课件：链霉素真菌产生.ppt

第二章 微生物发酵制药技术,2019,-,1,发酵工程是一门具有悠久历史，又融合了现代科学的技术，是现代生物技术的组成部分。,2019,-,2,第一节 微生物发酵概论,一、微生物发酵的概念及发展史,两千多年前，用豆腐上生长的霉治疗疮。 汉书记载用丹曲治疗赤白痢下等症。 宋真宗年代，利用人痘防天花，1796年英国琴纳利用牛痘防天花。 1857年巴斯德提出著名发酵理论：“一 切发酵过程都是微生物作用的结果。” 1874年robert观察到灰绿青霉生长培养基不易染菌，1876年报道霉菌溶解细菌。 1877年提出微生物拮抗,2019,-,3,1885年cantani利用变形杆菌菌悬液治疗结核病。 1899年emmerich和low分离得到绿脓菌酶治疗白喉。 1923年法国研究出卡介苗。 1924年从放线菌中发现白放线菌素。 1929年Flemming爵士发现了青霉素，增加一大类新产品-抗生素。 20世纪40年代，以获取细菌的次生代谢产物-抗生素为主要特征的抗生素工业成为微生物发酵工业技术的支柱产业。 20世纪50年代，氨基酸发酵工业又成为微生物技术产业的又一个成员，实现了对微生物的代谢进行人工调节，这又使微生物技术进了一步。,2019,-,4,20世纪60年代，微生物技术产业又增加了酶制剂工业这一成员。 20世纪70年代，为了解决由于人迅速增长而带来的粮食短缺问题，进行了非碳水化合物代替碳水化合物的发酵，如利用石油化工原料进行发酵生产，培养单细胞蛋白，进行污水处理，能源开发等。 80年代以来，随着重组DNA技术的发展，可以按人类社会的需要，定向培养出有用的菌株，这为微生物发酵技术引入了遗传工程的技术，使微生物技术进入了一个新的阶段。 目前，人们把利用微生物在有氧或无氧状态下生命活动来制备微生物菌体或其它代谢产物的过程统称为发酵。,2019,-,5,二、微生物发酵制药研究的内容,微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性技术科学。 研究内容包括：微生物制药用菌的选育、发酵以及产品的分离和纯化工艺等。 主要讨论用于药物发酵的各种微生物来源和改造、微生物药物的生物合成和调控机制、发酵工艺与主要参数的确定药物发酵过程的优化控制、质量控制等。,2019,-,6,1.微生物菌体发酵 是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。用于面包制作的酵母发酵及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白发酵是比较传统的菌体发酵工业。新的菌体发酵可用来生产药用真菌，如香菇菌、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌、与天麻共存的密环菌等药用菌。 2.微生物酶发酵 酶普遍存在于动物、植物和微生物中。因为微生物种类多、产酶的品种多、生产容易和成本低等特点，所以目前工业应用的酶大多来自微生物发酵。 3.微生物代谢产物发酵 微生物代谢产物很多。在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质和糖类等是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。,三、微生物发酵的类型（发酵药物来源）,2019,-,7,4.微生物的转化发酵 微生物的转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、氨化反应、脱氨反应等。 5.生物工程细胞的发酵 是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”，细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵。此类发酵的产物多种多样，如用基因工程菌生产胰岛素、干扰素等。,2019,-,8,四、微生物发酵药物的分类 抗生素类药物 维生素类药物 氨基酸类药物 核酸类药物 酶与辅酶类药物 酶抑制剂 免疫调节剂 甾体类激素,P16页,2019,-,9,1942年，Waksman首先定义： 抗生素是微生物在其代谢过程中所产生的、具有抑制它种微生物生长及活动甚至杀灭它种微生物性能的化学物质。,2019,-,10,1. 抗生素类药物的分类,生物来源 化学结构 作用对象 作用机制,2019,-,11,2019,-,12,根据抗生素的生物来源分类：,（1）放线菌产生：链霉素 （2）真菌产生：青霉素 （3）细菌产生：放线菌素 （4）植物及动物产生：蒜素、黄连素,2019,-,13,1950至80，我国译为抗菌素,2019,-,14,1980年后，抗肿瘤、抗寄生虫等抗生素的不断发现，超出对微生物作用范围，又改译为抗生素。,2019,-,15,1947年,1948年,1950年,1952年,1953年,2019,-,16,根据抗生素的化学结构分类： （1）-内酰胺类抗生素 青霉素、头孢菌素、硫霉素、亚胺培南,2019,-,17,（2）氨基糖苷类抗生素 链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素,2019,-,18,（3）大环内酯类抗生素 红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素,2019,-,19,（4）四环类抗生素 四环素、金霉素、土霉素,2019,-,20,（5）多肽类抗生素 多粘菌素、放线菌素、杆菌肽,2019,-,21,（6）多烯类抗生素 两性霉素、曲古霉素、制霉菌,2019,-,22,（7）蒽环类抗生素 柔红霉素、阿霉素、正定霉素,2019,-,23,（8）苯羟基胺类抗生素 氯霉素、甲砜氯霉素 （9）环桥类抗生素 利福霉素 （10）其他抗生素 磷霉素、创新霉素,2019,-,24,根据抗生素的作用机制分类 抑制细菌壁合成： 青霉素 影响细胞膜功能： 多烯类抗生素 抑制核酸合成： 如影响DNA结构的博来霉素、丝裂霉素C及柔毛霉素等； 抑制蛋白质合成： 四环素、氯霉素、链霉素 抑制生物能作用： 如抑制电子转移的抗霉素(antimycin)、抑制氧化磷酸化作用的短杆菌肽S(gramicidin S)和寡霉素(o1igomycin)等。,2019,-,25,维生素B2 维生素C -胡萝卜素,2 .维生素,-胡萝卜素,2019,-,26,3 .氨基酸,目前大部分氨基酸可用发酵法生产,4 .核酸类药物,如肌苷酸，腺苷酸，肌苷，腺苷等,2019,-,27,5. 酶与辅酶类药物,链激酶、L-天冬酰胺酶,6.酶抑制剂,7.免疫调节剂 8.甾体类激素,克拉维酸、洛伐他汀,2019,-,28,微生物来源的其他活性物质 酶抑制剂: 亮肽素 bestatin (蛋白酶） 免疫抑制剂：环孢菌素A 羟基-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂,2019,-,29,利用工业微生物发酵生产过程中，决定生产水平高低最主要的因素有三个： 生产菌种 发酵工艺 后提取工艺,第二节 制药微生物与产物的生物合成,2019,-,30,一、制药微生物的选择 1.样品的采集与处理(土壤、海洋) 2.分离方法（稀释法、膜分离法） 3.活性测定（琼脂扩散法),2019,-,31,1自然选育:单菌落分离 依据自发突变原理，通过不断分离筛选，除去衰变菌落，选择高产菌，达到强化、复壮、稳定生产目的。 方法：（1）平板划线法 （2）稀释平板法,一、菌种的选育与保藏,二、制药微生物菌种的选育,2019,-,32,自然选育的具体步骤,1、单孢子悬浮液的制备 2、分离及单菌落培养 3、筛选（初筛、复筛）,2019,-,33,（二）诱变育种 1、制定筛选目标 高产 生长速度快 消除色素或无益成分 能有效利用廉价发酵材料 改善发酵中的某些缺陷,2019,-,34,2、制定筛选方案 （1）诱变过程： 出发菌种斜面 单孢子悬浮液制备 孢子计数 单菌落分离 （2）筛选过程 传种斜面 留种保藏菌种 筛选高产菌株,2019,-,35,诱变育种的步骤：,原始菌种,纯化,斜面/肉汤培养,单孢子/单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异，挑单菌落,良种保藏,原菌种特性鉴定,2019,-,36,诱变育种的基本过程：,选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验,2019,-,37,3、突变的诱发 （1）出发菌株的选择 :稳定性; :具备某种优良性状的菌株 :对诱变剂敏感; :生理状态及生长时间 （2）诱变处理: 化学诱变；物理诱变;生物诱变,2019,-,38,利用物理因素（如射线、射线、紫外线、激光等） 化学因素（如亚硝酸、硫酸二乙酯等）来处理生物，使生物发生基因突变。 生物诱变 病毒（Rous肉瘤病毒） 在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。（亚硝基胍）,2019,-,39,突变株筛选一般进程如图所示,第三第四轮同第二轮,第三第四轮同第二轮,2019,-,40,4 变异菌的一般筛选方法,随机筛选；半理性化筛选 平皿快速检测法 变色圈法 透明圈法 抑菌圈法 梯度平板法 摇瓶培养法,2019,-,41,3、现代菌种选育技术 ：杂交育种 ：原生质体融合 ：基因工程技术,2019,-,42,三制药微生物菌种的保藏,（1）保存目的：防止退化 （2）菌种退化防止方法 防止基因突变：如低温保藏 制作平行的菌种斜面，少传代 分离单菌落，自然筛选 选择合适的培养条件,2019,-,43,返回本节,2019,-,44,（4）菌种保藏方法： 定期移植保藏法 液体石蜡封藏法 砂土管保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 低温冻结保藏法 谷粒保藏法,2019,-,45,几种常用菌种保藏方法的比较,2019,-,46,(一)斜面低温法,把培养好的斜面菌种放在46冰箱中处保存，定期移植，一般13个月移植一次(视菌种特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植法保藏细菌。,2019,-,47,缺点： 即容易发生遗传变异； 连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。 一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。 优点：简单易行,2019,-,48,(二)石蜡油低温保藏法,本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-44下。,2019,-,49,2.矿油保藏法,无菌检验,返回本节,2019,-,50,返回本节,2019,-,51,具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121高压蒸汽灭菌12h，将其放烘箱中(160左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm左右为宜。,2019,-,52,缺点：液体石蜡法不适用于所有的菌种。另外可能需多次移种. 优点：方法简便、保藏期比单纯斜面低温保藏期长。,2019,-,53,(三)砂土保藏,微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生产中较常用的菌种保藏方法。,2019,-,54,方法,1) 砂土的制备 2）菌种准备 3）埋砂土管 4）保藏,2019,-,55,也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽真空干燥。这时管内砂土松散，表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂，于4下保存。,2019,-,56,(四)真空冷冻干燥法,真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素。 不适用于霉菌、菇类、藻类 对病毒、细菌、放线菌、酵母等各类微生物都适用 冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。 还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。,2019,-,57,(1)保护剂的选择及制备（脱脂牛奶或马血清） (2)菌种准备及分装（菌种为纯种，菌龄以稳 定期为好，孢子是新鲜的。 ） (3)制备菌悬液 (4)预冻 即放在-30 - 40下冻结20 60min。 (5)干燥 干燥箱温度控制在-30以下，并尽快使真度达到66Pa以下。 (5)熔封 (5)检验保藏 注意事项,2019,-,58,五、液氮超低温保存,本方法是近年推广使用的一种菌种保存法。大多数微生物都可用此法长期保存。工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。 液氮保存的原理是微生物在-130以下温度时，它的新陈代谢作用停止，化学反应也消失，而液氮温度可达-196，在这种情况下可以长期保存。,2019,-,59,液氮超低温保存,1.保护剂 与冷冻干燥保存一样，液氮保存菌种也需要有保护物质，可以用10%的甘油，使用方便、效果好，但有些菌对甘油敏感，效果不佳，可选用其他保护剂，糖类也可作为一种保护剂，但浓度适当加以控制。,2019,-,60,液氮超低温保存,2.操作程序 (1)安瓿管 一般要求用95%料或GG17的玻管制作，以能承受巨大的温差变化而不破损，大小根据需要而定。在管壁上书写菌号，160烘干，加棉塞灭菌备用。 (2)菌种准备 在最适培养基斜面上培养得到健壮菌种，制成悬浮液，如为不产孢子的真菌，则采用斜面或液体振荡培养，制成菌丝片段。将菌悬淮分装至灭菌安瓿管中，每管0.20.5ml，然后用火焰将安瓿熔封。,2019,-,61,液氮超低温保存,3)冻结 将熔封后的安瓿管入大慢速冻结器上，以每分钟下降1的速度冷冻，当安瓿管温度下降至-35时，即可把安瓿管移入液氮内作长期保藏。 (4)菌种的复苏培养 直至全部溶化为止，当溶化后即开启安瓿移至培养基内培养，操作时应特别注意安全，防止爆炸或冻伤，不宜戴线手套，要戴皮手套操作。,原则：慢冻快融,2019,-,62,(六)低温冻结保藏法(补充),本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用用无菌水制成高浓度的菌悬液(1081010/ml)。取1ml灭菌甘油放入与菌悬液充分混匀，使甘油浓度约为10%，于-20下冻存。,2019,-,63,（七）谷粒（麸皮）保藏法 1）麦粒泡涨后灭菌 2）菌悬液接种培养 3）减压干燥低温保藏,2019,-,64,1.保藏菌种效果最为有效的方法有 方法和 方法; 2.菌种保藏温度为4C的保藏方法有 、 和 。,真空冷冻干燥,液氮超低温保存,砂土管保藏法,石蜡油保藏法,斜面低温保藏法,2019,-,65,3在菌种保藏机构中，ATCC表示( ) 普通微生物保藏中心 抗生素菌种保藏中心 美国典型菌种保藏中心 英国国家典型菌种保藏所 医学微生物菌种保藏管理中心,c,2019,-,66,几种常用菌种保藏方法的比较,2019,-,67,四、微生物代谢产物的生物合成 概念：初级代谢产物 次级代谢产物 （一）微生物生物合成的初级代谢产物 （二）微生物生物合成的次级代谢产物,2019