αsynuclein蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制

厦门大学 博士学位论文 -synuclein蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 姓名：庄江兴 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：陈清西 20090901 u - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 摘要 酪氨酸酶( E C 1 1 4 1 8 1 ) 是一种广泛存在于自然界中含铜的金属氧化酶， 它具有单酚酶活性，可以将酪氨酸羟化形成L 多巴( L D O P A ) ，也具有二酚酶活 力，将L 多巴氧化成多巴醌。它是生物形成黑色素合成的关键酶，决定了皮肤和 头发色素的颜色。酪氨酸酶的异常表达引起了各种各样的皮肤病，如老年斑及光 照损伤等。它还与人脑中的神经黑色素形成及神经退行性病变相关的帕金森病有 关，因此酪氨酸酶抑制剂临床应用于与黑色素失调相关疾病的治疗。其在美白化 妆品及日晒变黑应用方面具有重要作用。 本论文从天然植物中分离纯化出对酪氨酸酶具有很强抑制作用的抑制剂并探 讨其对单酚酶和二酚酶活性的抑制作用机理。再以小鼠B 1 6 F 1 0 细胞的酪氨酸酶为 研究对象，研究其对黑色素生成量的影响及其相关基因的转录调控机制。最后， 以果蝇为动物模型研究酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶代谢途径中相关产物多巴胺生 成量的影响。在筛选酪氨酸酶抑制剂过程中，发现了与帕金森病相关的a s y n u c l e i n 蛋白的过表达能显著抑制黑色素的生成量，这预示着酪氨酸酶与帕金森病可能有 着某种相关性，因此研究了0 【s y n u c l e i n 蛋白对小鼠B 1 6 F 1 0 细胞酪氨酸酶转录调控 的机制。相关研究内容和结果如下： ( 1 ) 对酪氨酸酶有抑制作用的化合物：C a r d o lt r i e n e s ，C a r d o ld i e n e ，C a r d n o lt r i e n e s ， C a r d a n o ld i e n e ，C a r d a n o lm o n o n e ，研究了它们对对酪氨酸酶的抑制机理及对小 鼠B 1 6 F 1 0 细胞的黑色素生成量的影响及其相关基因的转录调控机制。 ( 2 ) 从抗生素药品中筛选了对酪氨酸酶有制作用的药物，研究其对酪氨酸酶的抑制 机理。 ( 3 ) 以果蝇为动物模型研究酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶代谢途径中相关物质含量 的影响。 ( 4 ) 研究了a s y n u c l e i n 蛋白过表达对小鼠B 1 6 F 1 0 细胞的酪氨酸酶转录调控的机 制。 关键词：酪氨酸酶；抑制剂；作用机理；0 t - s y n u c l e i n 蛋白；黑色素形成调控 c t - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 A b s t r a c t T y r o s i n a s e ( 1 1 4 18 1 ) ，w i d e l yd i s t r i b u t e di nn a t u r e ，i sam e t a l l o e n z y m eo x i d a s e w h i c hc a t a l y z e st w od i s t i n c tr e a c t i o n so fm e l a n i ns y n t h e s i s - - t h eh y d r o x y l a t i o no f m o n o p h e n o la n dt h eo x i d a t i o no f0 - d i p h e n o lt ot h ec o r r e s p o n d i n go - q u i n o n e I ti sa k e ye n z y m ei nm e l a n i nb i o s y n t h e s i s ，i n v o l v e di nd e t e r m i n i n gt h ec o l o ro fm a m m a l i a n s k i na n dh a i r I t sa b n o r m a le x p r e s s i o ni sr e s p o n s i b l ef o rt h ev a r i o u sd e r m a t o l o g i c a l d i s o r d e r s ，s u c ha sm e l a s a m aa g es p o t s ，a c t i n i cd a m a g e s I ta l s oc o n t r i b u t e st o n e u r o m e l a n i nf o r m a t i o ni nt h eh u m a nb r a i na n dt h en e u r o d e g e n e r a t i o na s s o c i a t e d w i t hP a r k i n s o n Sd i s e a s e T y r o s i n a s ei n h i b i t o r s ，t h e r e f o r e ，s h o u l db ec l i n i c a l l yu s e f u l f o rt h e t r e a t m e n t so fs o m ed e r m a t o l o g i c a ld i s o r d e r sa s s o c i a t e dw i t hm e l a n i n h y p e r p i g m e n t a t i o na n da l s oi m p o r t a n ti nc o s m e t i c sf o rw h i t e n i n ga n dd e p i g m e n t a t i o n a f t e rs u n b u r n T h ei n h i b i t i o no f t y r o s i n a s eh a sb e e nt h es u b j e c to f m a n ys t u d i e s I nt h ep r e s e n tp a p e r , w eS e p a r a t ei n i b i t o r sf r o mn a t u r a lp l a n t sa n de f f e c t so ft h e m o nt h ea c t i v i t yo fm u s h r o o mt y r o s n i a s eh a v e b e e ns t u d i e d T h e ne f f e c t so ft h e mo nt h e m e l a n i nc o n t e n ta n dr e g u l a t i o no fm e l a n o g e n e s i sh a v e b e e ns t u d i e d I nt h ee n d ， e f f e c t so fi n h i b i t o r so nd o p a m i n ec o n t e n ti n f l yw e r ea s s a y I nt h ep r o c e s so fo u r s c r e e n i n gt h et y r o s i n a s ei n h i b i t o r s ，w ef o u n dt h a tm e l a n i nc o n t e n tc o u l db ed e p r e s s i o n b yo v e r e x p r e s s i n g0 【一s y n u c l e i ni nt h ec e l l T h er e s u l ti n d i c a t e st h a tt y r o s i n a s ea n d P a r k i n s o n Sd i s e a s eh a v ec o r r e l a t i o nt os o m ee x t e n t ，S Ot h er e g u l a t i o no ft y r o s i n a s ei n t h eB16 F10h a sb e e ns t u d i e d T h ec o n t e n t sa n dr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： F i v ec o m p o u n d sw e r es e p e r a t e dt h a tc a ni n h i b i tt y r o s i n a s ef r o mC N S L ：C a r d o l t f i e n e s ，C a r d o ld i e n e ，C a r d n o lt r i e n e s ，C a r d a n o ld i e n e ，C a r d a n o lm o n o n e n l e i n h i b i t i o nm e c h a n i s mo ft h e ma g a i n s tt h e a c t i v i t yo fm u s h r o o mt y r o s i n a s eW a s s t u d i e d E f f e c t so ft h e mo nt h em e l a n i nc o n t e n ta n dr e g u l a t i o no fm e l a n o g e n e s i si n t h eB 16 F 10c e l 】w e r ea l s os t u d i e d S c r e e n i n gt h et y r o s i n a s ei n h i b i t o r sf r o md r u g sa n ds t u d y i n gt h e i ri n h i b i t o r y m e c h a n i s mh a v eb e e nc o n d u c t e d E f f e c t so fi n h i b i t o r so nd o p a m i n ec o n t e n ti n f l yw e r ea s s a y R e g u l a t i o no f m e l a n o g e n e s i sb yo v e r e x p r e s s i n g0 t - s y n u c l e i ni nt h eB 16 F10W a sa l s os t u d i e d K e yW o r d s ：T y r o s i n a s e ；I n h i b i t o r s ；M e c h a n i s m ；a s y n u c l e i n ；R e g u l a t i o no f m e l a n o g e n e s i s 2 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为() 课题( 组) 的研究成果，获得() 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：庙多罗 夕穆年9 月7 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： ) 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“”或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人：户移乡、 卅年穸月7 日 y n 眦l e m 蛋自盈抑制剂对薛氟醋的调控机锗 1前言 1 1 酪氨琏酶 1 1 1 概述 酪氨酸酶( E C J 1 4 1 8 1 ) 是一种广泛存在于自然界中含铜的会属氧化酶，它 具有单酚酶活性，可以将酪氨酸羟化形成L 多巴( L - D O P A ) ，也具有二酚酶活 力，将L 一多巴氧化成多巴醌】是生物形成黑色素合成的关键酶，它决定了皮肤 和头发色素的颜色酪氨酸酶的异常表达引起了各种各样的皮肤病，如老年斑及 光照损伤等，它还与人脑中的神经黑色素形成及神经退行性病变相关的帕金森病 有关吐因此酪氨酸酶抑制剂l 简末应用于与黑色素失调相关疾病的治疗1 3 1 且在美 白化妆品及日晒变黑应用方面具有重要作用1 4 ”。酪氨酸酶抑制剂成了被广泛 研究的课胚o l 。一些药物对氨酸酶的作用已有文献报导，如治疗高血压和心衰 药物卡托普利和抗甲状腺药物甲巯基眯唑都是酪氨酸酶抑制剂【n 1 2 1 。 1 1 2 酪每酸酶的三维结构 酪氨酸酶是_ 种疏水性的膜结合蛋白。酪氨酸酶属于型铜蛋白家族，在催 化反应过程中，其铜离子中心存在三种不状态，它的活性中心含有双铜离子 可以可逆的与氧结合1 1 4 1 | 5 1 。虽然型铜蛋白家族结构有很多文献报导【1 6 - 2 2 1 ，但直 到2 0 0 6 年，M a t o b a 等口3 1 在大肠杆菌表达酪氨酸酶和O R F 3 7 8 蛋白，得到了酪氨 酸酶与O R F 3 7 8 蛋白共结晶及结构模型( 见图I ) 。 图I 酪氨酸酶的晶体结构红色代表酪氨酸酶蓝色代表O R F 3 7 8 F i g I O v e r a l lS h J c t u r eo f l y r o s i m l s ec o m p l e x e d w i t h O R F 3 7 8 a s y n u c l e i n 蛋自厦抑制剂对醋鲺酸酶的调控机制 酪氨酸酶是由7 个q - 螺旋和一些B - 折叠组成，4 个u 螺旋位于蛋白的核心 ( 以、a 3 、c t 6 、a 7 ) ，酶活性中心则位于a 一螺旋中。活性中心c u A 分别与H i 8 、 H i s s 4 和H i s 形成配位键，C u B 分别与H i s l 9 0 、H i s I * 和H i s 2 1 6 形成配位键。除了 H i 4 ，铜离子的H i s 配体均来自于螺旋a 2 、d 3 、a 6 和订，并且H i s * 没有与硫 原子形成类似于儿荼酚氧化酶活性中心的硫醚键，所以H i s s 。易变动，而导致C u A 比C u B 易于变动。酶双铜活性中心位于由疏水氨基酸残基组成的口袋的底部。 O R F 3 7 8 蛋白是位于酪氨酸酶表面的载体蛋白，可以协助铜离子插入酪氨酸酶的 活性r f l 心，从而使酪氨酸酶具有活性。研究表明，酪氨酸酶与O R F 3 7 8 的结合态 足酪氨酸酶在活化前的中B J 态。酪氨酸酶的活性中心接近酶蛋白分子表面( 见图 I I ) 1 2 3 1 ，有利于底物与酶活性中心结合。 刿1 I 酪氨醴酶( ) 剌0 R F 3 7 8 分子表而结构 F igr IM o l e c u l a rs u r f a c e so ft y T o s i n a s e ( A ) a n d0 R F 3 7 8 ( B ) 酪氨酸酶的活性中心山两个古铜离子位点构成。在催化过程中，烈核铜 离予位点以三种形态存在，分别是氧一铜离子态( E 蝌) 、铜离子奄( E 。n ) 、皿铜离 4 翳氧鲫爨 a - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 子态( E d x y ) ( 见图I I I ) 【2 3 】。 AC 图酪氨酸酶活性中心的氧铜离子态( a ) 、铜离子态( b ) 、亚铜离子态( c ) 模型 F i g I I IT h em o d eo fE o x y ，E m e bE d 叫o ft h ea c t i v es i t eo ft y r o s i n a s e 1 1 3 理化性质 不同来源的酪氨酸酶有着不同的分子特性、分子量、肽链总长度及等电点 2 5 - 3 2 1 。如蘑菇酪氨酸酶反应的最适p H 为5 5 7 0 ，最适温度为3 0 3 5 ，酶液在 冰箱4 条件下，保存7 天活力下降5 0 ；室温3 0 条件下，保存2 天活力即 下降5 0 ；酪氨酸酶干粉在2 0 条件下保存1 年，活力仅下降5 - - - 1 0 。人 的酪氨酸酶分子量6 0k D a 、肽链总长度5 2 9A A 、等电点6 0 3 ；鸡的酪氨酸酶分 子量6 0k D a 、肽链总长度5 2 9A A 、等电点5 7 1 ；鼠的酪氨酸酶分子量6 0k D a 、 肽链总长度5 3 3A A 、等电点5 6 7 ；链霉菌S t r e p t o m y c e sl i n c o l n e n s i s 的酪氨酸酶 分子量3 0k D a 、肽链总长度2 7 2A A 、等电点7 7 1 ；中国软壳海龟T r i o n y xs i n e n s i s 的酪氨酸酶分子量3 1k D a 、肽链总长度2 7 3 A A 、等电点5 5 3 。绝大多数酪氨酸 酶在6 0 时，其半衰期只有几分钟，而一种从革兰氏阴性菌T h e r m o m i c r o b i u m r o s e u m 分离出的酪氨酸酶，在9 0 时还有很高的活性，p H 范围为8 5 1 0 。 1 1 4 生理功能 酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，黑素的生物合成是一个由酪氨酸酶催化体 内酪氨酸羟化而启动一系列生化反应生成两种黑色素的过程【3 3 , 3 4 】。哺乳动物体内 黑色素分真黑素( e u m e l a n i n s ) 和褪黑素( p h a e o m e l a n i n s ) 两种【”】，前一种为棕黑 色，后一种为红棕色，两种色素的比例不同造成毛发皮肤颜色的不同。黑色素生 a - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 物合成过程可大体分为两个阶段三个部分，第一阶段就是酪氨酸被氧化生成多巴 ( L D O P A ) 并进一步氧化生成多巴醌的过程，在这两步反应都是由酪氨酸酶催化 的。第二阶段分为两部分，即以多巴醌为原料从两个不同途径分别生成真黑素和 褪黑素的过程。真黑素生成，多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色多巴色 素，极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素，多巴色素经异 构、脱羧生成5 ，6 二羟基吲哚( D H I ) ，5 , 6 二羟基吲哚( D H I ) 由酪氨酸酶催化氧化 为真黑色素的前体吲哚5 ，6 醌( I n d Q u ) ；褪黑素生成，多巴醌与半胱氨酸( C y s ) 反应生成产生5 - C y s 一多巴及5 - C y s 多巴醌，后者关环、脱羧变成苯肼噻嗪的衍 生物，最后形成褪黑素。在第二阶段里，只有少数几步反应由酪氨酸酶、异构酶 或金属离子催化，大部分反应都是自发的，因此酪氨酸酶是整个黑色素生成反应 的限速酶，第一阶段的两步反应是限速步骤【3 6 1 。图为黑色素生物合成的简要步 骤。 图黑色素合成机制 F i g I VT h em e c h a n i s mo fm e l a n i nb i o s y n t h e s i si nt h em e l a n o c y t e 1 1 5 酪氨酸酶催化作用机理 酪氨酸酶具有羟基化单酚生成二酚( 单酚酶活性) 又有氧化二酚生成醌( 二 酚酶活性) ，两个反应都需要氧分子的参与【3 7 1 。此催化反应过程主要是从酪氨酸 6 a - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 酶的三维结构和分子轨道理论来阐述【3 引。 如前所述，酪氨酸酶的活性中心由两个含铜离子位点构成【2 4 1 。在催化过程 中，双核铜离子位点以三种形态存在，分别是氧一铜离子态( 和E o x v ) 、铜离子态 ( E m c t ) 、亚铜离子态( E d c o x v ) ( 见图I I I ) 2 3 o 铜离子态酪氨酸酶与氧铜离子态 相似，都含有两个四角形的反磁铜离子，不同的是，桥连配体是氢氧化物而不是 过氧化物。每个亚铜离子电子构象为3 d 1 0 3 9 】，分别与两个吲哚上的氮原子形成 两个键长为1 9A 的配位键，与第三个吲哚上的氮原子形成键长为2 7A 的配位 键，环绕c u C u 轴形成近似C 3 v 的对称结构【4 0 l 。半亚铜离子态酪氨酸酶含有一 个2 价铜离子和一个1 价铜离子【4 1 1 。2 价铜离子含有未配对的电子，未配对的电 子占据一个d x 2 们轨道。两个铜离子之间有配体的存在。E d e o 。v 的活性中心由两 个一价铜离子组成1 4 2 1 。 酶催化羟基化单酚生成二酚可用分子轨道理论来阐述【4 3 1 。在酶催化羟基化 单酚生成二酚和氧化二酚生成醌过程中，E 州作用于单酚和二酚，而E 州对单酚 没有活性。在反应体系中存在A 基团( 可能是组氨酸) 与二酚4 位上的羟基质 子结合。因为赤道面被过氧化物占据，双酚与铜离子A 轴向结合，把质子传递 给E 刚的过氧化物。然后取代与铜离子B 结合的组氨酸，那么双酚与铜离子就 形成分子轨道轴向共面。与铜离子共面的双酚被氧化，生成多巴醌；生成的亚铜 离子态酶与氧分子有很强的亲和力，又转变为E o x v1 4 4 。研究表明，分子轨道共 面对于氧化还原反应的发生是必要的。如果底物是单酚，单酚的4 位羟基攻击 还原态的酶，质子传递给基团( 组氨酸) ，产生一个无活性的死端化合物E m 哦M 。 而单酚4 位上的羟基与E 。x v 相互作用，质子传递给过氧化物。在赤道向结合的氧 亲和攻击单酚，使之D 位羟基化。产生的双酚分别以轴向和赤道向与活性中心 结合，分子轨道与铜离子的不共面。这种构型的二酚不能被氧化，必须进行重排。 这些变化包括从一个铜离子转移到另一个铜离子，以获得双轴向或双赤道向分子 轨道共面。只与一个铜离子结合的中间态很不稳定，双酚将从另一个铜离子上释 放出来。 根据酪氨酸酶催化双酚和单酚的反应机制，陈清西教授H 5 ，4 6 1 提出了其反应动 力学模型( 图V ) 。E o x v 羟基化单酚，产生E f n n D 。这时酶可以氧化双酚生成醌， 而E 州转变为E d 一；或者释放双酚，E m d 结合单酚生成E m M 。当多巴醌存在的 7 a - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 时候，双酚可以在反应体系中重复使用，参与一系列的循环反应【4 7 1 。这个反应 机制，包括了E r n s t 向E o x y 的转变和迟滞时间的产生，迟滞时间是酪氨酸酶单酚 酶活性的特征1 4 7 , 4 8 】。研究发现，双酚浓度与反应体系中最终产物的形成有关H 9 1 。 因为迟滞时间的存在，先形成一种假稳态中间产物，随着双酚浓度的增大，酶转 变为最终稳定状态。 图V 酪氨酸酶的反应机制的示意图 F i g VT h er e a c t i o nm e c h a n i s mo ft v r o s i n a s e 1 1 6 基因表达与调控 大量文献报导表明，酪氨酸酶基因表达存在几个主要调控途径 5 0 - 6 5 】，简要示 意途径如图。 5 y n u d t i n 蛋白爰抑制荆对醇氨砬尊的饵控机制 图黑色素调控的主要途径 F i gv IM a J o rr e g u l a t i o np a t h w a y so fM e l a n o g e n e s iS 如图所示黑色素主要调控途径有三条：P K A 、P K C 和P K G 途径，外源信号 因子可以通过激活c A M P ，而激活P I C A 活性，P K A 可以改变酪氨酸酶基因的转 录表达水平m l ，如G l y c y r r h i z i n ，S c o p a r o n e 和I B M X 都是通过激活c A M P ，而 激活p i C A 活性从而提高酪氨酸酶基因的转录表达水平M 7 4 q 。而通过D A G ( 二脂 酰甘油) 激活P K C ，则可以磷酸化酪氨酸酶，使酪氨酸酶活化，从而提高黑色 素水平。c G M P 可以通过抑制c A M P 磷酸二酯酶，导致c A M P 含量的升高，而促 进黑色素的合成。c G M P 也可以激活P K G 酶，P K G 可以磷酸化激活蛋白l ，促 进酪氨酸酶表达的转录因子。如P i p e r l o n g u m i n i n e ，种从e c e r l o n g u m 提取的 天然化台物，它可以通过抑制c A M P 或c G M P 以及酪氢酸酶的转录水平，而降 a - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 低黑色素的产生，但对酪氨酸酶的活性和P K C 调控的黑色素形成没有影响7 1 1 。 以上三条调控途径均可通过C R E B 磷酸化为p - C R E B ，而调控酪氨酸酶转录 表达水平。p - C R E B 与M I T F 启动子结合促进M I T F 表达，导致酪氨酸酶表达水 平升高。M I T F ( M i c r o p h t h a l m i a - a s s a c i a t e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o O ，是碱性螺旋环螺 旋亮氨酸拉链( b H L H Z I P ) 蛋白转录因子家族的一员，它能够反式激活包括 M b o x 的启动子所调控的转录，而M b o x 是酪氨酸酶特有的结构之一，因而它 是黑素细胞特异性转录调控因子【6 6 , 7 0 1 。它不但可以调控黑色素细胞的增殖，还可 以调控褐黑素( p h e o m e l a n i n ) 和真黑素( e u m e l a n i n ) 的相对量和绝对量，并且是酪 氨酸酶和其相关蛋白表达的主要调控蛋白。W n t 信号通路包括c A M P 和I L 6 可以 调控M i t f 的转录水平，M i t f 蛋白的表达水平则是通过p 3 8 信号和M A P 激酶信号 通路调控的【硎。影响这些信号通路和信号传导的因子均可以影响M i t f , 而调控 黑色素的产生【7 2 1 。 1 1 7 与酪氨酸酶相关的应用研究概况 目前国内外对酪氨酸酶的研究内涉及到疾病、美容、果蔬保鲜等领域。 在疾病研究方面：因为酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶，其异常表达不仅 会导致人体的很多色素障碍疾病 7 3 - 7 5 】，而且与酪氨酸酶代谢中间产物相关的一些 疾病密切相关，如帕金森病等【7 6 。8 6 】。 在美容方面：由于酪氨酸酶抑制剂具有抑制黑色素生成的作用，因此许多美 容的美白剂是应用酪氨酸酶抑制剂抑制黑色素生成而达到美白效果。如曲酸及其 衍生物、v c 及其衍生物等 8 7 - 9 0 】。 水果、蔬菜的褐变也与酪氨酸酶也有密切关系，酪氨酸酶是引起水蔬发生酶 促褐变的主要酶类，它可使很多果蔬在贮存、处理、加工过程中产生褐变，如桃 子、荔枝、苹果、马铃薯、鳄梨等9 1 - 9 7 1 。 以上概述表明通过改变酪氨酸酶活性可以应用到疾病、美容、果蔬保鲜等领 域，因此酪氨酸酶抑制剂及激活剂的研究显得十分重要。目前研究主要集中在寻 找具有特异的、高效的酪氨酸酶抑制剂，然后研究其抑制作用机理、动力学模型、 以及其相关的应用。 1 2a s y n u c l e i n 蛋白 1 2 1 概述 l O a - s y n u c l e i n 蛋白厦抑制剂对酪氨酸酵的调控机制 1 9 8 8 年M a r o t e a u x 乱d 首先报导了太平洋电鳐带电器官S y n u c l e i n 蛋白的核 苷酸及氨基酸序列m 】。S y n u c l e i n 蛋白包括3 种分子量为1 5 2 0k D a 的同源蛋 自，旺B - 和T s y n u c l e i n ，n s y n u c l e i n 和p s y n u e l e i n 在脊椎动物神经突触d # 术梢广 泛表然，而7 - s y n u e l e i n 则主要在周围神经元表达 9 9 1 。1 9 9 1 年M a r o t e a u xe ta l 又报 导了大鼠脑同源S y n u c l e i n 蛋白e D N A 顺序呷I 。此后与S y n u c l e i n 蛋白研究相关 的文献也越来越多”0 1 ”I 。人类a - s y n u e l c i n 蛋白长度为1 4 0 个氨基酸，p - s y n u c l e i n 蛋白为1 3 4 个氨基酸。一和B s y n u e l e i n 蛋白有6 2 相同的氨基酸序列和部分类 似结构域。图岬旺- ，B _ 和7 - s y n u e l e i n 蛋白氨基酸顺序。 aS v n BS v n YS y n aS v n Bs v n TS y n dS v n Bs yn YS yn霞勰 篡群睬。；圈：圈烹 E A0S GeDE 1 口T 瞄。口 叶T 田T 口” 。【2 1 ) 黔 幽廿，阻和T - s y n u c l e i n 蚩白序州比较 F i g S e q u e n c ec o m p a r i s o n o f h u m a n 泓s y n u c l e i n ( c t - S y n ) 1 3 - s y n u c l e i n ( 1 3 - S y n ) ，a n d T - s y n u c M n ( y - S y n ) A m i n oa c i d i d e n t i t i e s b e t w e e n a t l e a s t l w oo f t h e t h r e e s e q u e n c e sa m i n d i c a t e d 时b l a c k b a r sA s ar e s u l t o f a c o l n n l o n I m l y m o r p h i s m ，r e s i d u e 1 1 0 0 f 7 - s y n u c l e i n i se i t h e r Eo r G 研究表明a 一和p - s y n u e l e i n 蛋白在神经系统中有最高表达水平，而在其它组 织中则是较底的转录水平1 1 0 3 , 1 ”J 。免疫组化研究表明两种蛋白主要集中在神经未 梢，小部分在细胞体和树突，超微结构显示，它们位天神经未梢接近突出泡部位 1 1 0 , 1 0 6 1 。 即“卧呼心嘲心心 a - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 a 一和1 3 - s y n u c l e i n 蛋白的生理学功能尚不清楚，这两种蛋白在脑蛋白中含量丰 富约占脑蛋白总量的0 1 0 2 【1 0 7 1 。生物物理学研究显示a - s y n u c l e i n 蛋白是单体， 少量二级结构，为保持其热稳定，0 【s y n u c l e i n 蛋白是天然的不折叠构象呷引。 1 2 2Q s y n u c l e i n 与帕金森病 帕金森病的一个显著特征是黑质多巴能神经元的丧失和神经元细胞内形成 纤维状态包涵体L e w y 小体。虽然帕金森病选择性神经元功能丧失机制尚不清楚， 多数病原学推测，帕金森病发生包括氧化应激、线粒体功能异常、泛素功能异常、 蛋白质错折叠等【1 0 9 i 。很多蛋白与帕金森病有关，由于0 c s y n u c l e i n 蛋白是组成L e w y 小体的主要成分。1 1 0 1 ，因此更加引人关注。1 9 1 2 年F r i e d e r i c hL e w y 首次描述 的帕金森病人迷走神经运动核背侧和无名质胞质内卷曲或伸展状小体【川1 。1 9 1 9 年T r O t i a k o f f 首次描述了黑质存在L e w y 团，并提出它们是构成帕金森病人特殊 黑质病状2 1 。1 9 9 6 年P 0 1 y m e r o p o u l o se ta 1 通过对左旋多巴敏感的意大N - 美洲人血缘关系( t h eC o n t u r s if a m i l y ) 的帕金森病人尸体解剖发现与染色体 4 q 2 1 - 2 3 存在基因遗传连锁3 J 1 5 1 。1 9 9 7 年又在这个家族和三个希腊人家族( 它 们都是t h eC o n t u r s if a m i l y ) D l s - t 1 6 1 发现了0 【s y n u c l e i n 蛋白点突变。这个突变 位于外显子4 仅s y n u c l e i n 编码区1 5 7 的密码子由G 转变为A ，相应5 3 氨基酸残 基由丙氨酸变为苏氨酸，位于0 【一s y n u c l e i n 蛋白基因连锁4 5 之间。图V I I t 7 1 显示 了基因突变的位点。 由于a s y n u c l e i n 蛋白是组成L e w y 小体的主要成分，且其在脑蛋白中含量 丰富【1 0 7 1 。因此研究人员对u s y n u c l e i n 蛋白在帕金森病发病过程中的作用进行了 广泛深入的研究【1 1 7 。1 3 2 1 。酪氨酸酶代谢过程产物中间产物多巴也是神经传递物质 多巴胺的前体，因此也有很多研究文献报导了a s y n u c l e i n 蛋白与酪氨酸酶的相 互作用关系。有文献报导酪氨酸酶氧化儿茶酚伴随0 【s y n u c l e i n 蛋白聚集导致了 细胞凋亡【1 3 3 1 。共表达c 【s y n u c l e i n 蛋白与酪氨酸酶可导致细胞死亡明显增加是由 于醌类衍生物导致了Q s y n u c l e i n 蛋白聚集【1 3 4 1 。I s a b e l l aT e ta 1 报导了a - s y n u c l e i n 蛋白与酪氨酸酶在体外的能相互作用可能是a s y n u c l e i n 蛋白增强细胞毒性的原 因 1 3 5 1 。 1 2 a 。s y m m c l e l n 蛋白厦抑村剂耐酪氟酸酶的调控机制 冒 A ：i H H G VA T A S 8 7 删帕金森痛客旋a - s y n u c l e i n 岱自突变錾田 F i g M u t a t i o n s i n t h e a - s y n u c l e i n g e n e i n f a m i l i a lP a r k i n s o n sd i s e a s ef A 、S c h e m a t i c d i a g r m T lo f h u m a n a - s y n u c l e i nT h es e v e n m p e a t s w i t h t h ec o n s e n s u ss e q u e n c eK T K E G V s h o w n g r e e nb a BT h e h y d r o p h o b i cr e g i o n i ss h o w n i nb l u ea n d t h e n e g a t i v e l y c h a r g e d C t e r m i n u s i n y e l l o wT h e t w ok n o w n m i s s e n s e m u t a t i o n sa 佗i n d i c a t e d f B ) R e p e a t s i nh u m a n a - s y n u c l e i nR e s i d u e s7 _ 8 7 0 f t h e1 4 0 - r e s i d u ep r o t e i na r es h o w n A m i n oa c i d i d e n t i t i e sb e t w e e n m l e a s t f i v eo f t h es e v c Br e p e a t sa m i n d i c a t e db yb l a c k b a r sT h e A t oP m u t a t i o na tr e s i d u e3 0b e t w e e n m p e a t s t w oa n d t h r e ea n d t h e A t o m u t a t i o na tr e s i d u e5 3 b e t w e e n r e p e m s f o u i - a n d f i v ea 胙s h o w n a - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 1 3 本课题的研究内容和意义 由于酪氨酸酶在疾病、美容、果蔬保鲜等方面的重要作用，因此对酪氨酸酶 抑制剂的作用机理研究、酪氨酸酶与其它因素的相互作用、酪氨酸酶转录调控途 径研究有着十分重要的意义。在酪氨酸酶抑制剂的研究方面：目前学的研究主要 集中在酶抑制剂的筛选与设计合成、酶抑制剂抑制黑色素合成的机理方面研究。 在疾病研究方面：主要是集中在酪氨酸酶代谢过程中相关代谢产物代的生物学功 能及酪氨酸酶与其它蛋白之间的相互作用关系。 本课题首先以蘑菇酪氨酸酶为研究对象，从天然植物中分离、纯化出高效的 酪氨酸酶的抑制剂，并应用G C M S 、1 H - N M R ：1 3 C - N M R 进行结构鉴定。通过酶 动力学研究方法研究筛选出的抑制剂对酪氨酸酶的抑制作用机理，求得相关抑制 常数；建立抑制剂与酶相互作用的反应模型关求出其相应的表观速率常数及微观 速率常数。然后以小鼠B 1 6 F 1 0 细胞研究对象，研究所筛选的抑制剂对细胞的存 活力及其黑色素生成的影响。最后以果蝇为动物模型研究所筛选的抑制剂对与酪 氨酸酶代谢产物相关的化合物多巴胺的影响。 本课的另一个研究对象为0 L s y n u c l e i n 蛋白对酪氨酸酶的调控途径，我们在 研究小鼠B 1 6 F 1 0 细胞黑色素形成过程中，发现瞬时转染u s y n u c l e i n 质粒可使黑 色素生成量明显下降。因此我们通过R e a l t i m eP C R 、w e s t e mb l o t 、R N A i 、E L I S A 检测、免疫共沉淀技术手段研究了仅s y n u c l e i n 蛋白对黑色素生成的调控途径及 调控方式。 本课题研究建立了新型酶抑制剂对酶作用的动学模型并在此基础上求出其 抑制常数，表观速率常数及微观速率常数。使人们对酪氨酸酶活性中心的结构和 催化机制有了更深的了解。并且研究了抑制剂的细胞学效应及对果蝇动物模型的 效应，检测与酪氨酸酶相关的代谢产物变化。揭示了酪氨酸酶抑制剂对细胞及动 物模型中的相关物质的影响，为抑制剂在医学、美容领域的应用提供了科学的理 论依据。 a s y n u c l e i n 蛋白在脑蛋白中含量丰富，目前研究表明其与帕金森氏病有着重 要联系，然而其对帕金森氏病的发病机理及在其中的作用目前尚未十分清楚。本 研究发现了0 【一s y n u c l e i n 蛋白可显著降低酪氨酸酶蛋白含量及其黑色素含量，并 且揭示了0 【s y n u c l e i n 蛋白对酪氨酸酶的调空途径及调空方式。提出0 【s y n u c l e i n 1 4 a - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 蛋白通过降低酪氨酸酶蛋白含量从而降低其代谢产物水平影响到多巴胺的生 成，预示着a s y n u c l e i n 蛋白与酪氨酸酶均与帕金森氏病有着密世相关。另一方 面我们也研究了通过瞬时转染0 【一s y n u c l e i n 质粒降低酪氨酸酶蛋白水平，增加了多 巴胺对细胞的毒性，说明仅一s y n u c l e i n 蛋白过表达可因降低酪氨酸酶蛋白水平而 增加多巴胺的毒性，为研究帕金森病发病机制提供了新的理论依据。 1 5 a - s y n u c l e i n 蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制 2 1 主要材料和试剂 2 实验试剂与仪器 材料和试剂来源 H E K 2 9 3 F T 细胞株B u r n h a m 研究所许华曦教授提供 B 1 6 F 1 0 细胞株B u r n h a m 研究所许华曦教授室提供 小鼠神经元细胞B u r n h a m 研究所S t u a r tA L 教授提供 大肠杆菌D H 5 e t 、T O P l 0 感受态细胞 I n v i t r o g e n 公司 I n v i t r o g e n B u r n h a m 研究所张卓华实验室唐程远 仅- s y n u c l e i n 质粒 博士惠赠 P S R G 载体B u r n h a m 研究所许华曦教授提供 P T R B s 载体B u r n h a m 研究所许华曦教授提供 B u r n h a m 研究所R o l fB o d m e r 实验室 黑腹果蝇 G e o r gV o g l e r