菌剂研发及其对香蕉枯萎病防治效果的研究

I 分类号： 单位代码： 密 级： 学 号： 福建福建农农林大学林大学硕硕士学位士学位论论文文 淡紫拟青霉淡紫拟青霉淡紫拟青霉淡紫拟青霉淡紫拟青霉淡紫拟青霉 FJAT-9041 菌剂研发及其菌剂研发及其对香蕉枯萎病防治效果的研究对香蕉枯萎病防治效果的研究和和 菌剂的研发菌剂的研发 学 科 门 类：农学 一级学科名称：植物保护 二级学科名称：植物检疫 研 究 方 向：有害生物检验检疫 研 究 生：肖马云 指 导 教 师：林乃铨教授 刘波研究员 II II 完 成 时 间：二 O 一二年四月 M.S. Thesis of Fujian Agriculture and Forestry University The study on control effect of Paecilomyces lilacinus FJAT- 9041FJAT-9041against Fusarium wilt in banana and agent reseach and development Discipline: Agriculture First Rank Discipline: Plant Protection Second Rank Discipline: Plant Quarantine Research Field:Pest Inspectiona aAnd qQuarantine Candidate: Xiao Ma Yun Supervisor: Prof. Dr. Lin Naiquan Prof. Dr. Liu Bo Submitted Time: April, 2012 III IV IV 独创性声明独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的 研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的 地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献 的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行 为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有 权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或部分内容， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： I I 目目 录录 第一章第一章 绪论绪论1 1 香蕉枯萎病的发生与危害1 2.香蕉枯萎病的生物防治研究进展.1 2.1 国外研究进展1 2.2 国内研究进展2 3.淡紫拟青霉研究进展.2 3.1 淡紫拟青霉的分类地位及生物学特征2 3.2 淡紫拟青霉的生物防治研究3 3.3 淡紫拟青霉的定殖研究3 4 淡紫拟青霉生物肥药概况.4 5 淡紫拟青霉菌剂研制-固定化细胞技术.4 6 本研究的目的和拟解决的问题5 第二章 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌的抑制作用6 引言6 1 材料与方法6 1.1 试验材料.6 1.2 试验方法.6 1.2.1 不同孢子浓度淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液对香蕉枯萎病病原菌的抑菌效果.6 1.2.2 不同接菌浓度淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液对香蕉枯萎病病原菌的抑菌效果.7 1.2.3 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液不同 pH 抑菌稳定性.7 1.2.4 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液不同温度抑菌稳定性7 1.2.5 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液不同紫外线照射时间抑菌稳定性7 1.2.6 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液不同 NaCL 浓度抑菌稳定性7 1.2.7 数据分析.7 2 结果与分析.7 2.1 不同孢子浓度淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液对香蕉枯萎病病原菌的抑制效果7 2.2 不同接菌浓度淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液对香蕉枯萎病病原菌的抑制效果9 2.3 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液不同 pH 抑菌稳定性11 2.4 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液不同温度抑菌稳定性.13 2.5 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液不同紫外线照射时间抑菌稳定性.15 2.6 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵液不同 NaCL 浓度抑菌稳定性.17 3.讨论.19 第三章 淡紫拟青霉 FJAT-9041 的发酵工艺20 引言20 1 材料和方法.20 1.1 试验材料20 1.2 试验方法20 1.2.1 菌株的活化和种子液的制备.20 1.2.2 50L 发酵罐发酵20 II II 1.2.3 样品采集及处理21 1.2.4 淡紫拟青霉 FJAT-9041 菌液孢子数计数.21 1.2.5 菌丝干重和菌丝湿重的测量.21 1.2.6 pH 的测量.21 1.2.7 粘度值的测量.21 1.2.8 淡紫拟青霉 FJAT-9041 各个时间段发酵液挥发性物质的 GC-MS 分析.21 1.2.8.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 各个时间段发酵液挥发性物质的主要成分分析.21 1.2.8.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 各时间段发酵液挥发性物质在样品中分布的聚类 分析21 1.2.9 数据分析.21 2 结果与分析.21 2.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵过程菌体数的变化.21 2.3 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵过程菌丝湿重和干重的变化.22 2.4 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵过程粘度值的变化23 2.5 淡紫拟青霉 FJAT-9041 发酵过程 pH 值的变化23 2.6 淡紫拟青霉 FJAT-9041 各时间段发酵液挥发性物质 GC-MS 分析24 2.6.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 各时间段发酵液挥发性物质成分分析24 dodecamethyl pentasiloxane.26 十二甲基五硅氧烷26 2.6.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 各时间段发酵液挥发性物质在样品中分布的聚类分析27 Fig2-6Cluster analysis of different secondary metabolites28 3 讨论.28 第四章 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉枯萎病的防治效果30 引言30 1 材料与方法30 1.1 试验材料.30 1.2 试验方法.30 1.2.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉盆栽苗香蕉枯萎病防效的测定30 1.2.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 在香蕉土壤的定殖31 1.2.2.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 在香蕉根际土壤的定殖.31 1.2.2.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 在香蕉根围土壤的定殖.31 1.2.2.3 淡紫拟青霉 FJAT-9041 在香蕉根、茎、叶内的定殖.32 1.2.3 不同浓度淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药对香蕉生长特性的影响.32 1.2.4 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉植株酶活性的影响32 1.2.4.1 香蕉植株超氧化物歧化酶（SOD）的测定32 1.2.4.2 香蕉植株多酚氧化酶（PPO）的测定.32 1.2.4.3 香蕉植株过氧化物酶（POD）的测定33 2 结果与分析.33 2.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉盆栽苗香蕉枯萎病防效的测定.33 2.1.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉苗期生长特性的影响33 2.1.1.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药施用 50 天后对香蕉盆栽苗株高的影响.35 2.1.1.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药施用 50 天后对香蕉盆栽苗茎粗的影响.35 2.1.1.3 淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药接种 50 天后对香蕉盆栽苗叶片数的影响 36 III III 2.1.2.4 接种淡紫拟青霉 FJAT-9041 菌液 50 天后对香蕉盆栽苗株高的影响36 2.1.1.5 接种淡紫拟青霉 FJAT-9041 菌液 50 天后对香蕉盆栽苗茎粗的影响36 2.1.1.6 接种淡紫拟青霉 FJAT-9041 菌液 50 天后对香蕉盆栽苗叶片数的影响37 2.1.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对盆栽苗香蕉枯萎病的防治效果研究38 2.2 不同浓度的淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药对香蕉生长特性的影响.40 2.2.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药对香蕉盆栽苗株高的影响40 2.2.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药对香蕉盆栽苗茎粗的影响41 2.2.3 各个处理淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药施用 60 天后对香蕉盆栽苗叶片数的影 响41 2.3 淡紫拟青霉 FJAT-9041 在香蕉土壤的定殖.42 2.3.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 在香蕉土壤根际土壤的定殖42 2.3.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 在香蕉根围土壤的定殖42 2.3.3 淡紫拟青霉 FJAT-9041 在香蕉根、茎、叶的定殖43 2.4 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉植株酶活性的影响.44 2.4.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉植株超氧化物歧化酶（SOD）的影响44 2.4.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉植株多酚氧化酶（PPO）的影响45 2.4.3 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉植株过氧化物酶（POD）的影响46 3 讨论48 第五章 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉根际土壤微生物群落结构的影响49 引言49 1 材料与方法.49 1.1 试验材料.49 1.2 试验方法49 1.2.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉土壤酶活性的影响49 1.2.1.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉土壤几丁质酶活性的影响.50 1.2.1.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉土壤脲活性的影响.50 1.2.1.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉土壤过氧化氢酶活性的影响.50 1.2.1.4 数据统计分析51 2.结果与分析.51 2.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉土壤几丁质酶活性的影响.51 2.1.1 土壤几丁质酶标准曲线的制作.51 2.1.2 不同处理香蕉土壤几丁质酶活性的变化.51 2.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉土壤脲酶活性的影响.52 2.2.1 土壤脲酶标准曲线的制作.52 2.2.2 不同处理香蕉土壤脲酶活性的变化.52 2.3 淡紫拟青霉 FJAT-9041 对香蕉土壤过氧化氢酶活性的影响.53 3 讨论.53 第六章 淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药生产工艺的研究55 引言55 2.材料和方法.55 2.1 试验材料55 2.2 试验方法55 2.2.1 不同保存条件下淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态.55 2.2.1.1 不同温度下淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态55 IV IV 2.2.1.2 不同含水量的淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态55 2.2.1.3 结果计算.56 2.2.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 的固体发酵.56 2.22.1 组培瓶和玻璃瓶淡紫拟青霉 FJAT-9041 固体发酵.56 2.2.2.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 不同固体发酵载体的筛选.56 2 结果与分析.57 2.1 不同保存条件下淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态57 2.1.1 不同温度下淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态.57 2.2.1 不同含水量的淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态.57 图 6-2 不同含水量的淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态58 2.4 淡紫拟青霉 FJAT-9041 的固体发酵.58 2.4.1 组培瓶和玻璃瓶淡紫拟青霉 FJAT-9041 固体发酵.58 2.4.2 淡紫拟青霉 FJAT-9041 不同载体的固体发酵筛选58 3 讨论.59 第七章 淡紫拟青霉 FJAT-9041 制剂技术研究60 引言60 1 材料与方法.60 1.1 试验材料60 1.2 试验方法60 1.2.1 不同包埋方法的筛选.60 1.2.1.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 的培养.60 1.2.1.2 试验药品的配置60 1.2.1.3 包埋方法60 1.2.1.4 机械性能测试61 1.2.1.5 活菌数测定61 1.2.2 海藻酸钠包埋法不同包埋载体的筛选.61 1.2.2.1 淡紫拟青霉 FJAT-9041 的发酵61 1.2.2.2 不同处理61 1.2.2.3 增殖61 1.2.2.4 机械性能测试61 1.2.2.5 活菌数测定62 1.2.3 不同固化温度对包埋效果的影响.62 1.2.4 不同保存条件对海藻酸钠包埋淡紫拟青霉 FJAT-9041 的活菌数的影响.62 1.2.5 不同包埋条件的优化.62 1.2.5.1 不同包埋时间的优化62 1.2.5.2 不同接种量的优化62 1.2.5.3 不同海藻酸钠浓度的优化62 1.2.5.4 不同 CaCl2 浓度的优化62 1.2.6 海藻酸纳包埋淡紫拟青霉 FJAT-9041 活菌数稳定性的测定.63 2.结果与分析.63 2.1 不同包埋方法的筛选63 2.2 海藻酸钠包埋法不同包埋载体的筛选64 2.3 不同固化温度对包埋效果的影响65 2.4 不同保存条件对海藻酸钠包埋淡紫拟青霉 FJAT-9041 的活菌数的影响65 V V 2.5 不同包埋条件的优化66 2.5.1 不同包埋时间的优化.66 2.5.2 不同接种量的优化.67 2.5.3 不同海藻酸钠浓度的优化.68 2.5.4 不同 Cacl2浓度的优化.70 2.6 海藻酸纳包埋淡紫拟青霉 FJAT-9041 活菌数稳定性的测定71 3 讨论.71 第八章 结论和展望73 1 结论.73 2. 展望.74 参考文献75 个人简历80 致 谢82 第一章 绪论1 1 香蕉枯萎病的发生与危害1 2.香蕉枯萎病的生物防治研究进展.2 2.1 国外研究进展2 2.2 国内研究进展2 3.淡紫拟青霉研究进展.3 3.1 淡紫拟青霉的分类地位及生物学特征3 3.2 淡紫拟青霉的生物防治研究3 3.3 淡紫拟青霉的定殖研究4 4 淡紫拟青霉生物肥药概况.4 5 淡紫拟青霉菌剂研制-固定化细胞技术5 6 本研究的目的和拟解决的问题6 第二章 FJAT-9041 对香蕉枯萎病病原菌的抑菌稳定性7 引言7 1 材料与方法7 1.1 试验材料.7 1.2 试验方法.7 1.2.1 不同孢子浓度 FJAT-9041 发酵液对香蕉枯萎病病原菌的抑菌效果8 1.2.2 不同接菌浓度 FJAT-9041 发酵液对香蕉枯萎病病原菌的抑菌效果8 1.2.3 FJAT-9041 发酵液不同 pH 抑菌稳定性8 1.2.4 FJAT-9041 发酵液不同温度抑菌稳定性.8 1.2.5 FJAT-9041 发酵液不同紫外线照射时间抑菌稳定性.8 1.2.6 FJAT-9041 发酵液不同 NaCL 浓度抑菌稳定性.8 1.2.7 数据分析.8 2 试验结果.9 2.1 不同孢子浓度 FJAT-9041 发酵液对香蕉枯萎病病原菌的抑制效果.9 2.2 不同接菌浓度 FJAT-9041 发酵液对香蕉枯萎病病原菌的抑制效果.10 2.3 FJAT-9041 发酵液不同 pH 抑菌稳定性.12 2.4 FJAT-9041 发酵液不同温度抑菌稳定性15 VI VI 2.5 FJAT-9041 发酵液不同紫外线照射时间抑菌稳定性17 2.6 FJAT-9041 发酵液不同 NaCL 浓度抑菌稳定性19 第三章 FJAT-9041 发酵过程中各参数的变化22 引言22 1 材料和方法.23 1.1 试验材料23 1.2 试验方法23 1.2.1 菌株的活化和种子液的制备.23 1.2.2 50L 发酵罐发酵.23 1.2.3 样品采集及处理23 1.2.4 FJAT-9041 菌液孢子数计数.23 1.2.5 菌丝干重和菌丝湿重的测量.23 1.2.6pH 的测量24 1.2.7 粘度值的测量.24 1.2.8 FJAT-9041 各个时间段发酵液挥发性物质的 GC-MS 分析 24 1.2.8.1 FJAT-9041 各个时间段发酵液挥发性物质的主要成分分析24 1.2.8.2 FJAT-9041 各时间发酵液挥发性物质在样品中分布的聚类分析24 1.2.9 数据分析.24 2 试验结果和分析.24 2.1 FJAT-9041 发酵过程菌体数的变化24 2.3 FJAT-9041 发酵过程菌丝湿重和干重的变化25 2.4 FJAT-9041 发酵过程粘度值的变化26 2.5 FJAT-9041 发酵过程 pH 值的变化.26 2.6 FJAT-9041 各时间段发酵液挥发性物质 GC-MS 分析 .27 2.6.1 FJAT-9041 各时间段发酵液挥发性物质成分分析.27 2.6.2 FJAT-9041 各时间酸发酵液挥发性物质在样品中分布的聚类分析.32 3 讨论.33 第四章 FJAT-904 对香蕉枯萎病防治效果及机理的初步研究34 引言34 1 材料与方法34 1.1 试验材料.34 1.2 试验方法.35 1.2.1 FJAT-9041 对香蕉盆栽苗香蕉枯萎病防效的测定.35 1.2.1.1 FJAT-9041 生物肥药对盆栽香蕉苗苗期生长特性的影响35 1.2.1.2 FJAT-9041 菌液对盆栽香蕉苗苗期生长特性的影响35 1.2.1.3 FJAT-9041 对香蕉盆栽苗枯萎病防效的测定35 1.2.2 FJAT-9041 在香蕉土壤的定殖.36 1.2.2.1 FJAT-9041 在香蕉根际土壤的定殖36 1.2.2.2 FJAT-9041 在香蕉根围土壤的定殖36 1.2.2.3 FJAT-9041 在香蕉根、茎、叶内的定殖36 1.2.3 不同浓度 FJAT-9041 生物肥药对香蕉生长特性的影响36 VII VII 1.2.4 FJAT-9041 对香蕉植株酶活性的影响.37 1.2.4.1 香蕉植株超氧化物歧化酶（SOD）的测定37 1.2.4.2 香蕉植株多酚氧化酶（PPO）的测定37 1.2.4.3 香蕉植株过氧化物酶（POD）的测定38 2.试验结果.38 21 FJAT-9041 对香蕉盆栽苗香蕉枯萎病防效的测定.38 2.1.1 FJAT-9041 对香蕉苗期生长特性的影响.38 2.1.1.1 FJAT-9041 生物肥药施用 50 天后对香蕉盆栽苗株高的影响40 2.1.1.2 FJAT-9041 生物肥药施用 50 天后对香蕉盆栽苗茎粗的影响40 2.1.1.3 FJAT-9041 生物肥药施用 50 天后对香蕉盆栽苗叶片数的影响41 2.1.2.4 接种 FJAT-9041 菌液 50 天后对香蕉盆栽苗株高的影响.41 2.1.1.5 接种 FJAT-9041 菌液 50 天后对香蕉盆栽苗茎粗的影响.42 2.1.1.6 接种 FJAT-9041 菌液 50 天后对香蕉盆栽苗叶片数的影响.42 2.1.2 FJAT-9041 对盆栽苗香蕉枯萎病的防治效果研究.44 2.2 不同浓度的 FJAT-9041 生物肥药对香蕉生长特性的影响46 2.2.1 各个处理 FJAT-9041 生物肥药施用 60 天后对香蕉盆栽苗株高的影响46 2.2.2 各个处理 FJAT-9041 生物肥药施用 60 天后对香蕉盆栽苗茎粗的影响47 2.2.3 各个处理 FJAT-9041 生物肥药施用 60 天后对香蕉盆栽苗叶片数的影响47 2.3 FJAT-9041 在香蕉土壤的定殖48 2.3.1 FJAT-9041 在香蕉土壤根际土壤的定殖.48 2.3.2 FJAT-9041 在香蕉根围土壤的定殖.49 2.3.3 FJAT-9041 在香蕉根、茎、叶的定殖.49 2.4 FJAT-9041 对香蕉植株酶活性的影响50 2.4.1 FJAT-9041 对香蕉植株超氧化物歧化酶（SOD）的影响.50 2.4.2 FJAT-9041 对香蕉植株多酚氧化酶（PPO）的影响51 2.4.3 FJAT-9041 对香蕉植株过氧化物酶（POD）的影响.53 3 讨论54 第五章 FJAT-9041 对香蕉土壤微生态的影响55 引言56 1 材料与方法.56 1.1 试验材料.56 1.2 试验方法56 1.2.1 FJAT-9041 生物肥药对香蕉土壤酶活性的影响.56 1.2.1.1 FJAT-9041 对香蕉土壤几丁质酶活性的影响57 1.2.1.2 FJAT-9041 对香蕉土壤脲活性的影响57 1.2.1.2 FJAT-9041 对香蕉土壤过氧化氢酶活性的影响58 1.2.1.4 数据统计分析58 2.结果与分析.58 2.1 FJAT-9041 对香蕉土壤几丁质酶活性的影响58 2.1.1 土壤几丁质酶标准曲线的制作.58 2.1.2 不同处理香蕉土壤几丁质酶活性的变化.59 VIII VIII 2.2 FJAT-9041 对香蕉土壤脲酶活性的影响59 2.2.1 土壤脲酶标准曲线的制作.59 2.2.2 不同处理香蕉土壤脲酶活性的变化.60 2.3 FJAT-9041 对香蕉土壤过氧化氢酶活性的影响60 3 讨论.61 第六章 FJAT-9041 生物肥药的保存和固体发酵62 引言62 2.材料和方法.62 2.1 试验材料62 2.2 试验方法62 2.2.1 不同保存条件下 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态62 2.2.1.1 不同温度下 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态.62 2.2.1.2 不同含水量的 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态.63 2.2.1.3 结果计算.63 2.2.2FJAT-9041 的固体发酵63 2.22.1 组培瓶和玻璃瓶 FJAT-9041 固体发酵63 2.2.2.2 FJAT-9041 不同固体发酵载体的筛选63 2 试验结果与分析.64 2.1 不同保存条件下 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态.64 2.1.1 不同温度下 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态64 2.2.1 不同含水量的 FJAT-9041 生物肥药中活菌数的存活动态64 2.4 FJAT-9041 的固体发酵65 2.4.1 组培瓶和玻璃瓶 FJAT-9041 固体发酵65 2.4.2 FJAT-9041 不同载体的固体发酵筛选.65 3 讨论.66 第七章 细胞包埋法固定 FJAT-9041 的研究.67 引言67 1 材料与方法.67 1.1 试验材料67 1.2 试验方法67 1.2.1 不同包埋方法的筛选.67 1.2.2 海藻酸钠包埋法不同包埋的筛选.69 1.2.3 不同固化温度对包埋效果的影响.69 1.2.4 不同保存条件对海藻酸钠包埋 FJAT-9041 的活菌数的影响69 1.2.5 不同包埋条件的优化.69 1.2.5.1 不同包埋时间的优化70 1.2.5.2 不同接种量的优化70 1.2.5.3 不同海藻酸钠浓度的优化70 1.2.5.4 不同 CaCl2 浓度的优化.70 1.2.6 海藻酸纳包埋 FJAT-9041 活菌数稳定性的测定70 2.结果与分析.70 IX IX 2.1 不同包埋方法的筛选70 2.2 海藻酸钠包埋法不同包埋的筛选69 2.3 不同固化温度对包埋效果的影响73 2.4 不同保存条件对海藻酸钠包埋 FJAT-9041 的活菌数的影响.73 2.5 不同包埋条件的优化74 2.5.1 不同包埋时间的优化.74 2.5.2 不同接种量的优化.75 2.5.3 不同海藻酸钠浓度的优化.76 2.5.4 不同 Cacl2浓度的优化78 2.6 海藻酸纳包埋 FJAT-9041 活菌数稳定性的测定.79 3 讨论.80 第八章 结论和展望80 1 结论.80 2. 展望.82 个人简历90 致 谢92 I I 摘摘 要要 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的毁灭性 土传病害，造成香蕉产业的巨大损失。本文以淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT- 9041 为基础，研究该菌和生物肥药对香蕉枯萎病的防治效果，并且对该菌的菌剂进行相关 的研究。结果表明： 淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 在不同浓度、不同 pH、不同紫外线照 射时间和不同 Nacl 浓度等不同条件下对香蕉枯萎病病原菌都有较强的的抑菌效果稳定性。 但其中 40处理 30min 对 FJAT-3076 和 FJAT-370 的抑菌率分别 84.38%、85.68%，60 处理可保持部分活性，对 85和 105基本失去活性。 淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 菌液和生物肥药对香蕉枯萎病的盆栽防 效分别是 78.67%和 72.84%，能显著促进香蕉植株根、茎、叶的生长；用量占土壤质量比 为 15%、30%、45%的淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药都能显著促 进香蕉植株根、茎、叶的生长，其中质量比为 15%的淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药对香蕉的根、茎、叶的促长作用最大。淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟 青霉 FJAT-9041 可以在香蕉根际土壤和根围土壤定殖，不能在香蕉植株根、茎、叶内定殖。 淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 菌液和生物肥药能提高香蕉体内 PPO 和 POD 的活性，但对过氧化物酶（POD）活性变化没有影响。 淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 菌液和生物肥药可以提高香蕉土壤的几 丁质酶、脲酶和过氧化氢酶活性。 淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 生物肥药在 4和常温下保存较好；淡 紫拟青霉生物肥药在含水量为 30%和 50%的条件下保存最好。淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫 拟青霉 FJAT-9041 生物肥药在硫酸铵为氮源和蔗糖为碳源的垫料中发酵能力最强。淡紫拟 青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 在分别添加米糠，花生饼粉，大米粉，地瓜干粉， 面粉，淀粉，菜籽粉的垫料中可以发酵，其中在垫料 200g+地瓜干粉 60g 中发酵能力最强， 初始活菌数为 1.0106cfu/g，发酵 8 天后活菌数为 7.5108cfu/g。 海藻酸钠包埋法是包埋淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 最好的方法。 淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 菌液先与多孔淀粉混合的方法形成的载体是 包埋淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 最好的载体。淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡 紫拟青霉 FJAT-9041 在查式培养基中增殖 7 天可以增加淡紫拟青霉 FJAT-9041 淡紫拟青霉 FJAT-9041 的活菌数。 淡紫拟青霉FJAT-9041淡紫拟青霉FJAT-9041固定化小球在4无菌水和常温无菌水中 保存较好。海藻酸钠包埋淡紫拟青霉FJAT-9041淡紫拟青霉FJAT-9041最佳固化温度为4； 单因数试验表明海藻酸钠包埋淡紫拟青霉FJAT-9041淡紫拟青霉FJAT-9041的最佳固化时间 为2h，淡紫拟青霉FJAT-9041淡紫拟青霉FJAT-9041最佳接菌量为25%，最佳海藻酸钠浓度 为5%，最佳Cacl2浓度为12%。淡紫拟青霉FJAT-9041淡紫拟青霉FJAT-9041固定化细胞颗 粒初始活菌数2.63107cfu/g,在4冰箱中保存60天，活菌数为5.5107cfu/g。海藻酸钠和多 II II 孔淀粉包埋对淡紫拟青霉FJAT-9041淡紫拟青霉FJAT-9041有良好的保护作用和增殖作用。 关键词：香蕉枯萎病；抑菌稳定性；防治效果；定殖；生物肥药；海藻 III III Abstract Banana wilt is a destructively soil-borne disease caused by Fusarium oxysporum f.sp.cubense, resulting in a great loss of the banana yield. Based on Paecilomyces lilacinus FJAT-9041FJAT- 9041, the control effect of this fungi and microbial fertilizer against Fusarium wilt and agent of FJAT-9041FJAT-9041 were studied in this paper. The results show that： It is quite stable that Paecilomyces lilacinus FJAT-9041FJAT-9041 has strong inhibitory effect stability against Fusarium oxysporum f.sp.cubense in different condition including pH, ultraviolet time, Nacl concentration , etc. Its inhibition effect against FJAT-3076 and FJAT-370 reached 84.38%and 85.68% ，respectively at 40 for 30min. It partially inhibitory effect against Fusarium oxysporum f.sp.cubense has kept at 60, it almost failed to restrain at 85 or 105. The control efficiency of Paecilomyces lilacinus FJAT-9041FJAT-9041fungi and microbial fertilizer against the Fusarium wilt of potted banana plants was 78.67% and 72.84% .And both significantly promote the growth of roots, stems, leaves. It was effective to promote the growth of banana roots, stems and leaves when the microbial fertilizer takes up of 15%, 30%, 45% of soil, and 15% was best. Paecilomyces lilacinus FJAT-9041FJAT-9041 could colonization in root foundation soil and rhizosphere soil of banana, failed in roots, stems, leaves. The activity level of PPO and POD was enhanced in banana plant, but POD stayed the same. Paecilomyces lilacinus FJAT-9041FJAT-9041 fungi and microbial fertilizer can improve the activity of chitinase, urease and catalase in banana soil. Paecilomyces lilacinus FJAT-9041FJAT-9041 microbial fertilizer can be preserved well at 4 and room temperature; The microbial fertilizer can be preserved best when it contains 30% and 50% of water. Paecilomyces lilacinus FJAT-9041FJAT-9041 microbial fertilizer fermented better when nitrogen source was ammonium sulfate and carbon source was sugar. Paecilomyces lilacinus FJAT-9041FJAT-9041 can zymolysis in stroma cusion material complemented with rice bran, peanut powder, rice powder, pachyrhizu powder, rice powder, flour, starch, rapese powder. 200g stroma cusion material + 60g pachyrhizu powder 60g was zymolysised best of them， the number of alive amount of FJAT-9041FJAT-9041 increased dramatically from 1.0106cfu/g to 7.5108cfu/g. Sodium alginate method is the best way to embedding Paecilomyces lilacinus FJAT- 9041FJAT-9041.The number of Paecilomyces lilacinus FJAT-9041FJAT-9041 has increased in Czapeks medium in 7 days. The best carrier of embeing Paecilomyces lilacinus FJAT- 9041FJAT-9041 is admixture with FJAT-9041FJAT-9041and porous starch first then admixture with sodium alginate; Paecilomyces lilacinus FJAT-9041FJAT-9041 immobilized cell can be preserved well at 4 asepsis water and room temperature asepsis water .The best solid temperature of sodium alginate embeing FJAT-9041FJAT-9041 is 4. Single factor experiment showed that sodium alginate embeing FJAT-9041FJAT-9041 was the best solid time was 2h,the best inoculation amount was 25% ,the best sodium alginate concentration was 5%,the best Cacl2 concentration was 12%.The number of alive amount of FJAT-9041FJAT-9041 increased stability from 2.63107cfu/g to 5.5107cfu/g of the immobilized cell in 4 refrigeratory for 60 days. Sodium alginate and porous starch bembing method has good protection and proliferative effect for Paecilomyces IV IV lilacinus FJAT-9041FJAT-9041. Key Words: Fusarium wilt;Inhibitory effect stability；Control efficiency；Colonization；Microbial fertilizer；Sodium alginate. 第一章第一章 绪论绪论 香蕉为芭蕉科芭蕉属植物，是著名的热带和亚热带水果，全球香蕉产量约 1 亿吨，是 世界上第二大水果作物，产量仅次于柑橘1。我国是世界上生产香蕉的主要国家之一， 2003 年产量 662 万吨，是世界上的第四大香蕉生产国。 1 香蕉枯萎病的发生与危害 香蕉枯萎病又名香蕉巴拿马病、黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的维管束坏死的一种毁灭性真菌病害和典型的土传病害，是国 际检疫对象 2。尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)属于半知菌，肉 座目，镰刀菌属，是一种土壤习居菌3。香蕉枯萎病菌有4个生理小种,目前我国发现的生理 小种主要有1号和4号生理小种4-5。自然条件下香蕉枯萎病菌1号生理小种可感染粉蕉，不 感染香牙蕉；生理小种4号几乎能侵染所有香蕉品种，是目前香蕉栽培品种的主要威胁,我 国香蕉枯萎病主要由生理小种4号侵染引起6。 香蕉枯萎病是土传维管束病害，病菌的厚垣孢子可以在土壤中存活3-5年，以带菌土壤 和染病种苗作为初侵染来源，同时还借助农事操作、雨水或动物的活动传播7，香蕉枯萎 病危害的田块有明显的发病中心8,其主要特征是病株凋萎和维管束变色腐烂6；病原菌侵 染香蕉后产生的典型症状是病害先从下部叶片发生，发病初期叶片边缘变黄，逐渐扩展至 主脉，使整叶枯黄迅速枯死8；病叶叶柄在靠近叶鞘处折曲，叶片下垂；病株除顶叶外， 所有叶片自下而上相继变褐，外围假茎近地处开裂，裂口褐色，植株最后干枯；剖开假茎， 维管束组织变褐、坏死；病株根部木质部导管常出现红棕色病变，并一直延伸至根茎部； 后期大部分根变成黑褐色和干枯9。幼龄蕉树感病后，表现生长不良，植株矮小，叶抽不 出，生长停滞，叶片枯黄，植株甚至枯萎死亡10。 香蕉枯萎病于广泛分布于亚洲、非洲、澳大利亚、南太平洋及热带美洲的香蕉产区11。 实际上，现在所有香蕉种植区都有该病的发生。1967年中国台湾也报道香蕉枯萎病的发生 12，目前香蕉枯萎病在我国广东、广西、海南、福建等香蕉主产区均有发生，并有快速扩 展的趋势，严重威胁着我国的香蕉种植业13。香蕉枯萎病给我国和世界的香蕉生产带来极 大的威胁，曾在20世纪五六十年代造成香蕉历史上最具毁灭性的流行病害, 使得中南美洲4 万hm2 和台湾1200 hm2 蕉园化为平地7。2000年张绍升14等人在福建省漳州粉蕉上首次 发现香蕉枯萎病，经鉴定为1号生理小种,漳州地区因香蕉枯萎病造成1333多hm2粉蕉被毁， 随后泉州、莆田等地也相继发生。香蕉枯萎病造成香蕉产业的损失每年达20%以上15。香 蕉枯萎病的防治研究刻不容缓。 香蕉枯萎病是一种土传病害，防治难度较大，很多学者都针对香蕉枯萎病进行化学药 剂的筛选16-19,室内有些药剂对枯萎病菌有很好的抑制效果，但主要停留在实验室阶段，田 间防治效果也不理想，还没有很有效的化学药剂9；目前生产上通过使用无病组培苗和抗 病品种起到一定的防治效果, 但目前抗病品种周期长，抗病性不稳定 20，短期内难以见效。 利用微生物及其代谢产物、植物提取物等生物农药进行生物防治，使用对人体和生态环境 无害的生防菌剂替代化学农药已成为世界范围内的研究发展方向21-23。人们越来越重视利 用生物防治的方法来防治香蕉枯萎病，并已经成为目前研究的重点。 2.香蕉枯萎病的生物防治研究进展 2 2 2.1 国外研究进展 国外很多学者研究香蕉枯萎病的生物防治取得了一些成果。Perez- vicente 等102试验 证明抗病品种的种植与哈茨木霉菌施用相结合, 对香蕉枯萎病的防治效果可达95%以上。 Sukhada等63认为荧光假单孢杆菌(Pseudomonas fluorescens )对香蕉枯萎病病原菌具有很高 的抑制活性,能定殖于香蕉根系中, 诱导香蕉产生对枯萎病的系统抗性，防治效果明显。 2003 年Ting等10分离到对香蕉枯萎病菌有较强抑制作用的绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa ,粘质沙雷菌Serratia marcescens 和荚壳布克氏菌Burkholderia glumae 。马来西 亚GethaK24等发现紫黑链霉菌株GlO(S.violaeeoniger strain GlO)对香蕉枯萎病4号小种有很 强的拮抗作用，在盆栽试验中施用浓度为108cfu/ml的G1O菌剂对香蕉枯萎病有53%的防治 效果。Paanlswami等人25认为哈兹木霉(Trichoderma harzianum)对香蕉枯萎病的防治效果为 48%-51%,链霉菌(Streptomyces violaceusniger)菌株产生抗生素抑制香蕉枯萎病菌的生长。 NEL等报道了利用非致病性F. oxysporum菌株防治香蕉枯萎病26。还有C.Abadie等研究表明， 利用一种覆盖植物(cover-plant)：Pueratia avanica对引起棕榈树枯萎病的尖孢镰刀菌进行防 治,结果表明在种植有该植物的土壤中，棕榈树发生枯萎病的比例要比在没有种植该植物的 土壤中的棕榈树的发病比例要低得多，也可以参考这方法进行香蕉枯萎病的防治。 李庚花27, Weindling28, Ting 2