课件：克罗诺氏菌检测甘辛.pptx

食品中克罗诺杆菌属（ Cronobacter,原阪崎肠杆菌）检测,国家食品安全风险评估中心 甘 辛,命名演变,阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii） 丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus） 苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis） 莫金斯克罗诺杆菌（C.muytjensii） 克罗诺杆菌基因种1（C.genomospecies 1） 都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis） 都柏林亚种（C.dublinensis subsp.dublinensis） 洛桑亚种（ C.dublinensis subsp.lausannensis） 奶粉亚种（ C.dublinensis subsp.lactaridi）,阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii） 丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus） 苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis） 莫金斯克罗诺杆菌（C.muytjensii） 尤尼沃斯克罗诺杆菌（C. universalis） 都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis） 都柏林亚种（C.dublinensis subsp.dublinensis） 洛桑亚种（ C.dublinensis subsp.lausannensis） 奶粉亚种（ C.dublinensis subsp.lactaridi） 康帝蒙提克罗诺杆菌(C.condimenti),分类变化,2008年,2011年,兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌 周生鞭毛、能运动 无芽孢 隶属于肠杆菌科,克罗诺杆菌属简介,注： ：90-100；() ：75-89%； V ：25-74；()：10 -24； ：0-9,分布及致病性,乳品安全标准（报批稿） 婴儿配方食品 特殊医学用途配方食品 0-6个月龄,我国对婴幼儿食品中该菌的规定,1988年，Muytjens检测了35个国家的141种婴儿配方粉，其中13个国家的20种抽检样品中分离到克罗诺杆菌，占全部样品的14.2%。 2001年4月美国田纳西州发生克罗诺氏菌感染来自于婴幼儿配方粉。 2004年Iversen等调查了82个婴幼儿配方乳粉和404个其他的食品中存在克罗诺氏菌、沙门氏菌和其他肠杆菌的情况，结果发现在婴幼儿配方乳粉、干婴儿食品、奶粉、干酪和其他产品中，克罗诺杆菌检出率分别为2.4%、10.2%、4.1%、和3.2% 2002年香港食物环境卫生署从德国美乐宝HN25奶油粉检出克罗诺杆菌 2002年美国FDA从费蒙特工厂生产的婴幼儿配方粉中检出克罗诺杆菌,克罗诺杆菌在乳粉中的分布,2004年，安徽阜阳发生劣质奶粉引发“大头娃娃”事件，从87份阜阳劣质奶粉样品中检测到11例克罗诺杆菌阳性产品，污染率为12.6%。 2010-2011年各地疾控中心的食源性致病菌监测报告中克罗诺杆菌属的检出情况为，广西梧州市监测的175份食品中检出率为5.26%，江苏宿迁市的891份样品中检出率为2.6%，甘肃定西市对321份市售食品监测中检出率为0.31%，湖南长沙市监测的286份食品中检出率为6.3%。 2013年董晓晖等对300份奶粉和50份非奶粉食品中克罗诺杆菌属进行定量检测，检出率达到6.6%，23个污染样品中有4个样品的菌量大于100 MPN/100g。,我国克罗诺杆菌污染情况,新生儿（低出生体重等免疫力低下） 早产儿 老年人 免疫功能低下的成年人,克罗诺杆菌属的易感人群,1961年Franklin首次报道了2例新生儿感染克罗诺杆菌导致脑膜炎并死亡 1965年丹麦报道了1例新生儿感染克罗诺杆菌引发脑膜炎 1979年Monroe报道了1例新生儿感染克罗诺杆菌引发菌血症 1981年美国印第安纳州1名婴儿感染克罗诺杆菌引发脑膜炎 1983年Muytjens报道了8例婴儿感染克罗诺杆菌引发脑膜炎，6例死亡 1984年Arseni报道了12例早产儿感染克罗诺杆菌引发菌血症,4例死亡 1985年Naqvi报道了1例婴儿感染克罗诺杆菌 1990年Clark报道了2起不相关的院内暴发的新生儿克罗诺氏菌感染事件 1994年法国爆发克罗诺杆菌感染，17例新生儿中8例无临床症状、7例坏死性结肠炎、1例脑膜炎、1例败血症，共3例死亡 2001年4月美国田纳西州发生克罗诺氏菌感染事件 2001年比利时一家医院报道1例新生儿感染克罗诺杆菌引发坏死性小肠结肠炎 2002年耶路撒冷一家医院发生了1例克罗诺杆菌感染事件 2004年法国发生婴幼儿感染克罗诺杆菌，9例病例中2例死亡 2006年美国新生儿感染克罗诺杆菌的比率为8.7/100 000 2010年日本报道了1例克罗诺杆菌导致的新生儿死亡 WHO统计1961-2008年共有120例0-3岁感染克罗诺杆菌的病例，目前国内克罗诺杆菌临床感染病例罕见报道，与我们监测覆盖不够全面有很大关系。,新生儿感染克罗诺杆菌病例,1982年Gimenez报道1名76岁老人感染克罗诺杆菌引起尿脓血症 1985年Pribyl从1名糖尿病患者足部溃疡部分分离出克罗诺杆菌 1991年Hawkins报道了1例克罗诺杆菌引起的成人菌血症 2001年Lai报道了马萨诸塞州立大学医学中心1995年1996年4例成人感染克罗诺杆菌，其中3名死亡 2002年Dennison从1名64岁的外周血管病患者的伤口分离了克罗诺杆菌 2002年Ongradi报道了1名26岁女性感染克罗诺杆菌,成年人感染克罗诺杆菌病例,新生儿： 脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症 死亡率高达40%80% 长期的并发症包括迟发型神经发育、脑积水和永久性的神经损伤等 成年人： 脑卒中、骨髓炎、腹泻、急性胆囊炎、伤口感染以及脓样伴随有导尿管留置和尿路感染患者出现脓毒症、结膜炎和吸入性肺炎,临床表现,2002年国际食品微生物标准委员会（(International Commission of Microbiological Specializations on Food，ICMSF）将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”。 2004年世界粮农组织和WHO经过风险性评估将阪崎肠杆菌和沙门氏菌共同列为婴幼儿配方粉A类致病菌。,1、GB 4789.40-2010 食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验 2、SN/T 1632-2013 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法 SN/T 1632.1-2013 分离与计数 SN/T 1632.1-2013 PCR方法 SN/T 1632.1-2013 荧光PCR方法 3、ISO/TS 22964 Milk and milk productsDetection of Enterobacter sakazakii 2006 4、USFDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 29:Cronobacter,国内外检测方法,USFDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 29:Cronobacter,ISO/TS 22964 Milk and milk productsDetection of Enterobacter sakazakii 2006,SN/T 1632.1-2013 分离与计数,GB4789.40-2010,第一法：阪崎肠杆菌的检验 第二法：阪崎肠杆菌的计数,第一法 阪崎肠杆菌的检验,检验程序,2019/8/31,22,可编辑,将袋装奶粉用75%酒精棉球涂抹消毒袋口，无菌操作开封取样，如使用剪刀和勺子需要提前高压灭菌。称取100g，加入提前预热至45的BPW 900mL，振荡或拍打使奶粉充分溶解和混匀。,一、样品取样,左图：未混合 右图：混合后,1、将混匀后的样品361培养18h2h。 2、将培养后的样品充分混匀，取1mL至10mL mLST-Vm肉汤中，混匀，440.5培养24h2h。,二、前增菌和选择性增菌,100g,900mL,1mL,10mL,1、混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌液1环，分别划线接种于两个DFI平板，361培养24h2h。 2、从DFI培养基上挑取1个5个蓝绿色可疑菌落，划线接种于TSA平板。25 1培养48h4h。,三、分离和鉴定,mLst-Vm利用克罗诺杆菌属耐渗透压的能力通过0.5M的氯化钠在保证克罗诺杆菌属良好生长的同时，抑制其他肠杆菌科细菌。克罗诺杆菌属对万古霉素天然耐药，因此可以有效抑制G+菌的生长。 DFI平板利用克罗诺杆菌属-葡萄糖苷酶水解5-溴-4-氯-吲哚-D吡喃葡萄苷（Xa-GLC），释放的糖苷配基5-溴-4-氯-吲哚在氧存在时形成色素溴-氯-吲哚，从而使菌落呈现出特异性的蓝绿色。,TSA： 25培养后 典型菌落：黄色 阴性对照E. coli ATCC 25922：白色菌落,从TSA平板上挑取菌落接种生化鉴定培养基（国标采用生化培养基），保证无杂菌生长后可以将菌落制备为0.5-0.62个麦氏浓度的菌悬液后滴加，也可以直接穿刺接种，设置阳性对照。,生化鉴定,API 20E和VITEK 2 GN鉴定卡： 目前这两种生化条已在国内外得到广泛应用，在BAM中也收录作为克罗诺杆菌属鉴定的方法。,当评价结果低于good identification时，需要重复试验。对于结果的判定采用标准为非阴即阳，与阴性不同的都属于阳性。,第二法 阪崎肠杆菌的计数,100g,10g,1g,900mL,90mL,9mL,1mL,1mL,1mL,10mL,10mL,10mL,X 3,第一法：综合菌落形态和生化特征，报告每100g（mL）样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。 第二发：综合菌落形态和生化特征，根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数，查MPN检索表，报告每100g（mL）样品中克罗诺杆菌属的MPN值（见附录B中的表B.1）。,结果报告,PCR法和荧光PCR法： 1、从液体增菌肉汤中提取DNA：目前美国USFDA BAM 2012年版方法和SN/T 1632.2-2013以及SN/T 1632.3-2013都是将增菌肉汤离心后直接提取DNA。该方法的优点是可以快速提示克罗诺杆菌属阳性的样品，但缺点因为PCR法无法区别死菌和活菌，因此可能出现PCR结果阳性但无法分离出菌落的情况。,四、快检方法,2、从菌落中提取DNA：从DFI平板接种TSA时同时接种BHA（脑心浸液琼脂）平板， 361培养24h2h，挑取菌落提取DNA。该方法的优点是在获得菌落的同时快于生化鉴定法，另外有文献报道个别克罗诺杆菌属细菌在TSA上不产黄色素，因此容易漏报。缺点是增菌和分离所需时间无法缩短，同时PCR法均要避免污染造成的假阳性。,抵抗力 耐热性 耐酸性（pH0.92下存活与周身菌毛结构有关） 渗透压、干燥（含有大量的海藻糖酶） 形成生物膜 克罗诺杆菌属可以在干燥奶粉中长期存活；一旦形成生物膜将很难彻底清除，同时更容易污染生产设备和环境。,克罗诺杆菌的防控,增值能力 6，21，37分别是13.7h，1.7h，1921min。 克罗诺杆菌属25放置6h该菌的相对危险性可增加30倍；25放置10h可增加30 000倍。 2004年2月FAO/WHO在日内瓦召开的婴幼儿配方粉中克罗诺杆菌属专家研讨会上提出婴幼儿配方粉中微量的该菌（3 CFU/100g）污染也能导致感染的发生。,控制措施,控制原料的质量,加工过程中灭菌,防止灭菌后产品的二次污染,生产设备的控制,防止消费环节被污染,克罗诺杆菌的控制措施,控制原料来源，避免受污