(论文)大鼠肝星状细胞系的建立及其生物学特性的研究

第 3 4卷第 3 期 2 0 0 3年 6月 解 剖 学 报 ACTA ANATOMI CA S I NI CA Vo 1 3 4 No 3 J u n 2 0 0 3 大鼠肝星状细胞 系的建立及其生物学特性的研究 冷希圣 翁山耕 李涛 魏玉华 彭吉润 杜如昱 ( 北京大学人民医院肝胆外科 中心 ， 北京 1 0 0 0 4 4 ) 摘 要 目的 建立并鉴定肝星状细胞( H S C ) 细胞 系。 方法 采用肝脏离体胶原酶灌注消化 及密度梯度离 心的方法分离培养大鼠的H S C ； 通过体外长期传代培养后建立 1 株细胞系， 应用细胞形态学观察、 细胞倍增时间测 定 、 细胞生长 曲线绘制、 染色体分析 、 双层软琼脂培养 、 免疫细胞化 学检测 、 R T - P C R检 测、 聚硅酮膜 培养法观 测 H S C 的收缩等方法对其生物学特性进 行研究。 结果H S C细胞系 已传 了 7 8代 ， 保持 着肌成纤维样细胞 的形态学 特 点 。细胞倍增 时间为 3 6 5 h ； 细胞的染色体众数 4 2 条 ， 为正常大鼠体细胞的染色体表型 ； 双层软琼脂 培养 未见细 咆 克隆形成 ； 免疫 细胞化 学检测 表 明， 细胞 系表达 D e s m i n 、 G F A P 、 I型 胶原 、 ll l 型胶 原、 a S M A 、 i N O S 、 I C A M 一 1 、 T G F - a ； R T P C R 检测表明 ， 该细胞系表达 T G F B 、 I C A M 一 1 ； 聚硅酮膜培养法显示 ， H S C细胞系能在 E T 一 1作用下产 生收缩 反应。 结论H S C细胞系符合建系标准 ， 是 1株新建立 的大 鼠肝 星状细胞 系， 命名为 r H S C 一 9 9 ， 可作 为肝硬化 、 门静脉高压 症实验研究的模 型。 关键词 】 大 鼠肝星状细胞系； 细胞系； 细 胞培养 ； 大鼠 中图分 类号 Q 2 2 8 文献标识码 A 文章编号 0 5 2 9 1 3 5 6 ( 2 0 0 3 ) 0 3 2 6 9 ES TABLI S HM ENT OF A NEW RAT HEPATI C S TELLATE CELL LI NE r HSC 9 9 W I TH CHARACTERI S TI CS OF M YOFI BROBLAS T CELL L E N G X i s h e n g I ，WE N G S h a n g e n g ，L 1 T a o ，WE 1 Yu h u a ，P E NG j i - I M fl ，D U R u - y u ( D e p a r t m e n t o fH e p a t o b i l ia r y S u e u，P e k i n g U n i v e r s i t yP e l e H o i t a l ， B e ij i n g 1 0 0 0 4 4， C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t i v e T o e s t a b l i s h a n d i d e n t i f y a n e w r a t h e p a t i c s t e l l a t e c e l l l i n e( r H S C 一 9 9 ) Me t h o d s L i v e r i n v i v o p e r f u s i o n o f c o l l a g e n a s e a n d d e n s i ty g r a d i e n t c e n t r i f u g a t ion we r e us e d t o i s o l a t e h e p a t i c s t e l l a t e c e l l f r o m a n o r ma l r a t Ce l l s we r e ma i n t a i n e d i n c u l t u r e f o r mu hi p l e p a s s a g e s Ce l l p r o l i f e r a t i o n a n d mo r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n we r e s t u di e d o n 6 0 p a s s a g e o f HS C I mmu n o c y t 0 c h e mi s r y a n d R T P C R w e r e u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o f d e mi n， GF AP ， a S MA， c o l l a g e n t y p e 1 a n d ， i NOS， I CAM一 1，T GF - a，I L- I O a n d TGF - a i n 6 0 p a s s a g e o f HSC Si x t y p a s s a g e c e l l s we r e c u l t u r e d o n s i l i c o n e me mb r a n e t o i n v e s t i g a t e t h e c e l l c o n t r a c t i o n Gi ms a s t a i n me t h o d wa s u s e d t o a n a l y z e k a r y o t y p eRe s u l t s r HS C一 9 9 c e l l h a s u nd e r g o n e： 7 8 p a s s a g e s I t s mo r p h o l o g i c a l c h a r a c t e ris t i c s r e s e mb l e my o fi b r o b l a s t c e l 1 Th e c e l l d o u bi n g t i me i s 3 6 5 h o u r s I mmu n o c y t 0 c h e mi s t r y s h o w e d t h a t D e tai n ， GF A P， a S MA， c o l l a g e n t y p e I a n d I l l ， i NO S ， I C A M一 1 ， T G F - a w e r e e x p r e s s e d i n r HS C 一 9 9 c e l l s R T - P C R a n aly s i s s h o we d t ha t TGF一 8 a n d I CAM一 1 we r e e x p r e s s e d i n r HS C一 9 9 c e l l s Ce l l c o n t r a c t i o n wa s i n d uc e d b y ET一 1 Ce l l c l o n e wa s n o t f o rm e d a f t e r 1 4 d a y s c u l t u r e i n s o ft a g a r r HS C一 9 9 c e l l s di s p l a y e d n o rm a l r a t k a r y o t y p e wi t h 4 2 c h r o mo s o me s i n mo d a l n u mb e r Co n c l u s i o n r HS C一 9 9 e e l l l i n e e x h i b i t s c ha r a c t e r i s t i c s o f a c t i v a t e d h e p a t i c s t e l l a t e c e l 1 I t wi l l be a us e f u l t o o l t o s t u d y 【 1 1 e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r c i r r h o s i s a n d p o r t a l h y p e r t e n s i o n K e y w o r ds r H S C 一 9 9 ； C e l l l i n e ； C e l l c u l t u r e ；R a t 肝 星状 细胞 ( h e p a t i c s t e l l a t e c e l l ， H S C ) 具 有 生成 细胞外基质 ， 分泌细胞因子以及收缩等多种功能， 在 收稿 13 期 2 0 0 2 ， 0 9 ， 1 3 修 回13期 2 0 0 2 ， 1 2 2 0 基金项目 国家 自然科学基金资助项 目( 3 9 9 7 0 7 2 2 ) 作者简介 冷希圣 ( 1 9 4 5 一 ) ， 男( 汉族) ， 辽宁 复县人 ， 医学博 士 ， 外科学教授 ， 博士生导师 ， 中华外科学会 副主 任委员， 北京大学 人民医院肝胆外科中心主任。 *通讯作者( T o w h o m c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d ) 肝硬化、 门静脉高压症 的发生发展 中起了关键性的 作用， 已成为肝硬 化实验研究 的热点 。 。但 H S C 分离培养难度大 ， 不仅 步骤繁复 ， 不 易成功， 而且产 量较低 ， 无疑给研究工作带来很大的困难 。因此 ， 建立能连续传代的肝星状细胞系， 对于肝纤维化的 实验研究 十分必要。 目前 ， 国际上有 5位学： 报道建立了 H S C细胞系， 国内尚未见 H S C细胞系建 立的报道。我们从正常 Wi s t a r 大鼠肝中分离出来 的 1 个 H S C细胞系已连续传 了7 8代 ， 保持着激活后 的 维普资讯 解 剖 学 报 3 4卷 ， 3 期 H S C的生物学特性。现报道如下。 材料和方法 1 材 料 1 1 细胞来源 ： Wi s t a r 大 鼠， 雄性， 体重 4 6 7 g ， 由 北京大学医学部实验动物科学部提供。 1 2 主要试 剂： 型胶 原酶 、 N y c o d e n z均购 自 S i g m a 公司； 胎牛血清购 自H y c l o n e 公司； 鼠抗人结蛋 白( D e ta i n ) ， 鼠抗人胶质纤维酸性蛋 白( g l i a d f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n s ， G F A P ) 单 克隆抗体， 鼠抗人 q 平滑肌 肌动蛋 白( q s m o o t h m u s c l e a c t i n ， q S M A ) 单克隆抗体 ， 羊抗 鼠 细 胞 间 粘 附 分 子 1( i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e 1 ， I C A M一 1 ) 多克隆抗体均购 自D a k o 公司； 兔 抗人 I型胶原( c o l l a g e n t y p e I) 和 型胶原( c o l l a g e n t y p e m) 多克隆抗体均购 自武汉博士德公司 ； 兔抗 鼠 诱导型一氧化氮合酶( i n d u c i b l e n i t ri c o x i d e s y n t h a s e ， i N O S ) 多克隆抗体购 自 S a n t a C l 3 1 Z 公司； 鼠抗人转化 生长因子一 q ( t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - a ，T G F q ) 单克 隆抗体购 自C a l b i o c h e m公司；内皮素 1 ( e n d o t h e l i n 1 ， E T 一 1 ) 购 自 S i g m a 公司 。 2 方法 2 1 H S C的原代分离培养及鉴定 ： H S C细胞系于 1 9 9 9 年 1 2月 2 3日分离 ， 分离方法见参考文献 9 ， 1 0 。采用肝脏离体 C o l l a g e n a s e 循环灌注消化及密 度梯度离心的方法分离 H S C， 方法简述如下 ： 大鼠门 静脉插管， 首先灌注含 0 2 g L E D T A， 2 4 g L H e p e s 的 D H a n d k液， 同时将肝完整地分离下来 ， 紧接着反 复循环灌注浓度为0 3 g L的C o l l a g e n a s e I V 灌注液， 直 到肝组织完全软化。然后以含 0 4 L C o l l a g e n a s e IV， 0 0 2 g L D N A s e I的振荡消化液消化 3 0 m i n ( 3 7 ) 。 所得细胞悬液经 1 5 0目、 2 0 0目钢网过滤 ， 2次低速 离心去除肝细胞后 ， 以浓度为 1 1 0 g L的N y c o d e n z 液 重悬 细 胞 ， 在 细 胞 悬 液 上 再 小 心 地 滴 加 1层 R P M1 6 4 0液。 1 5 0 0g 离 心 2 0 m i n( 2 0 ) ， 将 R P M1 6 4 0液与 1 1 的 N y c o d e n z 交界面的 H S C吸出。 细胞悬浮于含 2 0 ( 体积分数 ) 胎牛血清的 M1 9 9培 养液中。分离所得 H S C用 台盼蓝染色鉴定细胞存 活率； 荧光显微镜下观察并计数刚分离出来的细胞 中能 自发蓝绿色荧光的细胞数； 原代培养 2 d后 ， 应 用 D e s m i n 、 G F A P免疫细胞化学 s P法染色鉴定细胞 纯 度 。 2 2 细胞形态学 观察 ： 用 O l y m p u s I X 7 0倒 置相 差 显微镜以及透射和扫描电镜进行观察。 2 3 细胞生长曲线绘制， 细胞倍增时间测定 ： 按 文献 1 1 方法 ， 选生长状态 良好、 处于对数生长期的 第 7 0代细胞 ， 将细胞以 11 0 4 个 孔的浓度接种于 2 4孔板 中培养。从第 2 d开始 ， 每天用传代消化液 消化 3孔细胞 ， 计数每孔平均细胞数。以培养时间 为横轴 ， 每孔平均细胞数为纵轴 ， 绘制出细胞生长曲 线并计算出细胞倍增时间。 2 4 染色体分析： 按文献 1 2 ， 常规制备染色体 ， G i e m s a 染色法行染色体显示并进行染 色体 G显带 分析。 2 5 双层软琼脂培养 ： 按文献 I I ， 常规制备双 层软琼脂 ， 选 生长状 态 良好 ， 处于对数生长期 的第 7 0代细胞 。3 7 ， C O ， 培养箱培养 1 4 d ， 观察细胞克 隆形成情况。H e l a细胞作为对照。 2 6 免疫细胞化学检测 ： 免疫细胞化学 s P法染 色检测培养 7 0代的 H S C细胞系中， I型胶原 、 型 胶 原 、 q S M A、 D e s m i n 、 G F A P 、 i N O S 、 I C A M 1和 T G F q 的表达情况。 2 7 R T P C R检测 ： R T P C R检测 7 0代 的 H S C细 胞系中 T G F J3 、 I C A M 1 、 I L 一 1 0的表达情况 ， 引物序列 及扩增片段长度见附表 ， R T P C R均采用 2 5 l 反应 体 系， 反应 条件为 预变性 9 4 o C， 2 r a i n ， 变 性 9 4 ， 3 0 S ， 退火 5 5 ， 3 0 S ， 延伸 7 2 C， 5 0 S ， 共 2 8个循环 ， 后延伸 7 2 ， 5 m i n 。 附表P C R引物 T a 【b l e P r i me r s T GF 8 5 TGA 5 1 lGGGAC T GA T CC CA 1 1 1GArr _ 3 I CAM 1 5 G A G C G AC C TG GAGAG CA 3 5 C AGGG ACT I C C AT CC AC C T 3 I L 1 0 5 C T GGC T C AGC AC T GC TA T 3 5 A rr CA TG GC CTr G TA CAC AC 3 6 - a c t in 5 T G G G A C G A T A T G G A G A A G A T 3 5 A Tr GC CGA T AGT GA T GAC CT 3 4 0 9 b p 4 7 3 B P 5 2 3 b p 2 8 聚硅酮膜( s i l i c o n e ) 培养法观测 H S C的收缩 ： 按 文献 1 3 的方法制备聚硅酮膜盖玻片。取 7 0代的 H S C细胞 ， 以 11 0 个 m l 浓度接种 于含 聚硅酮膜 盖玻片的培养皿 中。3 d 后 ， 将培养皿分为对照组和 内皮素 1 ( E T - 1 ) 作用组 。对照组加 P B S ， E T 1组加 E T 1至终浓度为 21 0 m o l L 。每组于加药前及 加药后 2 0 m i n在倒置显微镜下摄 片。比较前后 照 片， 分析加药前后 同一视野细胞周 围的聚硅酮膜皱 纹变化。根据皱纹的增减来判定细胞 的舒缩 ， 增多 表明收缩 ， 减少表明舒张。 维普资讯 V o l 3 4 N n 3 冷希圣等 大鼠肝 星状细胞系的建立及其生物学特性的研究 2 7 结 果 1 基本情况 r H S C 一 9 9细胞 系于 I 9 9 9年 l 2月 2 3 日分 离出 来。刚分离出来的细胞约 8 0 能在 3 2 8 l t m波长的 激发光下发出极易淬灭的蓝绿色荧光( 图 1 A， B ) ； 原 代培养 2 d后 ， 行免疫组织化学 s P染色鉴定 ， D e s m l n 阳性细胞 占9 1 ， G F A P阳性细胞 占7 7 ， 而 D e s m l n 加 G F A P双染 色阳性细胞 占 9 7 原代培养 2 0 d 后， 按 1 ： 2传第 1 代。以后每隔 71 0 d ， 按 1 ： 2传 代。2 0代后 ， 渐改为每 56 d ， 按 1 ： 3传代。3 O代 后， 改为每 4 d ， 按 1 ： 3传代。此外 ， 每隔 3 5代 ， 将 部分 细胞 冻 存。冻存的 细胞复苏后 ， 存 活率 大于 9 0 ， 形态和增殖能力保持不变。到 2 0 0 2年 3月 1 日为止， 细胞已传 了7 8代 ， 命名为 r H S C 一 9 9 。 2 形态 学特点 贴壁生长的 r H S C 一 9 9细胞表现 为肌成纤维样细 胞的形态学特点 传代的细胞贴壁 57 h后 ， 即开 始伸展 ， 胞体增大呈多边形， 直径可达 7 O 9 0 m， 并 伸出许 多细长的伪足而呈星形外观( 图 2 A ，B ) ：细 胞大量增殖， 细胞 密度变大后 ， 细胞形态可变小， 略 呈梭形， 并相互融合呈片状 ：透射 电镜和扫描 电镜 见 r H S C 一 9 9细胞 的胞体和胞核大， 胞体四周伸 出众 多伪 足 ( 图 3 ) 3 细胞生 长特性 培养于 2 4孔板的 r H S C 一 9 9细胞 ， 接种后 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6和 7 d的每孔细胞数分别为 0 6 1 1 0 、 0 9 2 l 0 、 1 9 81 0 、 3 3 l1 0 4 8 8 x 1 o 4 、 5 1 51 0 和 5 21 1 0 。绘制细胞生长曲线 ， 见图 4 。测算细胞 倍增时 间为 3 6 5 h 4 染色体显示结果 r H S C 一 9 9细胞染色体显示结果 见图 5 。计数 5 O 图 I 新鲜 分离的 H S C在 3 2 8唧 波长的激发光下 ， 发出蓝绿色荧光 A 荧光显微镜下 刚分离出来的 H S C x l 0 0 ；B 培养 2 d后， 倒置相差显微镜观察 4 0 O 图 2 H S C的形态学特点 A 原代培养的H S C x 1 0 0 ； B 第 7 0 代的r V ,S C 9 9 细胞x l 0 0 F i g 1 A u t o fl u o e n c e n f fle s h l y i s o l a t e d H S C AF r h l y i l a t e d HS C x l o o；B，O b s e r v e d u n d e r l ig h t p h a s e - c o n t r a i l mi c r o s c o p e a f t e r c u l t u d 2 d s x 4 0 0 F i g 2 Mo r p h o lo e a l c h m c t 0 n 0 f H S C A，P r i ma ,3 c u l t e o f t h e H S C 1 0 0；BT h e 7 0 t h p a s s a g e r S C一 9 9 x I C O 维普资讯 图 3 扫描电镜观察第 7 0 代 x 8 0 0 F i g 3 啤 e l ：t mn mi c ms c o W ， r 山 7 0 t h r l IS C - 9 9 x 8 0 3 罔 4 第 7 0代 I I S C的生 长曲线 F i g 4 Gr o wt hc o f t h e 7 0 t h p a s e r lt S C- 9 9 图 5 第 7 O代 H S C染色体显示 F i g 5 K a r D J t y p i t a r 1 v * o f t h e 7 0 t h p a s s a g e dI S C 一 9 9 个 r H S C 一 9 9细胞 系 染色 体分裂相 ， 4 2条染色体 占 7 4 ( 3 7 5 0 ) ， 4 2条 染色体占 1 6 ( 8 5 0 ) 染色体众数为 4 2条， 是正常 大鼠体细胞的染 色体表型。染色体 G显带分析无 畸变 。 5 双层软琼脂培养结果 第 7 0代 r H S C 一 9 9细 胞 在双 层软 琼 脂 中培 养 3 4卷， 3期 1 4 d ， 未 见细胞克隆肜成。作为对照的 H e l m细胞在 烈层软琼脂中培养 1 0 d 即可见细胞克隆形成。 6 第 7 0 代 r HS C 9 9细胞 的免疫 细胞化 学检 测结 果 l l e s mi n 、 GF A P、I 胶 原 、 型 胶 原 、 一 S MA、 i N O S 、 I C A M 一 1 和 T G F 一 均表达阳性 ， 见图 6 、 7 第 7 0 代 r HS C 9 9细胞的 R T P C检测结果 T G F 一 日阳性 ， I C A M 1阳性 1 1 一 l 0阴性 一 8 细胞 的收 缩 聚硅 酮膜上 培养 3 d后 ， 超 过 5 0 的 r H S C 一 9 9在 其周围出现皱纹。盯 I 作用 2 0 ra i n后 H S C周围的 聚硅酮膜皱纹明显增多( 7 ) 。 讨论 1 9 8 2年 K n o o k 成功分离培养 r H S C ， 才使 H S C 的研究取得突破 现已明确 H S C在肝纤维化的发 牛发展中起 J 核心 r E 的作 ， H S C成为肝纤维化和 门静脉高压症实验研究领域 的热点 。 由于人肝 标本罕 见 因此研 究用的 H S C基本上取 材于大 鼠一 尽管近年来 H S C的分离培养技术已经有 J ， 很大 的 发展， 但操作步骤仍 十分繁复 ， 易掌握 ； 此外 由于 H S C在肝总体细胞中所占的比例很少， 因此产量 有 限， 即使熟练掌握 ， 缚 只大 鼠的 H S C产量也只能 达 到 l 0 个的级别 ， 远远不能满足实验 研究的大 量 需要。而多次分离， 叉会增加实验误差。因此 建立 能连续传代的 H S C细胞 系作为实验工具 对肝纤维 化和门静脉高压症的研究来 说， 有着十分重要的意 义 目前 国内 尚术见 H S C细 胞 系建 立 的报 道 ， 国 际 上仅见 5位学者报道建立 了 H S C细胞系。G r e e n w e l 等 从 J E 常大 鼠和 C C I 诱 导的肝硬化 大鼠中分 别 分离培养出 N F S ( 和 C F S C两个细胞 系We i l l 等 的 G R E F - X细胞 系是将 S V 4 0病毒大 T抗原编码序 列转染 人 H S C获得的 K i l a m u r a等 用 S V 4 0的温 度敏感突变株 t s A 6 4 0转化小鼠 H S C 建立了 A 6 4 0 一 I S 细胞系而 Mu r a k a m i 等 的 L I 9 0 I t S C细 胞 系 则 源 于人肝问质肿瘤细胞。最 近， S e h n a b l 等 将端粒酶 的催化亚单 位 h T E R T转 染人 的 H S C获 得 了 I株 H S C细胞 系。 我们建立的 r H S C 一 9 9细胞系是 l 9 9 9年 l 2月 2 3 日从 1 只 正常 Wi s t a r 大 鼠肝 中 分离 培 养 的 ， 经 过 连 续传代 ， 到 2 0 0 2年 3月 1日为止， 已经传 了 7 8代 r H S C 一 9 9细胞 系具有 激活后 H S C的几个 主 要生 物学 特性 一 ： 1 形态学 丧现为脂滴消失， 胞体增大 ， 胞突伸展 ， 伸 出细长的伪足而呈星形外观；2能表 达 S MA， 此 为激 的H S C 的特征性标 志 ； 3 表达 i 一 譬 告 l。 辱 维普资讯 V o l 3 4 N n 3 冷希圣等 火 鼠肝型状细胞 系的建立及其生物学特性 的研究 -2 7 3 _ ； A 6 围 7 F i g 6 F i g 7 6E 蘸 6 8 免疫细胞化学染色x1 0 f ) A D e s m i n阳性；l l G F A P阳性 ；C I型腔原 阳性 ； D田型胶原 阳性；E a s MlII j 性 ；F i N O S阳性 内皮素 1 诱 导 r HS C 一 9 9细胞收缩 4 0 0 A 加药 前；B加药 l 5 m -n后 胞体变小 皱纹增 多 h mn u n o c y l t c h a mi s t r y of t h e 7 0 1 h p a e r H S C 一 9 91 O f ) A， P t s i fi v e o f1 ) e mi n ：B P o s i t i w- of GF A P；C， P o t s h i v eof c o l la g e n E P o s it iv a o l S MA：F P o s i ti v e o fl N OS r I S C 一 9 9 c e l t c n t r a c t io n i n d u c e d b y e n & t h e li n I x 4 0 0 A u n t r e a le d ：B A ft e r 1 5 mi n n f e n d o t h e l i n - I a d mi n i s t r a t io n t h eh P o f w nn Ne w r r P R s e d 矗 维普资讯 2 7 4 解 剖 学 报 3 4卷 ， 3 期 D e s m i n和 G F A P ； 4 能分泌 I型胶原和 型胶原等 细胞外基质 ； 5 具有收缩功能： 6 有分泌 T G F L a 等 细胞因子的能力。此外 ， 从染色体分析和软琼脂培 养结果上看 ， r H S C 一 9 9细胞系属于未转化的细胞。 r H S C 一 9 9细胞系是经长期培养 ， 传代后 自发产生 的， 而非人为转化、 转染后获得 ， 因此更符合 H S C的 自然特性。此外， 与国外学者建立的 H S C细胞系相 比， 本细胞系还有以下几个特点 ： 1 具有收缩功能 ， 我们应用聚硅酮膜培养法发现， r H S C 9 9细胞系能在 E T 1 的刺激下迅速产生收缩反应 ， 收缩功能是 H S C 的重要功能之一。位于 D i s s e间隙的 H S C紧贴着肝 窦内皮细胞， 伸出大量长胞突 ， 包统着肝血窦。因 此 ， H S C的舒缩可以直接调节肝血窦的微循环 ， 从而 影响肝脏的血流分布和门静脉压力 。此外 ， r H S C 一 9 9 细胞系表达 i N O S ， 说明其具有合成 N O的能力 ， N O是一种信号传递分子， 可诱导多种生物学效应 ， 并具有强烈 的促 H S C舒张作用 “ 。因此 ， r H S C 一 9 9 细胞系可作为实验工具 ， 用于 H S C的收缩调控 、 降 低门静脉压力的新药筛选等领域的研究 ； 2 同时表 达 D e s m i n和 G F A P 。中间丝蛋白 D e s m i n和 G F A P是 目前鉴定 H S C的最可靠指标 ； 3 表达 I C A M一 1和 T G F a等。不同来源的细胞系可以具有不同的生物 学特性 ， r H S C 一 9 9细胞系具有的这几项重要特性 ， 其 他 H S C细 胞 系 未 见报 道 。 因此 ， r H S C 一 9 9细胞 系 的 建立有助于对 H S C生物学特性全面、 深入的研究。 总之 ， 我们建立 的 r H S C 9 9细胞保持着激活后 的 H S C的生物学特性 ， 作 为实验工具， 为研究肝纤 维化、 门静脉高压症的发病机理， 筛选有效的抗肝纤 维化、 降低门静脉压力的药物， 提供 了理想的实验模 型， 具有很大的应用价值。 参 考 文 献 1 M a r c L H， A l b e a G T h e h e p a t i c s t e l l a te ( h o ) c e l l ： i t s r o l e i n h u m a n li v e r d i s e a s e J V i r c h o w s A r c h ， 1 9 9 7 ， 4 3 0 ( 3 ) ： 1 9 5 2 0 7 2 R e y n a e r t H， T h o m p s o n M G， T h o m a s T， e t a1 H e p a t ic s t e l l a t e c e l l s ： r o l e i n m i c roc i r c u l a t io n a n d p a t h o p h y s i o l o g y o f p o r t a l h y p e rt e n s i o n l J J G u t ， 2 0 0 2 ， 5 0 ( 4 ) ： 5 7 1 - 5 8 1 3 R a m m G A I s o l a t io n a n d c u l tu r e o f r a I h e p a ti c s t e l l a t e c e l l s J J G a s t r o e n t e r o l H e p a t o l ， 1 9 9 8 ， 1 3 ( 8 ) ： 8 4 6 8 5 1 4 G r e e n w e l P ， S c h w a r t z M， R o s s a s M， e t al C h ara c t e ri z a t io n o f f a t - s t o r i n g c e l l l i n e s d e ri v e d f o 1 T U n 0 mal a n d C C 1 4 c i r r h o t i c l i v e r s 【 J J L a b I n v e s t ， 1 9 9 1 ， 6 5 ( 6 ) ： 6 4 4 - 6 5 3 5 We i l l F X， B l a z e j e w s k i S ， B l anc J F ， e t a1 C h ar a c t e ri z a t i o n o f a n e w h u man l iv e r my o f i b r o h l a s t c e l l l i n e ： t r an s c ri p t i o n al r e g u l a t i o n o f p l a s mi n o g e n a c t i v a t o r i n h i b i t o r ty p e I b y t r a n s f o r mi n g g r o w t h f a c t o r D 1 J L a b I n v e s t ， 1 9 9 7 ， 7 7 ( 1 ) ： 6 3 - 7 0 6K i t a m u r a Y， T ani g a w a T， K a t s u m o t o T， e t a1C e l l g r o wth and d if f e r e n t i a t i o n o f a n o v e l m o u s e h o( f a t s t o ri n g )c e l l l i n e t r a n s f o r m e d b y a t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e m u t ant o f s i m i an v i r u s 4 0 J H e p a t o l o g y ， 1 9 9 7 ， 2 6 ( 2 ) ： 3 2 3 3 2 9 7 Mu r a k a m i K， A b e T ， M i y a z a w a M， e t a1 E s t a b l is h m e n t o f a n e w h u ma n c e l l l i n e ， L I 9 0 ， e x h i b i t i n g c h ar a c t e ri s t i c s o f h e p a t i c I t o ( f a t s to ri n g )c e l l s J L a b I n v e s t ， 1 9 9 5 ， 7 2 ( 6 ) ： 7 3 1 7 3 9 8 S c h n a b l B ， C h o i Y H， O l s e n J C， e t a1 I m mo rt al a c t iv a t e d h u m an h e p a t i c s t e l l a t e c e l l s g e n e r a t e d b y e c t o p ic t e l o m e r a s e e x p r e s s i o n J L a b I n v e s t ， 2 0 0 2 ， 8 2 ( 3 ) ： 3 2 3 3 3 3 9 K n o o k D L， S e f f e l a a r A M， d e L e e u w A M F a t s t o ri n g c e l l s o f t h e r a t l i v e r T h e ir i s o l a t i o n a n d p u ri fi c a t i o n J E x p C e l l R e s ， 1 9 8 2 ， 1 3 9 ( 2 ) ： 4 6 8 4 71 1 0 We n g S G， L e n g X S H， We i Y H， e t a1 A n i m p r o v e d m e t h o d o f i s o l a t i n g and i d e n t i i n g r a t h e p a t i c s t e l l a t e c e l l s J J P e k i n g U n iv e rs i t y ( h e alt h s c i e n c e s ) ， 2 0 0 1 ， 3 3 ( 1 ) ： 8 3 8 6 翁山耕， 冷希圣 ， 魏玉华， 等 改 良法大鼠肝星状细胞的分离 培养 及鉴定 J 北京大学学报 ( 医学版) ， 2