卜 口问，4晓比七目巨人人本标准规定了食品中核黄素含量的il l本标准适用于各类食品中核黄素的A术古 件X 出用 蒂齐 件 女 n n n fi， ， 口 ， 全定方法 微生物法和荧定 。11 J 卜口 J 2 、3 试剂q 1 x # a-盯3M 相！ Fn 曰 1（3 . 2 2 . 5 m o l / I ， 乙酸钠溶液。3 . 3 木瓜蛋 白酶( 1 0 0 g / L J： 用 2 . 5 m o l / I , 乙酸钠溶液配制。使月I d n m Au i n n a/ T、 田 2 , mnl / T 7. f W !q访 A ? 4H1沛 田 R 1 Tr I3 . 5 0 . 1 mo l / L盐酸。3 . 6 1 m o l/ L氢氧化伯3 7 n 1 mn l / T 誉 翁 ti8 低亚硫酸钠溶液（ 2 0 0 g / L ) ： 此液q件日 0访。 丙酮斗 nk 7 邢丰甭 （只斗 夕3 . 1 0 嗅 甲酚绿指示剂（( 0 .4 1 1富 坛 破 翩 应 访 n 。3 . 1 2 过氧化氢溶液（ 3 %) 03 . 1 3 核黄素标准液的配制（ 纯度 9 8 %)3 . 1 3 . 1 核黄素标准储备液（ 2 5 j g / mI . ) ： 将标准品核黄素粉状结晶置于真空千燥器或盛有硫酸的干器中。经过 2 4 h 后 ， 准确称取 5 0 m g ， 置于 2 1 , 容量瓶中， 加人 2 . 4 ml , 冰乙酸和 1 . 5 L水。将容量瓶于温水 中摇动， 待其溶解， 冷至室温， 稀释至 2 1 , ， 移至棕色瓶 内， 加少许 甲苯盖于溶液表面， 于冰箱保存。3 . 1 3 . 2 核黄素标准使用液 ： 吸取 2 . 0 0 m 1 . 核黄素标准储备液， 置于 5 0 mL棕色容量瓶 中， 用水稀释kll 磨僻 齐 6 Y - 干 4 0 C r ) k 箱 7 樱 在 一 周i H , s A ff & 补 粕 当 干 1 0 0， ， 。林 昔 责 4 仪 器4 . 1 实验室常用设备4 . 2 高压消毒锅 。A 1 04利 + 百 ; 口+ 26 , 掉 4 合免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 8 5 -2 0 0 34 . 4 核黄素吸附柱 ： 见图5 0m1日已0公 8m m图 1核黄素吸附柱4 . 5 荧光分光光度计 。5 分析步骤 整个操作过程需避光进行。5 . 1 试样提取5 . 1 . 1 试样的水解 准确称取2g -1 0g 样品（ 约含1 0 I C g -2 0 0 11 g 核黄素） 于1 0 0 ml . 角瓶中， 加5 0 mL 0 . 1 m o l / L盐酸， 搅拌直到颗粒物分散均匀。用 4 0 mI . 瓷柑涡为盖扣住瓶口， 置于高压锅内高压水解， 1 0 . 3 X1 0 4 P a 3 0 m i n 。水解液冷却后， 滴加1 M 0 1 / 1 - 氢氧化钠， 取少许水解液， 用0 . 4 g / 1 _ 澳甲酚绿检验呈草绿色， p H为4 . 5 05 1 . 2 试样的酶解5 . 1 . 2 . 1 含有淀粉的水解液： 加人3m L1 0g / l . 淀粉酶溶液， 于3 7 0C -4 0 保温约1 6 h o5 . 1 . 2 . 2 含高蛋白的水解液： 加 3 ml . 1 0 g / l木瓜蛋白酶溶液， 于3 7 C - 4 0 保温约 1 6 h ,5 . 1 3 过滤 t 述酶解液定容至1 0 0 . 0 ml ， 用干滤纸过滤。此提取液在4 冰箱中可保存一周。5 . 2 氧化去杂质 视试样中核黄素的含量取一定体积的试样提取液及核黄素标准使用液（ 约含 1 l .g -1 0 Il g 核黄素）分别于 2 0 mL的带盖刻度试管中， 加水至 1 5 ml - 。各管加 0 . 5 mL冰 乙酸， 混匀。加 3 0 g / I . 高锰 酸钾溶液0 . sm 工 ， 混匀， 放置2 m i n ， 使氧化去杂质。滴加3 双氧水溶液数滴， 直至高锰酸钾的颜色退掉。剧烈振摇此管， 使多余的氧气逸出。5 . 3 核黄素的吸附和洗脱5 . 3 . 1 核黄素吸附柱： 硅镁吸附剂约I g 用湿法装人柱， 占柱长1 / 2 - 2 / 3 （ 约5 c m） 为宜（ 吸附柱下端用一小团脱脂棉垫 1 ) ， 勿使柱内产生气泡 ， 调节流速约为 6 0 滴 m i n ,5 . 3 . 2 过柱 与 洗脱 ： 将全部氧化后的样液及标准 液通过吸附柱后 ， 用约 2 0 m l . 热 水洗 去样液 中的杂质 。然后用 5 . 0 0 n i l ， 洗脱液将试样中核黄素洗脱 并收集 于一带盖 1 0 m l , 刻度试管中， 再用水洗吸附柱 ， 收集洗出之液体并定容至 1 0 m l ， 混匀后待测荧光 。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 8 5 -2 0 0 35 . 4 标准曲线的制备 分别精确吸取核黄素标准使用液0 . 3 . 0 . 6 , 0 . 9 . 1 . 2 5 , 2 . 5 , 5 . 0 , 1 0 . 0 , 2 0 . 0 m l , （ 相当于0 . 3 , 0 . 6 ,0 . 9 , 1 . 2 5 , 2 . 5 , 5 . 0 , 1 0 . 0 , 2 0 . 0 ti g核黄素） 或取与试样含量相近的单点标准按核黄素的吸附和洗脱( 5 . 3 ) 步骤操作。5 . 5 测定5 . 5 . 1 于激发光波长 4 4 0 n m， 发射光波长 5 2 5 n m， 测量试样管及标准管的荧光值。5 . 5 . 2 待试样及标准的荧光值测量后 ， 在各管的剩余液（ 约 5 m l , - 7 m l . ） 中加 0 . 1 ml . 2 0 低亚硫酸钠溶液， 立即混匀， 在 2 0 s 内测出各管的荧光值 ， 作各 自的空白值。6 结果计算见式（ 1 ） 。 （ A 一 B）x S 、 二 、 X 今 书一书 升=x fx （ C一 D） xm J 式 中 ：X一 试样中核黄素的含量， 单位为毫克每百克（ m g / 1 0 0A 一 一 试样管荧光值；B - 一 试样管空 白荧光值：C 标准管荧光值；n 一 标准管空白荧光值 ；f 稀释倍数 ；m 试样质量， 单位为克（ 9 ） ：S 一标准管中核黄素质量， 单位为微克（ lo g ) 1 0 01 0 00（1）9 ） ； 1 0 01 0 0 0将试样中核黄素含量由微克每克（ f i g / g ） 换算成毫克每百克（ m g / 1 0 0 g ) 的系数。计算结果表示到小数点后两位。精密 度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均镇的 1 0 %a第二法微生物法原理 某一种微生物的生长（ 繁殖） 必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌（ L a c t o b a c i l l u s c a s e i ， 简称1 .C ） 的生长需要核黄素， 培养基中若缺乏这种维生素该细菌便不能生长。在一定条件下， 该细菌生长情况，以及它的代谢物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成正 比， 因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定试样中核黄素的含量。9 试 剂9 . 19 . 29 . 39 . 49 . 5冰乙酸。甲苯 。无水乙酸钠。乙酸铅 。氢氧 化铁 。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 8 5 -2 0 0 39 . 6 干酪乳酸杆菌( L a c t o b a c i l l u s c a s e i A T C C 7 4 6 9 ） 。9 . 7 盐酸 ： 0 . 1 m o l / L o9 . 8 氢氧化钠溶液： 1 m o l / L和 0 . 1 m o l / L o9 . 9 0 . 9 g / I . 氯化钠溶液（ 生理盐水） ： 使用前应进行灭菌处理。9 . 1 0 核黄素标准储备液（ 2 5 jig/ml,)： 将标准品核黄素粉状结晶置于真空千燥器或盛有硫酸的干燥器中。经过 2 4 h 后 ， 准确称取 5 0 mg ， 置于 2 1 . 容量瓶中， 加人 2 . 4 m l 一 冰乙酸和 l . 5 L水。将容量瓶置于温水中摇动 ， 待其溶解 ， 冷 至室温， 稀释至 2 I , ， 移至棕色瓶 内， 加少许 甲苯 盖于溶液 表面， 于 冰箱 中保存 。9 . 1 1 核黄素标准中间液（ 1 0 t e g / mL ) ： 准确吸取2 0 m l核黄素标准储备液， 加水稀释至5 0 ml , .9 . 1 2 核黄素标准使用液( 0 . 1 p g / rn l . ) ： 准确吸取 1 . 0 m l . 中间液于 1 0 0 m l容量瓶 中， 加水稀释至刻度， 摇匀。每次分析要配制新标准使用液。9 . 1 3 碱处理蛋白陈： 分别称取4 0 g蛋白陈和 2 0 g氢氧化钠于2 5 0 n i l水中。混合后 放于3 7 士0 . 5 0C 恒温箱内， 2 4 h -4 8 h 后取出， 用冰乙酸调 节p H 6 . 8 ， 加 1 4 g无水乙酸钠（ 或 2 3 . 2 g 含有 3 分子结品水的乙酸钠） ， 稀释至 8 0 0 m工J ， 加少许甲苯盖于溶液表面， 于冰箱中保存。9 . 1 4 肤氨酸溶液（( l g / l ） ： 称取 1 g L - 胧氨酸于小烧杯 中。加 2 0 m l ） 水 ， 缓慢加人约 5 n i l- -1 0 ml . 盐酸， 直至其完全溶解 ， 加水稀释至 1 I ， 加少许甲苯盖于溶液表面。9巧酵母补充液： 称取 1 0 0 g 酵母提取物干粉于5 0 0 rn I , 水中， 称取 1 5 0 g乙酸铅于5 0 0 ml , 水中， 将两溶液混合 ， 以氢氧化钱调节 p H至酚酞呈红色（ 取少许溶液检验） 。离心或用布氏漏斗过滤 ， 滤液用冰乙酸调节p 1 -I 至6 . 5 。通人硫化氢直至不生沉淀， 过滤， 通空气于滤液中， 以排除多余的硫化氢。加少许甲苯盖于溶液表A， 于冰箱中保存。9 . 1 6 甲盐溶液： 称取2 5 g磷酸氢二钾和2 5 g 磷酸二氢钾， 加水溶解， 并稀释至5 0 0 ml - 。加人少许甲苯以保存之 。9 . 1 7 乙盐溶液： 称取 1 0 g 硫酸镁（ Mg S ( ) , 7 H 2 ( ) ) , 0 . 5 g 硫酸亚铁（ F e S O , 7 H , O ） 和0 . 5 g 硫酸锰( Mn S ( ) , 4 H Z U ) ） 加水溶解， 并稀释至5 0 0 T rl l , ， 加少许甲苯以保存之。9 . 1 8 基本培养储备液 ： 将 下列试剂混合十 5 0 0 M I . 烧杯中， 加水至 4 5 0 m l ， 用 I T1101/I.氢氧化钠溶液调节p H至6 . 8 ， 用水稀释至5 0 0 T n I 。 碱处理蛋自陈1 0 0 m l - 0 肤氨酸溶液1 0 0 m L 酵母补充液2 0 n i l 甲盐溶液1 0 ml . 乙盐溶液1 0 n i l . 无水葡萄糖1 0g9 . 1 9 琼脂培养基 ： 将下列试剂混合于 2 5 0 m L角瓶 中， 加水至 1 0 0 ml , ， 于水浴 F 煮至琼脂完 全溶化， 用 1 m o l / L盐酸趁热调节 p H至 6 . 8 。尽快倒人试管中， 每管 3 ml _ -5 m I . ， 塞上棉塞， 于高压锅内在6 , 9 X 1 0 P a 压力下灭菌1 5 mi n ， 取出后直立试管， 冷至室温， 于冰箱中保存。 尤水葡萄糖I g 乙酸钠（ N a A c 3 H , 0) 1 . 7 g 蛋自陈0 . 8 g 酵母提取物 I I 粉0 . 2 g 甲盐溶液0 . 2 m I 乙盐溶液0 . 2 ml 琼脂1 2 99 . 2 0 0 . 4 g / L浪甲酚绿指示M： 称取0 , 1 g嗅甲酚绿于小研钵中， 加 l . 4 ml - 0 . l m o l / L氢氧化钠溶液免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 8 5 - 2 0 0 3研磨 。加少许水， 继续研磨 ， 直至完全溶解。用水稀释至 2 5 0 m L a9 . 2 1 0 . 4 g / L嗅察香草酚蓝指示剂 ： 称取 0 . 1 g 澳磨香草酚蓝于小研钵 中， 加 1 . 6 mL 0 . 1 m o l / l . 氢氧化钠溶液研磨。加少许水， 继续研磨 ， 直至完全溶解 。用水稀释至 2 5 0 ml -1 0 仪器与设备1门乙1月兮 nU几llUC甘n甘口月峨且月11 0 . 5实验室常用设备。电热恒温培养箱。离心沉淀机。液体快速混合器。高压消毒锅。1 1 菌种的制备与保存1 1 . 1 储备菌种的制备： 以 L . C 纯菌种接入 2 个或多个琼脂培养基管中。在 3 7 士。 . 5 恒温培养箱中保温 1 6 h -2 4 h 。贮于冰箱内， 至多不超过 2 周 ， 最好每周移种一次。保存数周以上 的储备菌种， 不能立即用于制备接种液 ， 一定要在使用前每天移种一次 ， 连续 2d -3 d 方可使用， 否则生长不好。1 1 . 2 种子培养液的制备： 取 5 ml核黄素标准使用液和 5 m l ， 基本培养储备液于 1 5 ml ， 离心管混匀 ，塞上棉塞， 于高压锅内在 6 . 9 X 1 0 P a 压力下灭菌 1 5 m i n 。每次可制备 2 管4 管 。1 2 分析步骤 因核黄素易被 日光和紫外线破坏， 故一切操作要在暗室内进行。1 2 . 1 接种液的制备 使用前一天， 将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培养液中， 同时制做两管。在 3 7 土0 . 5 *C保温1 6 h -2 4 h 。取出后离心1 0 m i n ( 3 0 0 0 r / min ) ， 以无菌操作方法倾去上部液体， 用已消毒的生理盐水淋洗两次， 再加 1 0 m l . 消毒生理盐水 ， 在液体快速混合器上振摇试管 ， 使菌种成混悬体。将此液倾人已消毒的注射器 内， 立即使用。1 2 . 2 试样的制备1 2 . 2 . 1 将用磨粉机 、 研钵磨成粉末或用打碎机打成匀浆。1 2 . 2 . 2 称取约含5 p g -1 0 p g的核黄素试样（ 谷类约 1 0 g ， 干豆类约4 g ， 肉类约5 g ) ， 加人5 0 m l ,0 . 1 m o l / l . 盐酸溶液， 混匀。置于高压锅内， 在 1 0 . 3 X l 0 0 P a 压力下水解 3 0 m i n ,1 2 . 2 . 3 冷至室温， 用 1 m o l / I _ 氢氧化钠溶液调节P H至4 . 6 ( 取少许水解液， 用嗅甲酚绿检验， 溶液呈草绿色即可） 。1 2 . 2 . 4 加入淀粉酶或木瓜蛋白酶， 每克试样加入2 0 m g 酶。在4 0 恒温箱中过夜， 大约 1 6 h o1 2 . 2 . 5 冷至室温， 加水稀释到 1 0 0 m l ， 过滤。对于脂肪量高的食物， 可用乙醚提取 ， 以除去脂肪。1 2 . 3 标准管的制备 三组试管中每管各加核黄素标准使用液0 . 0 , 0 . 5 , 1 . 0 , 1 . 5 , 2 . 0 , 2 . 5 , 3 . 0 ml , ， 每管加水至5 m l . ， 再每管加 5 m l - 基本培养储备液混匀。1 2 . 4 试样管的制备1 2 . 4 . 1 吸取试样溶液 5 ml ， 一1 0 ml , ， 置于 2 5 ml具塞试管中， 用 0 . 1 mo l / l , 氢氧化钠调节 p H至 6 . 8（ 取少许溶液 ， 用嗅察香草酚蓝检验） ， 加水稀释至刻度。1 2 . 4 . 2 取两组试管， 各加试样稀释液( 1 2 . 4 . 1 ) 1 , 2 , 3 , 4 m l ， 每管加水至 5 m l . ， 每管再加 5 m 工 、 基本培养储备液混匀。1 2 . 5 灭菌 将以上试样管和标准管全部塞上棉塞， 置于高压锅内， 在6 . 9 X 1 0 4 P a 压力下灭菌 1 5 m i n .免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 8 5