课件：白细胞抗原系统检测PPT课件.ppt

第四章 白细胞抗原检测,严力行,目 录,第一节 HLA血清学检测 HLA抗原检测 HLA抗体检测 第二节 HLA细胞学检测 第三节 HLA分子生物学检测 HLA的分子生物学检测方法 HLA常见基因分型方法比较 HLA分型模棱两可结果的原因及其对策 第四节 粒细胞抗原抗体检测,第一节 HLA血清学检测,重点提示,HLA抗原检测 掌握微量淋巴细胞毒实验的原理及其影响因素 HLA抗体检测方法 淋巴细胞毒方法 流式细胞仪方法 ELISA方法 Luminex检测技术 掌握不同方法的原理及其优缺点,微量淋巴细胞毒试验,HLA抗原的血清学分型方法 用一系列已知的抗HLA标准分型血清来检测未知淋巴细胞表面的HLA抗原型别 微量淋巴细胞毒实验原理 基于抗原抗体反应 抗原抗体免疫复合物在补体的作用破坏细胞膜 利用染料或其它方法鉴定和区分死活细胞 计分法：NIH计分法,HLA抗血清的来源,HLA抗体血清来源 同种免疫刺激产生HLA同种抗体 HLA抗原免疫刺激动物 杂交瘤技术 人群存在的天然抗体,微量淋巴细胞毒试验的影响因素,HLA抗血清 抗血清来源和抗体种类、抗血清效价、抗血清特性、抗血清质量 淋巴细胞 淋巴细胞活性 、淋巴细胞纯度、淋巴细胞数量、淋巴细胞上抗原表达异常 孵育时间和温度 补体活性 染色和固定时间,血清学抗原分型方法评价,血清学方法抗原分型 检测HLA-类和类抗原 检测HLA-类抗原相对容易 检测HLA-类抗原需要分离和纯化淋巴细胞 易受多种因素影响 其错误率相对较高 HLA血清学某一座位上只能检测到一个抗原，而基因分型存在两个不同等位基因，应考虑到无效等位基因,HLA抗体检测,补体依赖的淋巴细胞毒方法（CDC） 采用淋巴细胞作为靶细胞抗原 易受多种因素影响，检测敏感性最低 ELISA 方法 ELISA方法能检测HLA-I和HLA-II抗体 流式细胞术 采用淋巴细胞作为靶细胞抗原 结合荧光检测技术特点 Luminex检测技术 结合荧光流式细胞仪和免疫标记技术 可区分HLA-I和HLA-II抗体 可鉴定抗体的属性和强度,HLA抗体检测,Luminex检测技术 以包被抗原的微球磁珠作为靶细胞 每种磁珠上包被一种抗原 多种磁珠可以在同一体系内反应 待测血清与磁珠孵育 存在HLA抗体时，形成抗原-抗体复合物 加入荧光标记的抗人IgG抗体 形成抗原-抗体-荧光标记抗体复合物 Luminex仪测定微球磁珠上的荧光值 判定HLA抗体的强度和特异性 微球磁珠荧光值大小 每种磁珠的反应特性,第二节 HLA细胞学检测,重点提示,掌握下列方法的基本原理及其应用 混合细胞培养方法（mixed lymphocyte culture，MLC） 纯合分型细胞（homozygote typing cell,HTC） 预致敏淋巴细胞试验（primed lymphocyte test,PLT）,混合淋巴细胞培养,混合淋巴细胞培养（MLC） 二个无关个体的淋巴细胞在体外混合一起培养 二者组织相容性抗原不同，互相刺激对方的T细胞发生增殖 增殖反应强度与组织相容性抗原的差异程度成正比 转化的淋巴母细胞表现为细胞体积增大、核内DNA和RNA合成增加 MLC 用于HLA-D抗原分型 实体器官移植前的快速相容性检测 分为双向MLC和单向MLC,混合淋巴细胞培养,双向MLC 双方的淋巴细胞互相刺激而增生、转化，即双方的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞 抗原相同或相容，则刺激作用很小，细胞无变化 抗原不相容，则刺激作用大，细胞被活化并产生增殖 单向MLC 一方的淋巴细胞用X线照射或用丝裂霉素C处理 丧失增殖反应能力而仍保留其抗原刺激效应 MLC只有一方淋巴细胞发生增殖反应，故可了解单一个体淋巴细胞的刺激强度和应答程度,纯合细胞分型方法,纯合细胞分型方法（也称为阴性分型） 已知HLA-Dw型别的经灭活的纯合子细胞作为刺激细胞 待检细胞作为反应细胞 两种细胞进行单向混合淋巴细胞培养 若不发生或仅发生弱的增殖反应 表明受检细胞具有与纯合子分型细胞相同的HLA-Dw型别，它可能为特定HLA-Dw型的纯合子或杂合子 发生增殖反应 表明受检细胞不具有纯合子细胞拥有的HLA-Dw型别,预致敏淋巴细胞（PL）,预致敏淋巴细胞（PL） 仅对一种单体型具有识别增殖能力，而处于静止状态的小淋巴细胞 作为应答细胞参与了初次MLC反应，经过增殖后又回到小淋巴细胞 遇到相应抗原刺激后，迅速发生淋巴细胞转化和增殖,预致敏淋巴细胞试验,预致敏淋巴细胞试验（又称为阳性分型法) PL细胞作为已知的分型细胞 待检淋巴细胞作为刺激细胞 待检淋巴细胞分别与一系列的预致敏淋巴细胞进行单向MLC 待检细胞与预致敏淋巴细胞预先识别的抗原相同，预致敏淋巴细胞会迅速增殖 预致敏淋巴细胞分型试验是用阳性反应作为判定标准,第三节 HLA分子生物学检测,重点提示,HLA的分子生物学检测方法 掌握PCR-SSP、PCR-SSO、Luminex检测技术、基因芯片、PCR-SBT的基本原理 掌握HLA常见基因分型方法的特点及其适用范围 HLA高分辨分型中模棱两可结果的原因及其对策 明确其形成原因 掌握4种常见方法的原理及其应用,HLA分子生物学检测,HLA基因分型技术主要方法 PCR序列特异性引物（PCR sequence specific primer, PCR-SSP） PCR序列特异性寡核苷酸探针技术（PCR sequence specific oligonucleotide probe, PCR-SSO） Luminex检测技术 基因芯片 核苷酸序列测定法（PCR sequence based-typing，PCR-SBT）,PCR序列特异性引物,PCR序列特异性引物（PCR-SSP） 根据HLA等位基因核苷酸碱基序列的差异性，设计出一系列特异性引物 引物3端最后一个碱基是否与其等位基因DNA模板配对起决定作用 根据多对引物扩增的结果可以指定HLA基因型 方法操作简单，快速耗时较短，结果判断简便 有低分辨和高分辨分型试剂，为实验室常用的方法之一 可能出现假阳性带或漏带现象 某些罕见的HLA等位基因存在错误结果,PCR序列特异性寡核苷酸探针,PCR序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO) 利用核酸互补的杂交技术 特异性引物扩增目的DNA片段 PCR扩增产物与特异性探针进行杂交 酶促反应体系或显色（影）溶液进行显色 无颜色显示 基因片段与探针不互补 显示颜色 基因片段与探针互补 根据多个探针杂交信号结果进行HLA分型指定,Luminex检测技术,Luminex检测技术 原理是利用核酸互补的杂交技术 每一种微球上只固定一种已知序列的特异性探针 利用特异性引物扩增目的DNA片段 PCR扩增产物与多种微球在同一孔内进行特异性杂交 杂交后加入荧光显色剂 Luminex检测仪绿色激光束检测杂交信号 Luminex检测仪红色激光束区分探针的种类 扩增基因片段与探针不互补，在微球上无荧光显示 扩增基因片段与探针互补，在微球上有荧光显示 根据荧光值强度大小可以判定待测片段是否与探针互补,基因芯片技术,基因芯片技术 技术原理是根据核酸互补的杂交技术，并结合激光共聚焦荧光检测系统特性 在特定载体（玻璃、硅等）上高密度有序地排列特定寡核苷酸片段作为探针 对待检标本HLA基因片段进行扩增并荧光标记 将待测标记的HLA基因片段与特定探针进行杂交 基因片段与探针不互补，该探针位置无荧光显示 基因片段与探针互补，该探针位置可显示荧光 通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，根据荧光值强度大小可以判定待测片段是否与探针互补,核苷酸序列测定法,核苷酸序列测定法（PCR-SBT） 扩增目的DNA片段 对扩增片段进行测序分析 指定HLA等位基因型别 根据测序序列中核苷酸多态性位点碱基情况，与已知可能的等位基因的序列进行比较 直接检测基因的核苷酸序列 属于高分辨方法，结果准确性最高 直接双链测序过程中存在模棱两可基因型结果,2019/8/5,26,可编辑,新一代测序技术,新一代测序（NGS）技术 市场上有多种技术平台，其测序原理上存在差异 NGS已应用于HLA分型 其关键在于如何系统建立好HLA位点的DNA文库 片段扩增和测序步骤则取决于所用的技术平台 应用于HLA-I和HLA-II位点分型 单链测序结果 NGS进行HLA分型存在一定的偏差,HLA常见基因分型方法比较,模棱两可结果产生的原因,PCR-SSP的模棱两可结果 PCR-SSP方法针对同一座位上不同等位基因碱基多态性位点设计引物 引物可特异性针对单一或多个等位基因 只扩增某特定的单一等位基因 可直接指定特定单一等位基因 引物对常扩增HLA某一座位数个等位基因 存在多种可能性 PCR-SSP方法可产生一定的模棱两可分型结果 采用不同引物对的组合方式来指定或排除某个等位基因 等位基因数量较多而且引物大多针对多个等位基因,模棱两可结果产生的原因,PCR-SSO的模棱两可结果 探针的序列决定其特异性 部分探针只与某一等位基因序列互补杂交 标本与该探针杂交可明确无误地指定相应特定等位基因 绝大多数探针能够与多种等位基因序列互补杂交 无法单纯依靠这种探针进行等位基因指定 探针反应格局表通过数理逻辑关系指定HLA基因型 大量探针往往针对多个等位基因，错综复杂的杂交格局，导致产生模棱两可的分型结果,模棱两可结果产生的原因,PCR-SBT的模棱两可结果 双链测序反应得到的序列是两个等位基因序列的组合 测序获得的序列与多种等位基因的组合序列完全匹配 有三种情况可能引起模棱两可的结果 测序区域未包括这些等位基因核苷酸的区分点 A*74:01和A*74:02仅在第1号外显子存在差别(第67位) 大多数等位基因未测定全部外显子序列 HLA-A*02:08、HLA-A*03:06缺乏第4外显子序列 多种等位基因组合在测序区域内具有相同的杂合序列 DRB1*03:01:01G+DRB1*13:32、DRB1*03:06+DRB1*13:93和DRB1*03:12+DRB1* 13:40的组合在2号外显子表现为完全相同的杂合序列,模棱两可结果区分的策略,模棱两可结果区分的方法 常见及确认等位基因原则（Common alleles and well documented alleles，CWD） 结合多种方法结果进行综合判断 改用其它厂家的试剂 增加测序的范围或杂交的探针数 采用单链DNA抽提技术 采用单链扩增技术 采用组特异性测序引物技术 克隆转染后形成单链后检测,CWD原则,HLA等位基因定义为三大类 常见等位基因（Common alleles） 指那些在参考群体中频率大于0.001的等位基因 确认等位基因（Well-documented alleles） 至少在五个独立非亲缘个体中或者三个独立非亲缘个体中并伴有特定的单体型被检测到的等位基因 罕见等位基因（Rare alleles) 除常见等位基因和确认等位基因以外的所有等位基因 它们的频率很低,CWD原则,CWD原则 CWD原则分型中将常见等位基因和确认等位基因合并为CWD,当模棱两可的等位基因组合中出现CWD等位基因可能需要进一步区分，而出现罕见等位基因组合，其临床分型中实际意义有限，可予以排除,单链DNA抽提技术,单链DNA抽提技术将个体两个等位基因进行分离 根据等位基因序列设计生物素标记的特异性探针（仅与某一等位基因互补） 探针与标本基因组DNA进行杂交反应 杂交后将形成单一等位基因DNA/特异性探针复合物 加入链亲和素标记磁珠，将形成单一等位基因DNA/特异性探针/磁珠复合物 洗涤后溶液中只含有单一等位基因DNA/特异性探针/磁珠复合物,单链DNA抽提技术,单链分离技术 探针结合杂交互补 选择性获取单体型 商业产品 HLA-C*01:02 Biotin-CTC CAT gAA gTA TTT CTT CA,图为单链抽提C*01:02后测序的一段序列,单链扩增技术,该技术原理类似于PCR-SSP 选择合适的引物只扩增个体两个等位基因的特定等位基因 比对序列 设计特异性引物 重点在于引物序列 TGGCGCCCCGAACCCTCG,图为单链扩增A*24:02后测序的一段序列,组特异性测序引物技术,该技术原理利用特异性引物进行测序反应 在测序过程中设计特异性的测序引物 该引物只能与某一个等位基因的序列互补 该引物测序将得到与引物序列互补的某个特定等位基因的序列 A-98T CACTCCATGAGGTATTTCTT A-98A CACTCCATGAGGTATTTCTA,图为A*02:01,11:01用特异性引物测序后的比较,第四节 粒细胞抗原抗体检测,重点提示,掌握粒细胞抗原、抗体检测血清学诊断方法的原理 粒细胞凝集试验 粒细胞免疫荧光试验 流式细胞技术 单克隆抗体粒细胞抗原捕获试验 ELISA方法 掌握HNA系统基因分型技术原理及其适应范围 PCR限制性片段长度多态性 PCR序列特异性引物 PCR直接测序法 多重SNaPshot 技术,粒细胞抗原、抗体检测诊断方法,粒细胞凝集试验（GAT方法） 分离新鲜的粒细胞 在Terasaki微量板上进行实验 待测粒细胞与标准抗血清反应后或标准粒细胞与待检血清反应后在显微镜下观察粒细胞凝集情况 依据细胞凝集情况来判定抗原或抗体的特性 早期建立的方法，操作简单 方法灵敏度、特异性都不高 HLA抗体和某些高滴度的免疫复合物会导致假阳性结果,粒细胞抗原、抗体检测诊断方法,粒细胞免疫荧光试验（GIFT） 直接法用于检测粒细胞抗原 荧光标记的粒细胞抗体与待检粒细胞反应 有相应的抗原存在时可形成抗原抗体反应 通过荧光显微镜检测荧光的情况 间接法用于检测粒细胞抗体或抗原 分离出新鲜的粒细胞与待检血清反应 存在相应抗体时可形成抗原抗体结合物 洗涤后加入荧光标记的抗人IgG反应，继续形成抗原-抗体-荧光标记抗人IgG结合物，洗涤后通过荧光显微镜检测荧光的情况 敏感性、特异性均优于GAT法 需要荧光显微镜，实验干扰因素较多,粒细胞抗原、抗体检测诊断方法,流式细胞技术 检测粒细胞抗原或抗体 以抗体检测为例阐述其原理 将粒细胞与待检血清进行反应 存在相应抗体时可形成抗原抗体结合物 洗涤后加入荧光标记的抗人IgG-Fc、IgM-Fc 继续形成抗原-待检抗体-荧光标记抗人Ig结合物 通过流式细胞计数仪检测荧光的情况 该方法敏感性、特异性较好,粒细胞抗原、抗体检测诊断方法,单克隆抗体粒细胞抗原捕获试验( MAIGA方法) 粒细胞与待检血清反应，存在相应抗体可形成抗原抗体复合物 加入特定的单克隆抗体，形成单克隆抗体-抗原-抗体三联复合物 细胞裂解离心获取上清液（含三联复合物），将其加入到包被特定抗体的ELISA板微孔内反应，可形成包被抗体-单克隆抗体-粒细胞抗原-待测抗体复合物 洗涤后加入酶标记的抗人IgG抗体形成包被抗体-单克隆抗体-粒细胞抗原-待测抗体-酶标抗体复合物 显色剂比色分析，根据显色程度判定抗体情况,粒细胞抗原、抗体检测诊断方法,ELISA方法 特异性单克隆抗体包被的微板 加入粒细胞抗原和待检血清反应 存在相应抗体可形成包被抗体-抗原-待测抗体复合物 加入酶标记的抗人IgG形成包被抗体-抗原-待测抗体-酶标抗体复合物 加显色剂进行比色分析 根据显色程度判断抗体的有无和强度 ELISA方法敏感性和特异性较好,HNA系统基因分型技术,PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) PCR扩增目的DNA片段，产物采用合适的限制性内切酶消化切割成不同大小片段，电泳后进行分辨 HNA不同等位基因的酶切图谱不同 PCR-RFLP方法简便，分型时间较短 已成功用于HNA-4a 和-5a的分型 PCR序列特异性引物（PCR-SSP） 根据HNA系统等位基因核苷酸碱基序列差异性设计引物 引物3端碱基与等位基因的特异性碱基相匹配 根据PCR 产物的有无进行等位基