【SN商检标准】snt 1134-2002 进出口肉及肉制品中维吉尼霉素 残留量检验方法 杯碟法.doc

method for the determination of virginiamycin residues in meats and meat products for impor-t-cyalnidnderxpomretthodsnt 1132002前言本标准中的测定方法是采用日本厚生省1990年所编制的畜、水产食品中的残留物质检验方法中维吉尼霉素检验方法，其技术内容与原方法相 同，具体操作方法稍加改动，经试验和验证后，按规定要求作了编辑性修改。本标准中同时制定了抽样和制样方法。测定低限是根据国际上对肉品中维吉尼霉素残留量和测定方法灵敏度而制定的。 本标准的附录a是规范性附录，附录b是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王素琴、何霖、孙俐、陈子红。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1 范围 本标准规定了进出口肉及肉制品中维吉尼霉素残留量检验的抽样、制样和杯碟测定方法。 本标准适用于进出口冻鸡肉中维吉尼霉素残留量的检验。2 抽样和制 样2.1 检验批以不超过2 50为一检验批。同一检验批的商品应具相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2 抽样数量批量件最低抽样数件12512 100510 2501025 5001550 1 000171 0012 500202.3 抽样方法 按2.2规定的抽样件数随机抽取，逐渐开启。每件至少一袋为原始样品。如每件中无小包装或有小包装，但每袋重量超过2 k则可用灭菌刀从每件中割取不少于100样g 品，混合后置于清洁容器内作为混合样品。原始样的总量不少2 k，加封后标明标记，及时送交实验室。2.4 试样制备进出口肉及肉制品中 维吉尼 霉素残留量 检验 方法杯 碟法从原始样品中取出部分有代表性的样品，将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于500封后，标明标记。2.5 试样保存，g 作为试样，装入清洁容器内，密注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染后发生残留物含量的变化。3 测定方法3.1 方法提要 用乙醇提取试样中残留的维吉尼霉素，经均质、离心后取上清液作为样液，取上清液与结膜干燥棒杆菌作用，根据产生抑菌圈直径大小，并查阅标准曲线，计算出样品中维吉尼霉素的残留量。3.2 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。本方法标准品及其标准溶液均以效价计。3.2.1 无水乙醇。3.2.2 无水甲醇。3.2.3 甲醇+水(1+2)。3.2.4 生理盐水：称取8.5氯g 化钠，溶于1 000水ml中，121灭菌15 mi。3.2.5 磷酸二氢钾。3.2.6 磷酸氢二钠。3.2.7 磷酸盐缓冲液(ph6.o)：称取3.5磷g 酸二氢钾(精确至0.1 g溶于400 m水中，另外称取3.0磷g 酸氢二钠(精确至0.1 g，溶于400 m水中，将两种溶液混合在一起定容至1 000。ml3.2.8 维吉尼霉素标准品。3.2.9 维吉尼霉素标准贮备液：准确称取适量的维吉尼霉素标准品，用甲醇溶液(3.2.3)溶解后定容至50 m，配成1 000gml的维吉尼霉素标准贮 备液，于4保存，一周内使用。3.2.10 维吉尼霉素标准工作液：吸取一定量的标准贮备液，用磷酸盐缓冲液分别稀释成浓度为o.025gml、0.05gml、0.1gml、0.2gml、0.4gml和0.8gml标准工作溶液，以上稀释均须当日配制。3.2.11 实验菌种：结膜干燥棒杆菌(corynebacterium xerosis。)3.2.12 培养基i(见附录a1)。3.2.13 培养基(见附录a2)。3.2.14 培养基(见附录a3)。3.3 仪器和设备3.3.1 游标卡尺：测量范围0 m200 m，精度0.02 m，或抑菌圈测量仪。3.3.2 牛津杯：高10 m0.1 m内径6.o m0.1 m，外径8.o m0.1 m。将试样于一18以下冷冻保存。3.3.3 离心机：不低于3 000 rmin。3.3.4 恒温培养箱：301，361，501，隔板保持水平。3.3.5 高压灭菌器。3.3.6 绞碎机：不低于3 000 rmin。3.3.7 均质器：不低于10 000 rmin，带均质杯250 m。3.3.8 培养皿：内径90 m，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，并应配有陶瓦盖。3.3.9 其他：玻璃板、吸管、毛细管等。3.4 测定步骤准确称取10液。试g 样(精确至0.1 g于均质杯中，加入10 m乙醇，均质2 mi后移人离心管中，以3 000 rmin离心20 mi，取其上清液，作为试3.4.2 菌液的制备将实验菌种(3.2.11)安瓿瓶的上部消毒后敲碎，加入少量培养基于试验菌种中，使其充分溶解并移至盛有培养基的试管中混均，置371培养24，h 将培养物划线接种到培养基i斜面上。用适量灭菌生理盐水冲洗菌苔并转入灭菌试管中，4保存，可使用一周。3.4.3 测定3.4.3.1 平板制备将培养基熔化并冷却至501，加入适量的菌液，使之充分混合后，取8 m注入灭菌平皿中，保持水平，待其凝固后备用。 测定前，须先用0.05gml及0.2 gml的维吉尼霉素标准工作液进行预测试，经培养后，o.05gml标准工作液所呈现的抑菌圈直径在10 mm15 tri，而0.2 vml标准工作液所呈现的抑菌圈直径在15 m20 m该菌液浓度为最佳。3.4.3.2 标准曲线的绘制用0.025 gml、0.05 gml、0.1 gml、0.2gml、0.4gml和0.8 gml共六个浓度的维吉尼霉素标准工作液，其中用于最低浓度 (0.025gml)的三个检定平板作为产生阴性结果的对照，并以o.2gml作为参考浓度。标准曲线上的每个标准浓度取三个检定用平板为一组。在每 个检定用平板上放置六个牛津杯，其中三个加满参考浓度溶液，另三个加满标准浓度溶液，参考浓度与标准浓度溶液要间隔放置，五个标准浓度共用15个检定用平板，含量最低的标准浓度的三个检定用平板作为阴性结果的平板对照，其他12个检定用平板绘制标准曲线。将陶瓦盖盖好，4放置1h 2后h 于30土1培养17h 1，h 最后在361培养6，h 然后翻转平板，除去牛津杯，精确测量产生的抑菌圈直径(精确到0.1mm)，用所有45个参考浓度抑菌圈直径的平均值与各平板参考浓度抑菌圈直径平均值的差值作为每个平板的校正值，来校正其他各标准浓度的抑菌圈直径的平均值。将校正后的值，用式(1)、式(2)算出l和h，在半对数坐标纸上以抑茵圈直径(mm)为横坐标(算术级)，以浓度gml为纵坐标(对数级)绘制标准曲 线。 (1) (2)式中： l标准曲线上的最低浓度(0.05gml)抑菌圈直径，单位为毫米(ram)； h标准曲线上的最高浓度(0.8 gml)抑菌圈直径，单位为毫米(ram)； c标准曲线中全部参考浓度抑菌圈直径的平均值，单位为毫米(mm)；a、b、d、e分别表示标准曲线中其他浓度标准工作液(0.05gml、0.1 gml、0.4gml、o.8gml)的抑菌圈直径经校正的平均值，单位为毫米(ram)。3.4.3.3样液的测定每个样液用三个检定平板，每个平板平均置六只消毒的牛津杯，间隔注满样液和0.2gml维吉尼霉素标准工作液，4放置1h 2后h ，于301培养17h 1，h 最后在361下培养6 。h3.4.1 试液制备3.5结果的计算和表述培养后，测量抑菌圈直径，如样液抑菌圈直径小于12 m，即报告为“阴性”；如大于等于12 m，分别求出三个平板中0.2 gml标准液及样液 产生的抑菌圈直径平均值，经校正并查标准曲线，再用式(3)计算试样中维吉尼霉素的含量。(3)x试样中维吉尼霉素的含量，单位为毫克每千克(mgkg)；c从标准曲线上查出样液所对应的抗生素浓度，单位为微克每毫升(vgml)；m最终试液所代表的样品浓度，单位为克每毫升(gml)。注：如测定结果呈阳性，即抑菌圈直径平均值大于等于12 m，需进行确证试验(参见附录b)，以证明抑菌物确系维吉尼霉素。4 测定低限、回收率4.1 测定低限本方法的测定低限为0.05 mkg。4.2 回收率鸡肉中维吉尼霉素添加浓度及其回收率的实验数据：0.05 mkg时，回收率为80.0 ；%0.1 mkg时，回收率为81.0；0.2 mkg时，回收率为81.3。附录a(规范性附 录)培养基成分及制 备方法a1 培养基i蛋白胨100 g 牛肉膏50 g 氯化钠25 g 琼脂120 g水1 000 ml将上述各成分于水中加热溶解，用1 mo压灭菌15 mi，制成斜面备用。a2培养基蛋白胨10.0 g 牛肉膏5.0 g 氯化钠2.5 g 水1 000 mll氢氧化钠溶液或10盐酸调节ph，使其灭菌后ph值为6.50.1，分装于试管或克氏瓶内，于121高式中：将上述各成分溶于水中加热溶解，用1 mo min。a3培养基蛋白胨10.0 g 牛肉膏3.0 g 氯化钠5.0 gl氢氧化钠溶液或10盐酸调节ph，使其灭菌后ph值为7.00.1，分装于试管内，121高压灭菌15水1 000 ml琼脂12.0 g将上述各成分子水中加热溶解，用1 moll，氢氧化钠溶液或10盐酸调节ph，使其灭菌后ph值为6.70.1，分装于三角瓶内，121高压灭菌15 min。附录b(资料性附 录)确 证 试 验 确证试验采用生物自显影法，用标准品作对照，求rf值。 微量注射器：50l。薄层板：硅胶，qyt25785sg，5 cm20 cm，使用前110活化2 h。 展开剂：三氯甲烷+甲醇+乙酸(86+12+2)。展开槽：240 cm57 cm32 cm。 点样量：20l。长方形培养皿：20 cm10 cm5 cm。 展开：在饱和槽内进行。检测：取经活化的薄层板，在其下端2 cm处划一条基线，然后在该线上分别取20l试液和0.20 gml浓度的维吉尼霉素标准溶