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免 疫 组 织 化 学 Immunohistochemistry (IHC),第一章 免疫组织化学基本原理 及相关知识,用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的显色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电镜观察。,蛋白质 磷脂 多肽 多糖 核酸 受体 酶 病原体 激素,免疫组织化学技术的突出优点： 高度的特异性 敏感性高 方法步骤统一 机能和代谢密切结合， 定性、定位、定量的统一,免疫组织化学技术在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替的。它能在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断，开拓了广阔的前景。, 基因探针 核酸分子杂交技术 原位PCR技术 核酸杂交和免疫组织化学双标记 电镜杂交技术,核酸分子探针-杂交-免疫组织化学 放大和显示杂交信号 杂交免疫组织化学,基因重组技术 免疫组织化学 图像分析 单抗技术 技 术 流式细胞术 激光共聚焦显微术,免疫组织化学的全过程： 抗原的提取和纯化 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体） 抗体效价检测和提取、纯化 标记抗体 细胞、组织切片标本的制备 免疫组织化学反应和显色 观察和记录结果,第二章 免疫组织化学中的技术问题,技术问题的重要性,第一节 有关的细胞和组织学技术,一、取材 （一）细胞标本的取材 印片法 穿刺吸取涂片法 体液沉淀涂片法 细胞数量多：直接涂片 细胞数量少：离心沉淀涂片, 培养细胞 直接收集 培养液离心涂片,（二）组织标本的取材 活检钳的刀口必须锋利，以免组织受挤压 取材部位必须是主要病变区 必须取病灶与正常组织交界处 必要时取远离病灶区的正常组织作对照,新鲜组织 冰冻切片 液氮保存 -70冰箱,二、固定 固定剂：常用醛类固定剂 10%福尔马林（甲醛10ml + 蒸馏水90ml） 10%中性缓冲福尔马林（甲醛10ml + 0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml ） 2.5%戊二醛 用于电镜 丙酮 用于冰冻切片、细胞涂片 4,固定方法： 浸入法 灌注法,三、切片 1. 石蜡切片 2. 冰冻切片 3. 塑料切片 4. 超薄切片,四. 玻片处理和涂胶 载玻片和盖玻片处理 盖玻片、载玻片 清洁液中浸泡24h（硫酸 + 重铬酸钾） 清水冲洗 蒸馏水冲洗 95%酒精浸泡24h 烘干,载玻片涂粘附剂: APES 多聚赖氨酸,第二节 免疫组化染色中的技术问题,一、抗体 新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清或腹水。,1. 抗体贮存 2. 抗体稀释 按不同的免疫染色方法和抗原性强弱及抗原的多少，稀释各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色效果。, 抗体最佳稀释度的测定方法 二抗 一 抗 1 1:50 1:100 1:200 1:400 _ 1:50 + + + 1:100 + + + 1:200 + + 1:400 _, 以中等阳性稀释度为佳 抗体稀释液的配制 0.01mol/L pH7.4 PBS or TBS,3抗体的选择 (1) 多抗：虽然存在交叉反应的问题，但由于识别多个抗原表位，所以即使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果，这是多抗的优点之一。 (2) 单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高。但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之一。,多抗？单抗？ 抗原表位的丰富程度 也可应用多个单抗 （a cocktail of monoclonal antibodies）解决抗原表位少的问题,二、免疫染色 一般程序： 标记抗体与标本中的抗原反应结合 用PBS洗去未结合的部分 直接观察结果（免疫荧光）或显色后再用显微镜观察（免疫酶）,1. 增强特异性染色的方法 蛋白酶消化法 胃蛋白酶、胰蛋白酶 合适的抗体稀释度 第一抗体 温育时间 37 30-60 min, 4 过夜 多层染色法（双层、三层）,2. 减少或消除非特异性染色的方法 加二抗动物的正常血清 2%5%牛血清白蛋白,3. 显色反应的控制 显色剂的浓度、温育时间 4. 复染,三、对照 阳性对照 阴性对照 阻断试验 替代对照 空白对照 自身对照 吸收试验,四、免疫组织化学染色结果的判断 阳性细胞染色分布有三种类型：胞浆、胞核、细胞膜表面, 阳性细胞分布可分为灶性或弥漫性 由于细胞内抗原含量不同，所以染色强度不一, 阳性细胞染色定位于细胞，与阴性细胞相互交杂分布。 切片边缘、刀痕或皱折区域 、坏死或挤压的细胞区、胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。,第三章 免疫组织化学常用方法介绍,第一节 免疫酶细胞化学,免疫酶细胞化学是免疫组织化学中最常用的方法，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学手段，检测某种物质（抗原抗体）在组织细胞内的存在部位。即预先将抗体与酶连结（酶标抗体），再使其与组织内特异性抗原反应，经细胞化学染色后，在光镜或电镜下观察分析。,一、常用酶的种类 用于标记的酶应具备以下几点： 酶催化的的底物必须是特异性的，且容易被显示，所形成的产物易于在光镜或电镜下观察。 所形成的终产物沉淀必须稳定，不向周围组织弥散。 较易获得酶分子，最好有商品出售。, 中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存12年活性不应改变。 酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性。 被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。,免疫组织化学常用酶 名称 分子量 内源性 商品 HRP (POD) 40-50 kD + 有 ALP (AP) 80-120 kD + 有 , HRP/POD（辣根过氧化物酶） 显色原理： HRP + H2O2 HRP H2O2 + 供氢体 （电子供体） HRP + H2O + 供氢体 （氧化型）,DAB（二氢基联苯胺） 棕褐色 AEC（3-氢-9-乙基咔唑） 红色 TMB（四甲基联苯氨） 深蓝色, ALP/AP（碱性磷酸酶） 底物：萘酚（As-Mx） 发色团：Fast Blue Fast Red BCIP/NBT,血细胞、淋巴细胞 内源性过氧化酶含量较高 可选用ALP/AP,二、染色步骤及原理 间接法： 1. 石蜡切片经二甲苯脱蜡，下行酒精至水; 2. 未固定的冰冻切片，丙酮固定 2030 min，风干1530min;,3. 用0.03%H2O2处理切片1530 min(室温)，封闭内源性过氧化酶的活性； 4. PBS洗涤2min; 5. 0.05% Tween-20/PBS，5min（室温）；,6. 0.1%-1% BSA湿盒内孵育1525 min（室温），然后轻轻弃去孵育液（不冲洗） ；(或二抗动物的正常血清); 7. 轻轻弃去孵育液，滴加PBS稀释的第一抗体，湿盒内孵育12 h （20-25）； 8. PBS充分冲洗， 5min 3次，以去除切片上非特异性吸附的抗体；,9. 滴加PBS稀释的HRP标记的第二抗体，湿盒内孵育4560 min （室温）； 10. PBS漂洗 5min 3 次； 11. 显色，0.01% - 0.1% H2O2 0.01% -0.05% DAB, 1015 min； 12. 细胞核复染（甲基绿或苏木素）； 13. 封片、观察、记录。,亲和组织化学（affinity histochemistry） 植物凝集素与糖类 生物素与抗生物素 葡萄球菌A蛋白与IgG 阳离子与阴离子 激素、维生素、糖类与受体,第二节 抗生物素-生物素免疫细胞化学染色法,一、基本原理 抗生物素（卵白素） avidin 分子量68 000 糖蛋白 生 物 素 （维生素H） biotin 分子量 244,biotin,avidin,biotin,biotin,biotin,二、抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术 (Avidin-Biotin-peroxidase Complex technique, ABC法) 其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。,second antibody-biotin + Avidin + biotin-HRP,ABC complex,操作步骤： 1. 石蜡切片脱蜡，系列酒精至水； 2. 冰冻切片丙酮固定10min，PBS洗涤5min 3；,2. 第一抗体，室温孵育60 min ； 3. PBS洗涤 5 min 3次 4. 生物素标记的第二抗体，孵育45 min 5. PBS洗涤 5 min 3次,6. ABC复合物， 45 min 7. PBS洗涤 5 min 3次 显色（H2O2/DAB）、复染、封片 观察、记录,second antibody-biotin + Avidin + biotin-HRP,ABC复合物的配制： biotin：avidin 1：4 avidin 10g/ml biotin 2.5g/ml 临用前30分钟配制,ABC法特点： 敏感性强，具有放大作用 特异性强，背景染色淡 方法简便，节约时间 由于生物素与抗生物素具有与多种示 踪物结合的能力，可用于双重或多重染色,注意事项 内源性生物素活性及其消除：肝、肾、白细胞、乳腺预先以0.01%抗生物素和0.01%生物素溶液分别作用20 min，以消除内源性生物素。 试剂的差异，应进行预实验。 ABC试剂盒保存以4为佳。,第三节 葡萄球菌蛋白A（SPA）,葡萄球菌蛋白A（ staphylococal protein, SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。 早在1940年，Vevwey发现某些金黄色葡萄球中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀，1959年将其命名为A抗原。,一、免疫学特性 SPA具有与人及多种动物（豚鼠、猪、小鼠、猴等）IgG结合的能力。SPA结合部位是Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗体的活性。SPA具有的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金、铁蛋白等相结合。,SPA对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如 SPA 与人 IgG 亚型IgG1 、IgG2 、IgG4 有结合力，与IgG3没有结合力。,二、SPA在免疫组化中的作用 可作为二抗或标记抗体。SPA的最大优点是不受种属特异性的限制，还具有染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等优点。,SPA-胶体金技术（PGA技术）可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位，是一种较为理想的免疫电镜技术。,SPA-HRP用于间接法的操作步骤： 切片脱蜡 第一抗体，37，孵育30min或4，2448 h PBS 冲洗， 5min 3次 SPA-HRP（1:100 1:400）， 30 min DAB-H2O2显色 复染、封片、观察、记录,第四节 凝集素,凝集素（lectin）是指一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，因其能凝集红细胞（含血型物质），故名凝集素。,植物凝集素 刀豆蛋白A （ConA） 麦胚素 （WGA） 花生凝集素 （PNA） 大豆凝集素 （SBA）,一、基本原理 生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素的最大特点在于它们能识别糖蛋白或糖脂，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳水化合物决定簇。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力。因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。,麦芽素 N-乙酰糖胺 菜豆凝集素 N-乙酰乳糖胺 刀豆素 -D-吡喃糖基甘露糖,凝集素具有多价结合的能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物质结合。,二、操作程序 直接法：标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。,1. 切片脱蜡至水； 2. 凝集素标记物（100 g/ml），室温，30min； 3. 荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察； 4. PBS洗涤，5min 3次； 5. 显色、封片、观察、记录。, 间接法：将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将示踪物质标记在抗凝集素抗体上。,1. 切片脱蜡至水； 2. 凝集素稀释液（10 g/ml），室温，30min； 3. PBS洗涤，5min 3次； 4. 标记的抗凝集素抗体（1:100），孵育30min； 5. PBS洗涤，5min 3次； 6. 显色、封片、观察、记录。, 糖-凝集素-糖法：过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合，再与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个三明治样的糖基-凝集素-糖基的结合物。,1. 切片脱蜡至水； 2. 凝集素稀释液（10 g/ml），室温，30min； 3. PBS洗涤，5min 3次； 4. HRP标记糖基（10 g/ml），孵育30min； 5. PBS洗涤，5min 3次； 6. 显色、封片、观察、记录。,三、应用 作为细胞分化和成熟的标记 淋巴细胞的分群 小鼠胸腺皮质内不成熟的T淋巴细胞呈PNA阳性反应，在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有20%左右的PNA阳性反应细胞，后者是否属于不成熟的 T 淋巴细胞，值得进一步研究。, 作为细胞特殊类型的标记 研究人视网膜，PNA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。 乳腺上皮细胞呈PNA阳性反应，肌上皮细胞呈PNA阴性反应。,刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏各部，PNA和双花扁豆凝集素（DBA）主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞，荆豆凝集素（UEA）主要分布在血管内皮细胞，而麦芽素分布在肾小球。, 肿瘤中凝集素结合的改变 肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，可用凝集素检测出来。 凝集素可作为肿瘤特异性诊断的标记，肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。,第五节 链霉菌抗生物素蛋白检测系统,链霉菌抗生物素蛋白是从链霉菌中分离出来的不含糖基链的蛋白质，分子量47kD，含4个亚基，每个亚基都能与一个生物素分子结合。,抗生物素蛋白等电点为10，而链霉菌抗生物素蛋白等电点为6.5，接近中性，几乎不与组织中的内源性凝集素样物质发生非特异性结合。因此，可产生低背景、高放大的效果。,一、SP法 （ Streptavidin Peroxidase conjugated method ） 生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶结合。,操作步骤： 石蜡切片，脱蜡至水； 过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化酶的活性； 第一抗体； 生物素标记的第二抗体； 链霉菌抗生物蛋白-过氧化物酶溶液； 显色、复染、封片、观察。,S-P试剂盒包括以下内容： A. 内源性过氧化酶阻断剂 B. 正常动物非免疫血清 C. 生物素标记的第二抗体 D. 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶,二、SABC法 链霉菌抗生物蛋白与一定浓度的生物素化酶混合后，就能形成链霉菌抗生物素-生物素-酶复合物(SABC)。,SABC试剂盒包括以下内容： 正常动物血清 生物素化二抗 SABC复合物,SABC具有以下特点： 高敏感性 低背景 简便快速 结果稳定,第六节 免疫金技术（胶体金）,1971年，Faulk和Taylor首先将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原。 胶体金技术逐渐得到完善和成熟，应用胶体金为标记物的免疫金染色（IGS）与免疫金银染色（IGSS）方法在光镜和电镜下可以单标记和双标记或多种标记同时观察细胞和组织结构，可以定性、定位、定量研究。,一、基本原理 胶体金即金的水溶液 分散体系：分散相 + 分散介质 离子分散体系：以小分子或离子状态分散 胶体分散体系：分散相颗粒1100nm 粗分散体系：,二、胶体金的一般性状 1. 胶体金的颜色 胶体金颗粒在520nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色 2040nm之间，吸收波长530nm，呈深红色 60nm，吸收波长600nm，呈兰紫色,2. 胶体金的稳定性 溶液的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散系之间，溶胶的胶颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。然而溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总表面积表大，当胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒的倾向。,三、在免疫细胞化学中的应用 （一）免疫金染色 1. 免疫金法 1978年，Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了光镜水平的免疫金法（immunogold staining, IGS）,间接法：（以人肝组织HBsAg的定位为例） 石蜡切片脱蜡至水； 鼠抗HBsAg单克隆抗体（一抗），4过夜 金标兔抗鼠抗体（二抗） ， 37，45min ( 可以金标SPA代替) 复染（苏木素）、封片、观察、记录,2. 蛋白A-胶体金（ PAG）放大法（以5-HT定位为例） 石蜡切片脱蜡至水； 兔抗5-HT抗体，4过夜，或 37 1 h PAG 37 1 h 抗A蛋白抗体， 45min，37 PAG， 37， 45min 复染、封片、观察、记录,PAG放大法的优点： 使用试剂单一； 可大大提高IGS的敏感性，从而使应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能； 背景干净。,（二）免疫金银法 将IGS与银显影方法相结合创立了免疫金银法（ immunogold-silver staining, IGSS）,基本原理： 胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（Ag+）还原成银原子(Ago)，被还原的银原子围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大，最终抗原位置得到清楚放大。,以人肝细胞内HBsAg定位为例 石蜡切片脱蜡至水； 马抗HBsAg抗体，4过夜或37，12h PAG，37，45min 银显影 复染（苏木素）、封片、观察、记录,四、优点 1. 制备简单； 2. 标记简单：抗体、SPA、酶可通过物理吸附作用与胶体金颗粒形成稳定的金标复合物； 3. 适用范围广：光镜、透射电镜、扫描电镜、X线能谱分析等。 4. 特异性强：免疫金探针的非特异性吸附作用小，特异性高。,5. 敏感性高：用于电镜，其检测抗原或抗体的效率远远超过酶反应物，大大改进了免疫组化在电镜水平上的分辩率。光镜金颗粒经过银显影后得到放大，敏感性比PAP法高200倍，比ABC法高6倍，是迄今为止最为敏感的免疫细胞化学方法，特别适用于检测微量抗原及石蜡切片标本中的微弱抗原。,双标记及多重标记：胶体金制备成不同大小的颗粒，分别标记不同的抗原或抗体。,第七节 半抗原交联抗体法,近年来，为提高敏感性和减低非特异性染色，在常规免疫组化技术的基础上，发展了半抗原交联抗体法（hapten-coupled technique），可作免疫酶或免疫荧光染色。,基本原理：半抗原标记第一抗体 半抗原：阿散酸（对氨基苯砷酸）、对氨基苯酰甘氨酸、亚对氨苯酰甘氨酸、二硝基苯氨基丙睛亚胺酸脂（DNP），通过酰胺化反应把半抗原结合到抗体分子上。,操作程序： 间接法（二步法）： 石蜡切片脱蜡至水； 半抗原标记的特异性抗体（一抗）； 荧光素或酶标记的抗半抗原抗体 ； 荧光显微镜观察，或加底物显色。,优点： 1. 敏感性高：由于本法是通过酰胺化反应标记半抗原，对抗体活性损失极小，抗体保留较高的活性，能结合大量半抗原，平均每个球蛋白分子可同时结合20个半抗原分子，每个半抗原又可与抗半抗原抗体相结合，特异性免疫反应明显放大，其敏感性明显高于常规的免疫酶和免疫荧光染色技术，特别有助于发现滴度低的同种抗血清和含抗原量较少的组织。,2. 可用于双重免疫染色：利用两种无交叉反应的半抗原（如阿散酸、对氨基苯酰甘氨酸）分别标记来自同一种动物的两种特异性第一抗体，即可在同一张切片内同时显示两种不同的抗原。 3. 特异性强，敏感性高，背景染色低。,第八节 多聚螯合物酶法,多聚螯合物酶二步法，也称非生物素检测系统，与简单的二步法相比，具有敏感性和特异性高、稳定性好的优点。,一、EnVision System ( DAKO ) EnVision System是将二抗和酶通过一个多聚化合物（葡聚糖）骨架联接成一个多聚体（即 EnVision ），每一个分子的复合物中约含70个分子的POD和10个分子的第二抗体，复合物中的POD的绝对数量远高于其他复合物，直接放大信号 4050倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。同时，人体内不存在该多聚化合物，无特异性干扰，故背景染色浅。,EnVision System工作程序： 1. 脱蜡、水化组织切片； 2. 一抗孵育 1030min; 3. PBS漂洗; 4. EnVision TM孵育1030min; 5. PBS漂洗 6. 显色、复染、封片。,特点： 敏感 省时 方便 背景低 （避免了内源性生物素干扰）,二. PowerVisionTM二步法: 是美国PowerVision公司推出的产品，其检测效率高于En Vision法。,三. EPOS法 EPOS法（enhanced ploymer one-stop staining）是DAKO公司近年来推出的一步染色法。原理是采用一种惰性的多聚化合物（葡聚糖）为骨架，将特异性抗体（一抗）和POD结合在一起，形成POD-多聚化合物-特异性抗体巨大复合物。复合物内不含第二抗体及亲和素。,EPOS法操作程序： 1. 石蜡切片常规脱蜡至水; 2. Dako EPOS/POD试剂，孵育3060min; 3. PBS漂洗 3min 3次; 4. 显色、复染、封片。,四. UIP法 UIP（universal immuno-enzyme polymer）法，其原理是以氨基酸类为骨架，形成POD-氨基酸-二抗复合物（N-Histofine复合物）。由于多聚物中有N末端暴露，形成的电荷能与组织发生静电吸附，可造成非特异性染色，染色时需平衡静电荷。,第九节 组织芯片技术,组织芯片又称组织微阵列，是生物芯片的一种，将数十种、上百种甚至上千种的不同组织点在一张固体载体（通常是载玻片）。可以按照不同的需求设计组织排列，具有高通量、可比性强、节约大量成本的优点，减少了实验误差，尤其适用于大样本的研究。对研究疾病不同病理发展阶段各基因表达的动态变化、相关基因验证、治疗靶点的定位、抗体和药物的筛选等均有重大的使用价值。,组织芯片的制备： 1. 芯片的设计； 2. 根据设计将载体蜡块打孔； 3. 观察组织切片，在供体蜡块上准确标记所需要的靶点； 4. 利用打孔仪钻取靶点组织，并转移至载体蜡块相应的孔位上，制成所需要的阵列蜡块； 5. 常规切片。,第十节 原位杂交免疫组织化学 （in situ hybridization histochemistry, ISHH）,分子杂交： 液相核酸分子杂交：在溶液中进行，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。 固相核酸分子杂交：斑点杂交 Southern 印迹杂交 Northern印迹杂交 原位分子杂交,一、原位杂交技术的发展 1970年，国外有学者利用同位素标记核酸探针进行细胞或组织的基因定位，从而开创了原位杂交技术。 荧光素标记探针进行原位杂交 荧光显微镜观察 2,4二硝基苯甲酸（DNP）标记DNA探针，再结合酶标记抗DNP抗体（分子杂交 + 免疫组化技术） 地高辛标记探针 生物素标记探针 + ABC法,核酸探针分类： 1. 放射性探针 非放射性探针 2. DNA探针、RNA探针 cDNA探针、cRNA探针 寡核苷酸探针,原位分子杂交在近20年的发展可以说是飞跃的，在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术，它使我们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平，为各个学科的研究带来突破性进展。,二、原位杂交技术的基本方法 杂交前准备：包括固定、取材、玻片和组织的处理（增强核酸探针的穿透性，减低背景染色等） 杂交 杂交后处理 显示：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。,1. 固定 要兼顾到三个方面： 保持细胞结构； 最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平； 使探针易于进入细胞或组织。,对于DNA来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，要使RNA的降解减少到最低水平。所以，不仅固定剂的种类、浓度和时间十分重要，而且取材后应尽快冷冻或固定。,固定剂： 4%多聚甲醛 10%中性缓冲福尔马林,2. 玻片和组织切片的处理 玻片的处理： 盖玻片、载玻片 清洁液中浸泡24h（硫酸 + 重铬酸钾） 清水冲洗 蒸馏水冲洗 95%酒精浸泡24h 烘干（150，以去除任何RNA酶）,由于原位杂交的实验周期较长，实验程序繁杂。因此，要应用粘附剂预先涂沫在玻片上，常用的粘附剂有3-amino propy eriethoxy silame(APES)和多聚赖氨酸。,增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： 稀释的酸洗涤，Triton X-100，酒精或某些消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶等）。常用蛋白酶K，1g/ml，37，孵育15-20 min，然后应用0.1 mol/L 的甘氨酸溶液清洗以终止蛋白酶K的消化作用。 4%多聚甲醛后固定 20 min。, 减低背景染色： 预杂交：预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。 42 30min, 防止RNA酶的污染： 戴消毒手套 高温（240）烘烤 杂交前及杂交时所应的溶液均需 经高压消毒处理,3. 杂交 核酸探针进入细胞或组织与其内靶核苷酸结合，杂交是原位杂交技术的关键的一步。 杂交是将杂交液滴于切片的组织上，加盖硅化的盖玻片，也可不加盖玻片。, 探针的浓度：0.5-5.0g/ml，一般应用1-2g/ml。杂交液的量要适当，以10-20l/每张切片为宜。 探针的长度：50-100个碱基之间。探针短，易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。, 杂交的温度和时间：解链温度（融解温度）Tm：DNA探针90，RNA探针95。加30-50%甲酰胺于杂交液中，降低Tm。1%甲酰胺，Tm可降低0.72。原位杂交的温度在Tm-25左右，即比Tm降低25，大约在30-60之间。,DNA探针或细胞内靶核苷酸为DNA，则必须在80-95加热使其变性，时间5-15 min。然后在冰上搁置1 min ，使之迅速冷却，以防复性，再置入湿盒内，37-42孵育杂交16-20h。, 硫酸萄聚糖和甲酰胺 硫酸萄聚糖的主要作用是促进杂交率。 甲酰胺的主要作用是调节杂交反应温度。,4. 杂交后处理： 杂交后有非特异性探针片段粘附在组织切片上，从而增加了背景染色。应用系列不同浓度、不同温度的盐溶液漂洗。 2 SSC（Standard Saline Citrate） 0.1 SSC,5. 显示（检测系统） 同位素标记：放射自显影 银颗粒 酶标记：碱性磷酸酶（过氧化物酶） 底物：四氮唑蓝（NBT） 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐（BCIP） 30l/每张切片，置暗处显色30 min 2 h， 产物紫蓝色（棕红色）,6. 对照实验 以不加核酸探针杂交液进行杂交 将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交,ISHH是最大优点是它的高度特异性，可测定组织、培养的单个细胞或细胞提取物中的核苷酸含量。,三、DNA探针在原位杂交中的应用 Dig标记DNA探针在石蜡包埋切片检测病毒DNA中的应用。 1. 组织前处理 固定 脱蜡 蛋白酶K 甘氨酸液 4%多聚甲醛后固定,2. 预杂交 封闭非特异性杂交位点，20l/每张切片，42 30min 3. 杂交 10-20l/每张切片，将切片置于95 10 min，使探针及病毒DNA变性，然后迅速置于冰上1 min，然后将切片置于盛有2SSC湿盒内，42 16-18 h,4. 杂交后漂洗 酶标（AP）抗地高辛抗体 37 30 min 5. 显色：NBT + BCIP,四、原位杂交与免疫组织化学结合法 可在同一张切片或两个相邻的切片进行染色，这样就可在同一细胞中显示某种mRNA和相应的蛋白、多肽或其它抗原，从而可更好地了解某一基因的转录和蛋白、多肽合成的动力学。,可在相邻切片上分别进行原位杂交和免疫组化，也可先后在同一切片上进行原位杂交和免疫组化，往往首先进行原位杂交，然后进行免疫组化。,碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体是经木瓜蛋白酶处理的，只有抗体的Fab段，没有Fc段。而免疫组化应用的抗体即有Fab段，又有Fc段。由于抗体的这一特性，可在原位杂交和免疫组化孵育时将检测核酸的抗地高辛抗体Fab段与检测蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片。 产物：蓝色，棕色,第十一节 细胞凋亡检测方法,一、细胞凋亡的研究方法 光镜或电镜形态学观察 细胞DNA提取物的DNA Ladder电泳实验 凋亡细胞DNA断裂点的原位标记实验（TUNEL） 流式细胞术检测 有关凋亡相关基因表达测定（原位分子杂交、免疫组化）,TUNEL 末端转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labling，）是检测细胞凋亡较常用的方法,其主要原理为： 细胞凋亡中DNA断裂是内切酶的作用，其断端3-OH暴露，这是凋亡细胞DNA断裂的特征，以此区别细胞坏死DNA断裂。 TdT是一种DNA修饰酶，它可以催化DNA断裂点的3-OH末端合成多核苷酸聚合物，即DNA片断加尾。在此反应中，带有地高辛、生物素、荧光素等标记物的单核苷酸可以被掺入到加尾聚合物中，完成对断裂点的标记。,TUNEL是一种将生化技术与免疫组化相结合，在组织切片或细胞涂片上显示细胞凋亡的新技术。由于不需要模板，每一标记处平均掺入4个左右的标记dUTP，因此敏感性较高。,操作程序（以荧光素-dUTP为例 POD TdT 3-OH端标记） 1. 石蜡切片，二甲苯脱蜡至水 2. 0.3%甲醛配H2O2处理，消除内源性过氧