质粒目的基因插入及引物设计流程.ppt

一.寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列）,1.选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基； 2. 注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长， 则说明CDS序列稳定可用；,将查到的CDS序列粘贴至new DNA file框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该 段序列中的可能酶切位点,二. 登录/order/catalog/product/V652020?ICID=search-product 找到质粒的全序列,同样将该质粒序列粘贴至软件中，比较目的基因和质粒的多克隆位点（即酶切位点）,1.质粒选择酶切位点的原则：目的基因上不能存在将要使用的酶的酶切位点， 否则目的基因会被切掉； 2. 质粒上选择酶切位点应该尽可能短，为将来其他可能的克隆预留位置，如本实验质粒 选择Aflll和BamH1，目的基因上均不存在酶切位点，实验室也买了，可用：,选中目的基因序列，复制,在AflI后至BamHI 前的序列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1,在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HA tag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询： /mol-bio-reference/genetic-code/,三.克隆引物设计 1. 电脑设计：回到NCBI的primer blast，拷贝目的基因CDS序列(共1602个碱基)， 在框中输入|a|和CDS序列，并在Min 和Max分别输入1602（表示blast CDS全部基因）；,2.手工设计： 遵循GC尽量少，Tm尽量小的原则，5端后选20个左右；3端从酶切位点终点往前数59个， 因为除去CDS框的20个碱基后还要包括HA位点和酶切位点序列。,5端引物序列即为atggctgtggagtcccag， 但是还要再加上一段保护碱基AAATATATCTTAAG 最后可得Forward primer为AAATATATCTTAAGatggctgtggagtcccag,tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct,目的基因的20个碱基,3端引物设计的起点（不含BamHI酶切位点）和方向,最后要把引物顺序调整过来，点击“53”既得Reverse primer序列tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct ，同样在5端位置需再加上一段保护碱基AAATATATGGATCC 最后Reverse primer序列为AAATATATGGATCC tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct,构建表达载体的一般流程： 设计primer(如上所述，综合考虑HA，CDS序列)合成引物选择合适的样本细胞 （本实验的UGT1A1为肝脏中存在的一种药物代谢酶，因此最好选择肝脏细胞系），提取 mRNA并逆转录成cDNA用设计的primer扩增目的基因（UGT