提高大豆蛋白冻融后乳化性改性工艺优化 .pdf

第 30 卷 第 7 期 农 业 工 程 学 报 Vol.30 No.7 2014 年 4 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Apr. 2014 281 提高大豆蛋白冻融后乳化性改性工艺优化 孙洪蕊 1，张英华1，王喜波1，姜国川2，江连洲1 （1. 东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030； 2. 吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118） 摘 要：为了制备出经冷冻-融化后仍能保持较高乳化性的大豆蛋白，试验以葡聚糖为糖基化供体，采用湿法糖基 化技术改性大豆蛋白。根据单因素试验的结果，建立了 Box-Behnken 模型对加工工艺进行优化，所得的模型拟合 度高，切实可行，可用于实际分析和预测。利用响应面分析法探讨了蛋白浓度、蛋白与糖质量比、反应时间 3 因 素对改性产物冻融前后乳化活性和乳化稳定性的影响， 优化的工艺条件为： 大豆分离蛋白 （soybean protein isolate， SPI）质量浓度 40 mg/mL，SPI 与葡聚糖的质量比为 13，反应时间 4 h。在此条件下得到的改性产物冻融稳定性 显著（P0.05）高于未改性蛋白，冻融前后的乳化活性(emulsifying activity index，EAI)分别是空白对照样的 1.687 和 1.780 倍，乳化稳定性（emulsion stability index，ESI）分别是空白对照样的 1.367 和 1.274 倍。傅里叶红外光谱 证明葡聚糖通过共价键接到大豆蛋白分子中， 研究结果为制备冷冻食品加工专用大豆蛋白的产业化生产提供参考。 关键词：优化；蛋白；乳化；大豆分离蛋白；冻融稳定性；响应面；乳化活性 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2014.07.034 中图分类号：TS201.2+1 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2014)-07-0281-06 孙洪蕊，张英华，王喜波，等. 提高大豆蛋白冻融后乳化性改性工艺优化J. 农业工程学报，2014，30(7)：281 286. Sun Hongrui, Zhang Yinghua, Wang Xibo, et al. Processing optimization for improving soybean proteins emulsifying properties after freeze-thawJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2014, 30(7): 281286. (in Chinese with English abstract) 0 引 言 大豆蛋白有较高的营养价值和特殊的功能性 质，因而在食品工业中占有重要地位1-4。 普通大豆 蛋白主要用于肉制品、面制品等常态环境下，而在 冷冻条件下普通大豆蛋白难以维持原有的功能性 质，使产品解冻后品质降低5-6。Supratim 等7的研 究表明由蛋白质作为乳化稳定剂的乳液体系在冷 冻-解冻循环后会变得不稳定， 其中水相因冷冻分离 而失去定向作用，界面膜上的蛋白质分子相互聚 集，而乳液解冻后，蛋白质分子在界面膜上重新分 散，进而产生聚结。 糖基化改性能对大豆蛋白的结构和稳定性产 生显著影响，改性产物蛋白质-多糖共聚物，对 pH 值，离子强度和温度等条件的改变具有很高的 稳定性8-9。 这种聚合物可以改善蛋白质的一些功能 收稿日期：2013-11-22 修订日期：2014-02-26 基金项目：黑龙江省教育厅科研项目（12531050） ；黑龙江省应用技术 研究与开发计划项目（WB13C10201） ；863 计划（2013AA102208） ；国 家大豆产业技术体系项目（CARS-04-PS25） 作者简介：孙洪蕊（1989） ，女（汉族） ，研究方向：食品科学。哈尔 滨 东北农业大学食品学院，150030。Email: 通信作者：王喜波（1975） ，男（汉族） ，副教授，博士，研究方向： 粮食油脂及植物蛋白工程。哈尔滨 东北农业大学食品学院，150030。 Email: 。 性质， 如溶解性10-11、 乳化性12-15等。 Akhtar 等16-17 研究表明大豆蛋白-多糖共聚物可以显著提高改性 产物的乳化性，降低乳滴粒径，提高乳液稳定性， 并抑制乳液分层，而乳化性18是大豆蛋白作为功能 性食品配料应用于冷冻食品中的最重要的功能性 质，因此采用糖基化技术提高大豆蛋白冷冻前后的 乳化性质，具有现实可行性。 目前，国内外关于大豆蛋白改性的研究多集中 于提高或改善其凝胶性、溶解性、乳化性、起泡性、 组织化等方面，对于提高或改善大豆蛋白冻融后乳 化稳定性的研究还很少，尚未解决工业化生产高冻 融稳定性大豆蛋白的技术难题，而国内外冷冻食品 工业对此类产品需求却与日俱增。本文采用湿法糖 基化技术改性大豆蛋白，提高改性产物在冻融循环 后的功能稳定性，使其在冻融循环后仍能与冻融处 理前的乳化性保持相当水平，为实现冷冻食品加工 专用大豆蛋白的产业化生产提供技术思路，拓宽大 豆蛋白在食品工业中的应用。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 低温脱脂豆粉（哈高科大豆食品有限责任公 司）；葡聚糖（右旋糖酐 40 kDa，国药集团化学试 剂有限公司）；九三非转基因大豆油（市售）； 农业工程学报 2014 年 282 FSH-2 可调高速匀浆机 （金墰市宏华仪器厂） ； TU-1800 紫外可见分光光度计（杭州科晓化工仪 器设备有限公司济南分公司）；PHS-3C 数字酸度 计（上海鹏顺科学仪器有限公司）；LGJ-1 冷冻 干燥机（上海医用分析仪器厂）；GL-21M 离心 机 （上海市离心机械研究所） ； Nicolet 6700 FT-IR 傅里叶变换红外光谱仪（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国）。 1.2 方法 1.2.1 大豆分离蛋白的制备 自制，采用碱溶酸沉的方法19。 1.2.2 大豆分离蛋白-葡聚糖共聚物制备工艺 将大豆分离蛋白和葡聚糖按一定的比例配制 溶液，并使大分子完全水化。按照前期单因素试验 结果，将溶液置于水浴锅中在 95下反应，反应完 成后立即冰浴停止反应。将溶液离心（10 000 g） 15 min，弃沉淀，取上清液。 1.2.3 乳化性测定 参考了 Tang 等20的方法，略有改动。将糖 基化样品溶解在缓冲溶液中（0.2 mol/L 磷酸盐缓 冲溶液， pH值为7.0） 使蛋白质量浓度为4 mg/mL， 取 9 mL 样品液与 3 mL 大豆油混合并不断搅拌。 然后10 000 r/min条件下均质1 min。 在0和10 min 时分别从试管底部取出 50 L，立即用 5 mL 1 mg/mL 的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）稀释，稀释液在 500 nm 处测吸光 值。 0 010 10 ESI A AA = （1） 式中：A0表示零时刻时的吸光值，即乳化活性 （emulsifying activity index，EAI），A10为乳液放置 10 min时测得的吸光值， （emulsion stability index， ESI）表示乳化稳定性，以SDS溶液做空白。 1.2.4 冻融循环 参考了Yeun Suk Gu21，Mun22和Jonathan ORegan23等的方法，稍作修改。将一定浓度的蛋 白溶液装在密闭的低温管中，在20条件下保存 24 h。常温条件下放置30 min，并于40水浴锅中 解冻1.5 h，然后用于乳化性能测定。 1.2.5 试验设计 以前期单因素试验的结果为基础，应用响应面 中心组合设计分析优化大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）质量浓度、葡聚糖/大豆分离蛋 白SPI质量比和反应时间3个因素提高大豆蛋白冻 融特性，并利用Design- Expert 8.0.6软件对数据进 行统计分析。影响因素水平编码见表1。 表 1 试验因素水平及编码 Table 1 Experimental factors and levels 因素 Factor 编码 Code 大豆分离蛋白质量浓度 Soybean protein isolate concentration X1/(mgmL-1) 葡聚糖与大豆 分离蛋白质量比 Mass ratio of dextran and soybean protein isolate X2 反应时间 Reaction time X3/h 1 30 2 3 0 40 3 4 1 50 4 5 2 结果与分析 2.1 Box-Behnken 中心设计优化制备工艺 对SPI浓度、葡聚糖与SPI质量比、反应时间 3个因素进行优化，以冻融前后的EAI为响应值设 计了三因素三水平的响应分析试验，共17个试验 点，其中包括12个分析因子，5个为零点，经过零 点试验估计误差，结果如表2所示。 表 2 Box-Behnken 试验条件及结果 Table 2 Design program and experimental results of Box-Behnken experiment 试验 序号 Number 大豆分离蛋白 质量浓度 Soybean protein isolate concentration x1 葡聚糖与 大豆分离 蛋白质量 比 Mass ratio of dextran and soybean protein isolate x2 反应 时间 Eeaction time x3 冻融前 EAI Emulsifying activity index of before freezing and thawing 冻融后 EAI Emulsifying activity index of after freezing and thawing 1 0 0 0 0.688 0.675 2 0 0 0 0.681 0.675 3 1 0 1 0.530 0.519 4 1 0 1 0.528 0.510 5 1 1 0 0.544 0.525 6 1 0 1 0.553 0.520 7 0 1 1 0.585 0.568 8 1 1 0 0.553 0.543 9 0 1 1 0.621 0.590 10 1 1 0 0.570 0.556 11 0 0 0 0.686 0.673 12 1 0 1 0.540 0.520 13 0 0 0 0.683 0.679 14 0 0 0 0.685 0.672 15 1 1 0 0.543 0.526 16 0 1 1 0.620 0.600 17 0 1 1 0.623 0.610 表2的试验结果经过Design-Expert 8.0.6软件 中方差分析ANOVA程序的分析，去除不显著的 因素， 得到各试验因子对响应值影响的回归方程模 型为： 冻融前 222 321 323121 321 04400290100 00980002800040 0085000900040680EAI X.X.X. XX.XX.XX. X.X.X + += （2） 第 7 期 孙洪蕊等：提高大豆蛋白冻融后乳化性改性工艺优化 283 冻融后 222 321 3221 321 052. 0031. 011. 0 008. 00035. 0 00288. 0012. 00026. 067. 0EAI XXX XXXX XXX + += （3） 式中：EAI为乳化活性；X1为SPI质量浓度，mg/mL； X2为葡聚糖与SPI质量比；X3为反应时间，h。 从表3中可以看出，冻融前EAI和冻融后EAI 回归方程模型极显著（P0.01），2个模型的失拟 项不显著（分别为0.9675，0.9242，均大于0.05）， 说明该回归方程的拟合度较好，能够真实的反映出 冻融特性与SPI质量浓度、葡聚糖/SPI质量比、反 应时间之间的关系。试验误差小，模型显著，固可 以利用此模型对湿法糖基化技术提高大豆蛋白冻 融特性工艺过程进行分析和预测。 表 3 Box-Behnken 试验方差分析 Table 3 Variance and significant analysis of Box-Behnken design test 冻融前 EAI Emulsifying activity index of before freezing and thawing 冻融后 EAI Emulsifying activity index of after freezing and thawing 方差 来源 Source F 值 F value P 值 P value F 值 F value P 值 P value 模型 1575.71 0.0001 *1688.61 0.0001* X1 30.79 0.0009 *12.04 0.0104 * X2 150.66 0.0001 *273.01 0.0001* X3 130.73 0.0001 *14.44 0.0067 * X1X2 14.47 0.0067 *10.70 0.0136 * X1X3 6.84 0.0346 * 4.42 0.0735 X2X3 86.00 0.0001 *55.91 0.0001 * X12 10161.89 0.0001 *10337.68 0.0001* X22 789.88 0.0001 *899.50 0.0001* X32 1806.13 0.0001 *2441.42 0.0001* 残差 失拟项 0.080 0.9675 0.15 0.9242 注：P0.01，为极显著，用*表示；P0.05，为显著，用*表示。 Note：P0.01，is very significant，represented by*；P0.05，as a significant，represented by*。 2.2 自变量对响应值影响分析 从方差分析结果（表3）中可以看出，冻融前 EAI模型中的一次项X1（大豆分离蛋白质量浓度， mg/mL）、X2（葡聚糖与大豆分离蛋白质量比）、 X3（反应时间，h）的影响均达到极显著水平，二 次项中的X12、X22、X32和交互项中的X1X2、X2X3 也对冻融前EAI有极显著（P0.01）的影响，交 互项X1X3的影响达到显著水平（P0.05）。冻融 后EAI模型方程中的一次项X2、X3、二次项X12、 X22、X32和交互项X2X3表现为极显著（P0.01）， 一次项X1和交互项X1X2表现为显著（P0.05）， 交互项X1X3表现为不显著（P0.05），表明各因 素对响应值的影响不是简单的线性关系，呈现出二 次函数的关系，并且各个因素之间存在交互作用。 随着SPI浓度的增加，改性产物冻融前后的 EAI均呈现出先升高后下降的趋势， 原因可能是SPI 浓度的增加提高了接枝反应速率，但是SPI浓度进 一步增加时，体系黏度迅速升高，甚至形成凝胶， 导致接枝反应速率降低。随着加热时间的延长，糖 链逐渐引入SPI中，糖链在蛋白吸附膜周围形成立 体网络24，增加了膜的厚度，增强了复合物对外界 环境的抵抗能力，使接枝物冻融前后的乳化性提 高。但加热时间过长，会使蛋白引入过多的糖链而 过度亲水，失去亲水亲油平衡，使乳化性降低。糖 添加量对改性产物冻融前后的乳化性有一定影响， 随着糖添加量增加，改性产物冻融前后的乳化性升 高，糖添加量进一步增加时，改性产物冻融特性改 善不明显，甚至降低，可能是因为糖添加量过多导 致溶液黏度过大、 流动性变差， 不利于接枝反应25。 2.3 加工工艺优化 利用Design-Expert 8.0.6软件，以冻融前后改 性产物EAI为指标， 利用软件中的优化程序对参数 进行设定。从实践角度和实际经验出发，权重 （weight） 参数设置为1时， 会得到理想的优化结果。 重要性（importance）是指哪个响应值更重要，鉴 于本试验2个响应值同等重要，所以此次将2个响 应值的重要性值设定为3，得出最优方案，参数要 求见表4。 表 4 Box-Behnken 参数标准设置 Table 4 Setting independent variables of Box-Behnken design test 名称 Name 目标 Goal 最小值 Minimize 最大值 Maximize 权重 Weight 重要性 Importance SPI 质量浓度 Soybean protein isolate concentration/ (mgmL-1) 范围内30 50 1 3 葡聚糖与 SPI 质量比 Mass ratio of dextran and soybean protein isolate 范围内2 4 1 3 反应时间 Eeaction time /h 范围内3 5 1 3 冻融前 EAI Emulsifying activity index of before freezing and thawing 最大 0.528 0.688 1 3 冻融后 EAI Emulsifying activity index of after freezing and thawing 最大 0.510 0.679 1 3 注：SPI 为大豆分离蛋白，EAI 为乳化活性，下同。 Note: SPI is soybean protein isolate，EAI is emulsifying activity index, the same below. 农业工程学报 2014 年 284 优化的湿法糖基化技术提高大豆蛋白冻融特 性的工艺条件为：SPI质量浓度40.19 mg/mL，SPI 与葡聚糖的质量比为13.17，反应时间3.96 h。考 虑到试验条件的可操作性，将优化的最佳条件修改 为：SPI质量浓度40 mg/mL，SPI与葡聚糖的质量 比为13，反应时间4 h。在此条件下进行5次验 证性试验，冻融前平均EAI为0.673，冻融后平均 EAI为0.662，模型预测值为冻融前EAI为0.686， 冻融后EAI为0.676，证明本模型优化工艺参数可 靠，具有实用价值。优化工艺条件下的改性产物冻 融前后的EAI分别是空白对照的1.687和1.780倍， ESI分别是对照样的1.367和1.274倍。 3 不同样品冻融特性及红外光谱分析 3.1 不同样品的冻融特性 不同样品冻融特性比对如表5所示。 表 5 不同产物的冻融特性 Table 5 Frozen-thaw properties of different products 蛋白样品 Protein samples 冻融前 EAI Emulsifying activity index of before freezing and thawing 冻融后 EAI Emulsifying activity index of after freezing and thawing 冻融前 ESI Emulsion stability index of before freezing and thawing 冻融后 ESI Emulsion stability index of after freezing and thawing SPI soybean protein isolate 0.3990.009a 0.3720.016a 15.3660.478a 15.2830.177a SPI-D 混合物 SPI-D mixture 0.4040.006 a 0.3730.208a 15.1120.702a 14.9940.211a SPI-D 接枝物 SPI-D conjugate 0.6730.013b 0.6620.013b 21.0010.742b 19.4630.291b 注：1.每列不同字母代表有显著性差异，相同字母代表无显著差异（P 0.05）2. D 为葡聚糖 Note: 1. Each column has a different letters represent a significant difference, the same letter represents no significant difference (P0.05) 2. D is dextran 从表5中我们可以看出SPI-D接枝物（大豆分 离蛋白与葡聚糖的接枝产物）冻融前后的EAI和 ESI均显著高于SPI和SPI-D混合物，而SPI-D混 合物在冻融前后的EAI和ESI与SPI相比，差异不 显著，说明单纯加入葡聚糖对SPI的冻融特性影响 不大。 由于SPI本身紧密的球状结构，使它的乳化性 等功能性质的应用受到了一定的限制，所以其本身 的乳化性较低26。而单纯加入多糖也并没有明显改 善SPI的乳化性，Diftis等24,27和Shepherd等28研 究发现， 蛋白质-多糖共聚物在乳液中的乳化性能明 显优于蛋白质和多糖的混合物，在糖基化反应过程 中，随着糖链的引入，SPI分子的溶解性增大，分 子柔性增加，由于葡聚糖的大分子性，具有较大的 空间位阻，也增加了油滴之间的斥力，阻止了油滴 之间的聚集，显著降低界面张力，使冻融前后的乳 化性升高。同SPI相比，SPI-D接枝物在界面上能 够形成更厚的界面膜，对外界极端条件的影响具有 较强的抵抗力，同时由于其较厚的界面膜，使得在 低温条件下产生的固体脂肪球很难破坏界面膜，所 以SPI-D接枝物具有很好的冻融稳定性。 3.2 红外光谱分析 傅里叶变换红外光谱能够定性鉴定蛋白质-多 糖聚合物分子及其结构。蛋白质和多糖发生接枝反 应的特征就是-OH的引入，在红外光谱上表现为游 离羟基在3 7003 200 cm-1处出现一个更宽的振动 伸缩吸收，C-O键在1 2601 000 cm-1也出现吸收 峰29-30。SPI和SPI-D接枝物的红外光谱图如图1 所示。在图1b中可以看出，接枝物在3 300 cm-1 处相比较于图1a的SPI有更宽的吸收峰， 是因为葡 聚糖分子的接入造成了N-H键的振动。 在1 000 cm-1 也出现了强的吸收， 表明接枝物中形成的C-N共价 键振动增强31-32。因此，葡聚糖是以共价键的形式 接入SPI中，反应物冻融稳定性的提高是由SPI-D 接枝物的产生而实现的。 a. 大豆分离蛋白红外光谱图 a. Infrared spectrum of soybean protein isolate b. 大豆分离蛋白-葡聚糖接枝物红外光谱图 b. Infrared spectrum of soybean protein isolate dextran conjugate 图 1 大豆分离蛋白和大豆分离蛋白-葡聚糖 接枝物红外光谱图 Fig.1 Infrared spectrum of soybean protein isolate and soybean protein isolate-dextran conjugate 4 结 论 1）利用响应面设计建立了湿法糖基化大豆蛋 白的Box-behnken模型，经过检测证明该试验结果 合理可靠，优化出最佳的制备技术条件为大豆分离 蛋白质量浓度40 mg/mL，大豆分离蛋白与葡聚糖 的质量比13，反应时间4 h，得到接枝物冻融前 平均EAI为0.673，冻融后平均EAI 为0.662，改 第 7 期 孙洪蕊等：提高大豆蛋白冻融后乳化性改性工艺优化 285 性产物的冻融稳定性显著（P0.05）提高。改性产 物冻融前后的EAI分别是空白对照的1.687和1.780 倍，ESI分别是对照样的1.367和1.274倍。 2）傅里叶红外光谱证实葡聚糖以共价键的形 式接入大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI） 中，SPI和葡聚糖发生了糖基化反应，提高了改性产 物的冻融稳定性， 所以利用湿法糖基化技术提高大豆 分离蛋白的冻融稳定性具有现实可行性， 为生产出适 合于冷冻食品的专用型大豆蛋白提供了理论依据。 参 考 文 献 1 Molina E, Papadopoulou A, Ledward D A. Emulsifying properties of high pressure treated soy protein isolate and 7S and 11S globulinsJ. Food Hydrocolloids, 2001, 15(3): 263269. 2 李迎秋，陈正行. 高压脉冲电场对大豆分离蛋白功能 性质的影响J. 农业工程学报， 2006， 22(8)： 194198. Li Yingqiu, Chen Zhengxing. Effect of high intensity pulsed electric field on the functional properties of protein isolated from soybeanJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2006, 22(8): 194198. (in Chinese with English abstract) 3 Wang Xibo, Jiang Lianzhou, Xu Wei. Phosphorylation of soybean protein isolates under ultrasound treatment to improve their emulsifying propertiesJ. Journal of Food, Agriculture 2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China) Abstract: Soybean protein has become an important raw material in food processing industries due to its high nutritional value and good functional properties. One of the most important properties of (soybean protein isolate) SPI is emulsifying in food. However, native soy globulins function poorly because of their compact globular structures, which makes it difficult to be utilized directly in food processing. Protein stabilized emulsions are highly sensitive to environmental stresses such as low temperature, and therefore coalescence and creaming occur, which limit their utilization in frozen food. There are no soy protein products specialized for freeze-thaw foods in China. The quality of freeze-thaw foods will be destroyed by the low temperature because the functionalities of soy protein are difficult to maintain. Maillard reaction, a condensation reaction between the reducing end of carbohydrates and the primary amine of proteins, is a well accepted and safe method. This method is the modification of soy protein by maillard reaction for improved functionalities, its reaction processes are conducted without adding any catalyst by heating. In this paper, glycosylation reaction products were obtained under wet-heating conditions in order to improve their freeze-thaw stabilities. Special soy proteins were prepared to meet the demand of soybean proteins in the application of freeze-thaw food system. In order to prepare a kind of soy proteins that can maintain high emulsion after freeze-thaw, the soy protein was modified by wet glycosylation with the dextran as glycosylation donor. Box-behnken model optimizaiton processes were established. The resulting model can be used for analysis and prediction for its goodness of fit. The experiments were designed to explore the effects of three factors including protein concentration, mass ratio of protein and sugar, reaction time on freeze-thaw stability of modified products with response surface methodology. The optimum conditions were obtained with the protein concentration of 40 mg/mL, the mass ratio of protein and sugar of 1:3, and the reaction time of 4 h. The freeze-thaw stability of modified products obtained in this condition was significantly higher than unmodified samples. The emulsifying activity index (EAI) before and after freezing and thawing were 1.687 and 1.780 times of the c