8味单药提取液体外抑制未孢子化卵囊成熟的研究设计与记录.doc

8味单药提取液体外抑制未孢子化卵囊成熟的研究设计与记录筛选对未孢子化卵囊的成熟有抑制作用的中药提取液试验编号： 201403 实 验 人： 王旭川 试验时间： 2014年3月 实验一 8味单药的提取1、 实验目的用水煎法和酒精浸提法提取8味单药的有效成分。2、 实验材料2.1试剂：清水、无水乙醇2.2药品：常山、青蒿、使君子、白头翁、苦参、瑞香狼毒根、苦谏根皮、钩藤2.3器具：铜质碎药钵，大德牌1000g高速摇摆式万能粉碎机（浙江温岭市林大机械制造有限公司）、电子天平、60目筛、砂锅、万用电炉、锥形瓶、试管、容量瓶、量筒等。3、 试验方法3.1水煎法提取：8味单药分别称取10g粉碎，过60目筛，中药粉末用清水浸泡24h，砂锅熬煮30min，取药液，再将剩余药渣加适量清水再熬煮30min，将两次得到的药液混匀，分成两份，其中一份添加适量渗透剂，两种药液分别制成含原药5.0mg/ml的原液。再将两种原液稀释为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml10个浓度。将稀释得到的药液装入小瓶中密封，与剩余原液一同放入冰箱冷藏备用。3.2酒精静置法提取：8味单药分别称取10g粉碎，过60目筛，中药粉末置于锥形瓶中，倒入适量无水乙醇，塞上塞子，放入70温箱中，24h后取出药液冷却，分成两份，其中一份添加适量渗透剂，两种药液分别后制成含原药5.0mg/ml的原液。再将两种原液稀释为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml10个浓度。将稀释得到的药液装入小瓶中密封，与剩余原液一同放入冰箱冷藏备用。实验二 艾美耳球虫卵囊对雏鸡的感染试验1、实验目的用柔嫩艾美尔球虫感染雏鸡以便从粪便中收取大量的球虫卵囊2、 实验材料2.1试验用品： 滴管、镊子、剪刀、玻璃棒、锥形瓶、载玻片、桌布、牙签、烧杯、纱布、手套等均应在80干燥箱中烘干消毒30min。2.2饲养室用品：洗衣粉、刷子、汽油喷灯、汽油、塑料布、铁丝、剪刀、氯制剂、氨水、火碱（naoh）、甲醛（1000ml）、高锰酸钾（500ml）、水（500ml）、灯泡、报纸。2.3试验虫株：柔嫩艾美尔球虫卵囊由中国农业大学动物科技学院病理实验室提供3、 实验方法3.1饲养室的消毒在雏鸡入舍前，先移将动物房清空，清扫干净后，清洗，在动物房干燥后，进行消毒以下。3.1.1冲 先将墙壁、地面、顶棚和其它用具冲洗干净，再用刷子将水槽、料槽和鸡笼刷洗后冲洗干净；3.1.2烧 先将地面的鸡毛与粪便以汽油喷灯烧烤，再将刷干净后鸡笼用汽油喷灯火焰消毒。3.1.3喷洒 消毒要用氯制剂消毒药喷洒地面、屋顶和墙壁，之后地面、地面以上2米的墙壁及其它所有突出墙外的附属设施，然后用3%火碱喷雾和10氨水消毒；用氯制剂消毒药将水槽、料槽浸泡30min以上。3.1.4熏蒸 密闭门窗，进行熏蒸消毒（福尔马林毫升数与高锰酸钾克数之比为2：1。一般按福尔马林30毫升/立方米、高锰酸钾15克/立方米和常水15毫升/立方米计算用量。进行熏蒸消毒时，一般舍温不应低于18，相对湿度以60% 80%为好，不宜低于60%。当舍温在26，相对湿度在80%以上时，消毒效果最好）2448h，用前通风2448h待用。3.1.5电线、塑料布、水槽、料槽的处理80干热放置30min以杀灭球虫卵囊。3.1.6鸡笼处理用塑料布包裹消过毒的鸡笼，将40w的灯泡接于鸡笼中，提前12h开启灯泡，使温度能均衡保持在34左右，并用干湿温度计测定湿度，使其能均衡保持在6065%左右，准备养鸡。3.2球虫含量检测及攻毒剂量的确定 3.2.1用具：塑料布、生理盐水、离心管、载玻片、玻璃棒、移液管、盖玻片、计数板3.2.2用血球计数板计数，计算所用球虫卵囊的含量，并对球虫卵囊做稀释或离心处理，并确定攻毒剂量。3.3增值方法：3.3.1用具：手套、注射器、输液针头、饲料、凉白开、消毒剂3.3.2健康检查：（试验前） 一般采用“五点梅花法”取被检动物或动物群的新鲜粪便l0g，进行健康检查。 （1）取被检动物或动物群的新鲜粪便l0g，放入50ml烧杯中，加入适量水。（2）轻轻搅匀，经60目铜丝网或尼龙网过滤。（3）将滤液移入4支10 ml15 ml试管，2500rmin离心l0min。（4）倾去上清液，各管沉淀物中加入少量饱和盐水，混匀。各管的沉淀物混悬液移入一个5ml玻璃瓶。（5）用饱和盐水加满，盖上盖玻片(盖玻片须能与液面接触)，静置10min。（6）取下盖玻片，放在载玻片上。（7）置载玻片于显微镜台上，用l010或1040的倍数进行检查。（8）判定：如果视野中发现球虫卵囊，可判定为阳性，即说明该动物(群)己受到球虫的感染。未发现球虫卵囊，需重复检查5次，仍未见球虫卵囊，本粪样可判为阴性。只有连续检查粪便7d10d，均未发现球虫卵囊，方可说明该动物(群)未感染球虫。3.3.3鸡群攻毒：经灌胃前五天连续镜检试验鸡粪便，均无发现球虫卵囊后，分别对健康的 日龄小公鸡以 5000个孢子化卵囊/只灌胃，具体操作：确定攻毒剂量后，将一次性输液器管插入鸡嗉囊中，用注射器将球虫卵囊轻轻推入。灌胃后在无球虫环境中饲喂雏鸡标准料，饲料中添加1600mg/kg的土霉素和1800mg/kg的制菌磺，饲料和饮水中不能含有球虫（高压灭菌）。养鸡过程中注意鸡舍的清洁与卫生，出现病死鸡及时剖检，查找病因。收集接种后第139168h粪便及168h盲肠中的球虫卵囊，同时镜检其他肠段有无球虫。实验三 球虫卵囊的收集1、实验目的从感染了柔嫩艾美尔球虫的鸡的粪便中回收球虫卵囊2、实验材料 2.1试剂 洗洁精( 5ml ) 生产厂家：广州立白企业集团有限公司 批号：70140215k70118乙酸(5ml)生产厂家：太原溶剂厂 批号：hg3-1095-77、食盐生产厂家：山西省盐业公司 批号：gf610802100095、凉开水(1桶) 2.2用品和仪器：天平(hc-tp12a-20)，玻璃棒（4个）、18目筛（1mm）、80目筛（孔径约0.2mm）、200目筛（孔径约0.075mm）、离心机3个（dd5m aida）（anke lxj-iib）（lxj-）、烧杯15个、15ml离心管6支、血球计数板1个、麦卡玛斯特计数板1个、温箱(xmtd mc12810132)、显微镜（xsp-24n no.022724）、滴管3个、载玻片若干、盖玻片若干。2.3分离液配制配方：含0.5的洗洁精和2.5%乙酸、灭菌水；配制过程：取一个500ml的烧杯按顺序加入462.7ml灭菌水（凉白开水）+2.5ml洗洁精+33.8ml乙酸。3 实验方法和步骤3.1粪便的收集和处理：将新鲜粪便先用少量生理盐水浸湿，并搅开粪块，然后用10倍的生理盐水浸泡并不时地搅拌，直到粪便中的卵囊大部分溢出到水中（大约1小时）。先用60目筛过滤，后用200目筛过滤粪便，过滤三次。第一次过滤后剩余粪便用5倍于粪便的生理盐水稀释并搅匀后再过滤，第二次过滤后剩余粪便用3倍于粪便的生理盐水稀释并搅匀后再过滤。取盲肠内容物：用剪刀将盲肠纵向剪开，刮取盲肠内容物置于离心管中。将盲肠置于盛有适量生理盐水的研钵中轻研磨、冲洗（重复三次）。并将每次的洗液倒入离心管中。3.2粪便滤液或盲肠内容物悬浮液的处理：将上述得到的粪便滤液或盲肠内容物悬浮液放到离心管里，加生理盐水到离心管的3/4，并加入0.5的洗洁精。2000r/min离心10分钟，检上清，无球虫时弃上清（将上清倒入另外高压过的离心管里进行检测）；于沉渣中加少量生理盐水并将沉渣搅开，再加生理盐水到离心管的3/4，离心，重复洗3次。3.3球虫卵囊的漂浮：向上述离心所得的沉淀中加10倍量饱和盐水（比重1.18）（先加少许，混匀后再加其余的），1500转/分离心5分钟，收集上清液；再重复漂浮12次，检查沉渣，当沉渣中没有或仅有少量球虫时，弃掉沉渣。最后把离心所得饱和食盐水混合。3.4球虫卵囊的沉淀：将上述上清液用生理盐水7倍稀释，2500r/min离心10分钟，检上清，无球虫时弃上清，收集沉淀物（卵囊）。卵囊计数每ml滤液卵囊数计数方法称取10ml滤液。取50ml饱和盐水，加入10ml滤液中。混匀，用吸管吸取少量混合液体，加入计数室内（液体要充满计数室但不要溢出），放于显微镜载物台上，静置12分钟。在低倍镜下（1010）数完两个计数室内见到的全部虫卵，取平均值乘以40，即为每ml滤液中的虫卵数。在分离的卵囊中加入少量（约0.6ml/只鸡）2.5%重铬酸钾溶液搅匀，用血球计数板计数，并用2.5%重铬酸钾溶液将卵囊稀释为1.0105个/ml溶液。3.5培养与保存：取一部分收集到的未孢子化卵囊的重铬酸钾溶液用作中药提取液抑制未孢子化卵囊成熟率的试验，同时将剩余卵囊液放到28温箱中通气培养，并观察孢子发育情况。当完成孢子化卵囊达到85的时，停止培养；贴标签后4冰箱保存（不要靠近冰箱后壁），同时于虫株登记记录本登记批号与收集量。在保存时，粪便和盲肠的卵囊要分开保存。每次操作后对离心机、实验台、地面和隔离器等清理干净后除采用常规消毒外，再用10%氨水消毒1h以上。实验四 8味单药对体外未孢子化卵囊成熟率的影响1、实验目的旨在通过8味单药提取液对体外未孢子化卵囊成熟率的影响的试验筛选出抑制效果较好的几种单药提取液的几个相应的浓度2、实验材料2.1试剂：水煎法提取得到的添加渗透剂和为添加渗透剂的八味单药的0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml10个浓度的药液，酒精静置法提取得到添加渗透剂和为添加渗透剂的的八味单药的0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml10个浓度的药液。2.2虫株：实验三收集到的每毫升1.0105个柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊的重铬酸钾溶液。2.3用具：青霉素小瓶若干、微量移液枪两只、血球计数板1个、麦卡玛斯特计数板1个、温箱(xmtd mc12810132)、显微镜（xsp-24n no.022724）、滴管3个、载玻片若干、盖玻片若干。3、实验方法3.1水煎剂组：在试管中分别配置质量浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml的8味单药药液1 ml，每样平行设3管，并设不加药物空白对照组。于每支试管内分别加入1 ml每毫升含1.0105个未孢子化柔嫩艾美尔球虫卵囊悬液，在2728温箱培养，于 h、 h计数卵囊的孢子化率。3.2加渗透剂水煎剂组：在试管中分别配置质量浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml的8味单药药液1 ml，每样平行设3管，并设不加药物空白对照组。于每支试管内分别加入1 ml每毫升含1.0105个未孢子化柔嫩艾美尔球虫卵囊悬液，在2728温箱培养，于 h、 h计数卵囊的孢子化率。3.3酒精静置组：在试管中分别配置质量浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml的8味单药药液1 ml，每样平行设3管，并设不加药物空白对照组。于每支试管内分别加入1 ml每毫升含1.0105个未孢子化柔嫩艾美尔球虫卵囊悬液，在2728温箱培养，于 h、 h计数卵囊的孢子化率。3.4加渗透剂酒精静置组：在试管中分别配置质量浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml的8味单药药液1 ml，每样平行设3管，并设不加药物空白对照组。于每支试管内分别加入1 ml每毫升含1.0105个未孢子化柔嫩艾美尔球虫卵囊悬液，在2728温箱培养，于 h、 h计数卵囊的孢子化率。4、 实验数据4.1水煎剂组浓度mg/ml药物常山青蒿苦参钩藤白头翁使君子苦谏根皮瑞香狼毒空白对照