SNP分型技术简介高遄.ppt

SNP,1. SNP概念,2. SNP分类,4. SNP特性,5. SNP研究意义,6. SNP分型技术,1.SNP概念,SNP，single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性。主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。 一个SNP 的含义是给定的一个群体中，超过1 %的个体在给定的遗传区域内发生一次核苷酸改变，是一个物种中不同个体表型的主要遗传来源。 包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等 转换是指同型碱基之间 G-A，T-C 颠换是指发生在嘌呤与嘧啶之间A-T、A-C、C-G、G-T,1.SNP概念,依据排列组合原理一共可以有6种替换情况： A-G、A-T、A-C、C-G、C-T 和G-T 但事实上，转换的发生频率占多数，而且是C-T 转换为主。 其原因是CpG的C是甲基化的，容易自发脱氨基形成T SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的： （1）非转录序列要多于转录序列 （2）在转录区非同义突变的频率，比其他方式突变的频率低得多。,2.SNP分类,一是遍布于基因组的大量单碱基变异； 二是分布在基因编码区(coding region)内，称其为cSNP，属功能性突变。 从对生物的遗传性状上来看，cSNP又可分为两种： （1）同义cSNP，SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变的含义相同。 （2）非同义cSNP，指碱基序列的改变可以使其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。,3.SNP特性,密度高 SNP在人类基因组的平均密度估计为 1/1000 bp ，在整个基因组的分布达 3106个，遗传距离为 23CM ，其中约有2105个存在于编码区。密度比微卫星标记更高，可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。 具有代表性 虽然SNP在编码区的分布要低于其他位置，某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此，它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。,3.SNP特性,遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性。 分布不均匀 由于选择压力的存在，SNP在整个基因组中的分布不均匀，在3表达序列标签(express sequence tags, ESTs)中的分布比在其他基因组区域中的少，在非编码区的数目远远大于编码区。 易实现分析的自动化 由于每个SNP位点通常仅含两个等位基因双等位基因(biallele)，在检测时能通过一个简单的“+/-”分析进行基因型分型，而无需分析片段的长度，因而易于自动化。,4.SNP研究意义,SNPs作为第三代遗传标记-路标的作用。 传统研究策略（表征、蛋白、基因） 逆向遗传学（表型、基因、蛋白）,4.1基因组制图,“遗传图谱”、“物理图谱”、“放射杂交图谱” 将SNP与人类基因组序列、物理和遗传图谱结合起来以期在序列变异、疾病关联基因、种族遗传和基因组扫描等方面作出进一步研究，将会对疾病的深入了解、诊断方法和新型有效的治疗方法的发展产生深远的影响。 2000年，SNP图谱，2730个SNPs 定位和作图。 2001年，国际SNP图谱工作组124万个SNP的图谱。,4.2疾病的关联分析,心脏病、癌症、糖尿病、精神病等的遗传变异是人类遗传学家面临的一个主要挑战。 这类疾病通常隔代遗传，结果使曾经成功运用于孟德尔疾病的传统的家系连锁分析在此使用受限，复杂性疾病是遗传和环境综合作用的结果。 目前，发现这些多基因疾病微效基因最有力的方法是利用与疾病基因关联的DNA 标记，对病例组和对照组的标记的等位基因频率进行统计学比较，SNP是这种分析很好的一种标记。,4.3药物设计和应用,SNP 多态性的研究,表明遗传多态性与个体对药物的敏感性或反应性之间存在关联 药物基因组学(Pharmacogenomics) 。 通过比较服药后副作用严重个体与无此反应的对照的DNA ，确立一个易感个体的SNP 简图，在通过比较具有良好作用个体与无作用个体的DNA，建立一个正效应个体cSNP 简图。两者共同组成一个综合的药物反应模型，有助于患者选取有效而副作用少的疗法。,4.4个体识别和亲权鉴定,虽然SNPs 位点提供的信息相对较少，但分布的高密度弥补了信息量的不足。 34 个相邻的SNPs 位点构成的单倍型可达816 种，相当于一个STR 位点的多态性，1000 个SNPs 与400 个STR 扫描得出的连锁信息量等同。 SNPs 较STR 等多态标记具有更高的遗传稳定性。 已有许多SNPs 用于法医学： polymarker 系统用于亲子鉴定个体识别。,5.SNP分型技术,基因分型（Genotyping）：利用生物学检测方法测定个体基因型（Genotype）的技术。,5.1经典检测方法,5.1.1限制性片段长度多态性法（PCR- RFLP） 5.1.2单链构象多态性法（ PCR- SSCP） 变性梯度凝胶电泳 （DGGE）,5.1.1限制性片段长度多态性法 PCR- RFLP,定义： 由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差异，这种因内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism, RFLP）。 该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一。,5.1.1限制性片段长度多态性法 PCR- RFLP,原理： 利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。,5.1.1限制性片段长度多态性法 PCR- RFLP,5.1.1限制性片段长度多态性法 PCR- RFLP,特点： 优点：分型技术简单，结果判定容易；避免测量误差判断准确；分型结果稳定，重复性好；特异性好，灵敏度高。 局限性：序列多态性座位中大约只有1/3的碱基涉及限制酶识别序列；遗传标记系统的个人识别能力有限；限制酶消化条件较高。,5.1.2单链构象多态性法 PCR- SSCP,原理： 单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。 这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。 经PCR 扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并保证在单链状态下，然后在一定浓度的非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳。相同长度的单链DNA ，可以因其顺序或单个碱基差异，所形成的空间构象就会不同，其在凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的差异，即多态型,5.1.2单链构象多态性法 PCR- SSCP,5.1.2单链构象多态性法 PCR- SSCP,特点： 优点：操作简单，步骤少，周期短；成本低；适用于大样本筛选； DNA模板纯度要求不高，所需量少。 局限性：不能确定突变类型和具体位置；随DNA片段长度增加，检测的敏感性降低；会出现假阴性结果；对A=T检出率无CG好，有局限性。,5.2基于PCR 的方法,5.2.1等位基因特异性PCR ( AS-PCR) 序列特异PCR ( PCR-SSP ) 单管双向等位基因专一性扩增(SB - ASA),5.2.1等位基因特异 PCR ( AS-PCR),原理： 根据 SNP位点设计特异引物。 其中一条链(特异链)的3末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) ，另一条链(普通链)按常规方法进行设计，因此，AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。 因为特异引物在一种基因型中有扩增产物，在另一种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定基因型的 SNP。,5.2.1等位基因特异 PCR ( AS-PCR),基本原理如图：等位基因1（Allele1）和等位基因2（Allele2）除SNP（T-C）位点外其他序列完全相同，引物P1、P2分别为根据等位基因1的SNP位点（T）和等位基因2的SNP位点（C）设计的特异引物（图A）。 以基因型1（Genotype1）为模板，分别用引物P1和P2进行扩增，因为P1特异链的3末端刚好与基因型1的SNP位点T互补，所以能够产生扩增产物，P2特异链的3末端与基因型1的SNP位点T不互补，所以没有扩增产物，因此基因型1是纯合型TT；同样基因型2（ Geno-type2 ）是纯合型CC；以基因型3（Genotype3）是杂合型TC（图B）。根据凝胶电泳中有无带型就可以确定基因型的SNP（图C）。,5.2.1等位基因特异 PCR ( AS-PCR),5.2.1等位基因特异 PCR ( AS-PCR),特点： 快速 简便 低成本 高通量的检测基因型SNP的方法。,5.3基于杂交荧光检测的方法,5.3.1TaqMan技术 SYBR Green 法（结合熔解曲线分析） 5.3.2连接酶检测反应（LDR） 5.3.3基因芯片 焦磷酸荧光法 双色荧光偏振技术(IADCFP),5.3.1TaqMan 技术,原理： TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5末端，而淬灭剂则在3末端。 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 如果探针与目标序列中存在错配碱基，就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及酶切割供者的活性，影响其释放荧光的强度，可以通过检测反应液中的荧光强度确定SNPs 分型。,5.3.1TaqMan 技术,5.3.1TaqMan 技术,特点： 优点：不需要分离或洗脱过程，提高了实验速度，同时减少了PCR 污染的可能性；操作简单快速，特别适合少量位点大量样本（几千个）的分型项目。 缺点：不适合多位点少量样本（几十个）分型, 特别是频率偏低的位点；不能同时采用两个及两个以上的探针同时进；探针成本较高，实验花费大,5.3.2连接酶检测（LDR）,原理： 基于耐高温连接酶的SNP快速检测技术。 当探针与目的DNA互补配对后，连接酶能通过催 化磷酸二酯键将相邻的两根探针连接；当探针DNA 的接头处存在碱基错配，连接反应便不能进行。,5.3.2连接酶检测（LDR）,(1)多重PCR (Multiplex PCR)获得含有待检测突变位点的基因片断 (2)多重LDR (Multiplex LDR) (3)通过测序仪电泳读取检测结果,5.3.2连接酶检测（LDR）,优化后的LDR技术-新型通用探针LDR分型技术 P12：两组检测探针(一个SNP含2个P1) P2:一组下游探针 以1：1：1摩尔比混合称为位点探针 一组通用荧光探针 一组通用模板 以1：1摩尔比混合称为通用探针 设计不同位点和不同基因型探针连接产物的序列长短是已知的，并且有3n bp的差异。 在特定的基因型中，相应的检测探针与目的DNA完全互补，检测探针，下游探针和通用荧光探针分别和目的DNA以及通用模板杂交，并且连接成完整的DNA单链。 根据探针的设计，不同的基因型会产生不同长度的连接产物，所以根据单链的长度可以判断该位点的基因型 如果同时出现两条相差3 bp的单链，则该位点的基因型为杂合子。如果没有目的DNA，则只有下游探针和通用荧光探针能连接成产物。,5.3.2连接酶检测（LDR）,特点： 优点：灵敏度高，特异性强，结果峰图直观，相对成本比Taqman技术低。 缺点：高通量应用中探针合成成本过高。,5.3.3基因芯片,原理： 任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列：,这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。 亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。 假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。,5.3.3基因芯片,一组寡核苷酸探针,TATGCAATCTAG,CGTTAGAT,ACGTTAGA,ATACGTTAGATC,TACGTTAG,由杂交位置确定的一组,核酸探针序列,GTTAGATC,杂交探针组,TATGCAATCTAG,重组的互补序列,靶序列,TACGTTAG,ACGTTAGA,ATACGTTA,CGTTAGAT,GTTAGATC,ATACGTTA,5.3.3基因芯片,基因芯片,荧光标记的样品,共聚焦显微镜,获取荧光图象,杂交结果分析,探 针 设 计,杂交,5.3.3基因芯片,特点： 优点：信息量大；自动化程度高。 局限性：芯片造价高昂, 所需设备贵重, 不利于普及应用。,5.3.3基因芯片,5.4光谱或电子信号,5.4.1直接测序法 MALDI - TOF 质谱分析 变性高效液相色谱技术 (DHPLC) 纳米探针电路检测原理,5.4.1直接测序法,对于一些比较小、外显子相对较少的基因的SNP 检测可直接测序,其检测效率可以达到100 % 。 其主要流程是: PCR 扩增目的片段 纯化、回收 4种荧光标记(ddNTP) 测序反应 过柱去除多余的荧光和引物 测序仪