乙型病毒性肝炎的实验室检查.ppt

乙型病毒性肝炎的实验室检查,报告人：付红伟 天津医大总医院 检验中心 2011.1.21,我国HBV感染概况,一般人群HBsAg携带率高达7.18%；现有慢性HBV感染者约9 300万人，占全世界的1/4； 其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过 2 000万例，占全世界慢性乙肝患者的1/3； 15岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，1-4岁组仅为0.96%；1 4岁组HBsAb阳性率由1992年15.75%升至72.25%; 抗HBcAb阳性率由1992年30.08%降至3.76%；,2,HBV基因组,HBV DNA是由长链L (负链) 和短链S (正链) 组成的不完全双链环状DNA，短链的长度相当于长链的50%85%。 HBV DNA长链载有病毒蛋白质的全部密码，有4个开放读码框架(ORF)，分别称为S、C、P和X区 。编码7个蛋白质。 HBV DNA易发生变异，特别是前S或S区基因较易突变。,嗜肝DNA病毒的共同特点： 内含33.3kb松散环状、部分双链DNA基因组 及DNA聚合酶；病毒的复制需逆转录过程。,3,HBV抗原和抗体系统,表面抗原(HBsAg)： HBV外膜糖蛋白=S+L+M蛋白 S蛋白：狭义的HBsAg指S蛋白。 HBsAg阳性说明机体有HBV感染。 中分子蛋白：preS2+S 大分子蛋白：preS1+preS2+S,S蛋白,中分子蛋白,大分子蛋白,1.HBsAg和抗-HBs,e抗原(HBeAg)： 是可溶性蛋白质 只存在于血液中 是病毒复制和传染性的标志 e抗体(抗-HBe)： 对HBV感染有一定的保护作用 其出现标志着病毒复制减少、传染性降低,前C区,C区,前C / C 蛋白,HBeAg,HBcAg,表达,切割、加工,HBeAg只存在于血清中,HBV C基因,分泌到细胞外,2. HBeAg 和抗-HBe,5,HBV 的三种形态,1,Hepatitis B virion(Dane particle) 2,secreted filament 3,secreted sphere,6,7,HBV 自然复制周期,8,HBV感染的实验室检查,1.乙型肝炎的生物化学检测,主要指标： ALT, AST, ASTm， 血清白蛋白， 血清胆红素， 胆碱酯酶, 甲胎蛋白, 凝血酶原时间(PT)及部分凝血因子；,9,方法学的发展 ELISA：灵敏性高，成本低，适用于普通病人筛查； 胶体金免疫层析法(金标法)：简便易行，可用于急诊病人快速检测； 化学发光法定量检测：价格昂贵，可用于HBVMs为临界值的病人的确证；可间接反映宿主HBV的复制水平，在评价抗病毒治疗的病毒学应答、疗效和判断预后方面有重要意义。 新增检测指标 PreS1、PreS2及其相应抗体 对乙肝两对半的新认识,10,2. HBV 血清标志物检测,11,HBV血清标志物检测方法的成本效果分析(1),12,HBV血清标志物检测方法的成本效果分析(2),Back,13,Terminal protein,Spacer,Reverse Transcriptase (RT),RNaseH,rt1,rt344,preS1,preS2,S,s1,s266,HBsAg,X,Mutation of S & Pre-S,S基因“a”决定簇 G 145 R 变异，与抗-HBs 的亲和力降低,S 基因变异可导致隐匿性HBV 感染(occult HBV infection) ，表现为血清HBsAg 阴性，但仍可有HBV 低水平复制 (血清HBV DNA 常 104 拷贝/ml),献血员人群，隐匿性HBV感染的检出率可达0.19%,14,15,16,PreS1检测的临床价值,前S1蛋白主要存在于Dane颗粒和管型颗粒上，在HBV感染宿主细胞 过程及在病毒复制和刺激机体产生免疫反应中起重要作用; 前S1抗原与HBeAg之间有高度相关性，并可区别因变异种及其他原因造成的乙肝病毒e抗原(HBeAg)假阴性，可作为HBeAg假阴性补充，从而准确反映患者体内病毒复制情况； 可作为HBV感染及复制的标注，与其它血清标志物联合检测，相互补充。,Back,17,大三阳,小三阳,vs,HBV血清学标志检测结果分析,16,19,1916例HBV血清标志物阳性类型分布模式,20,21,22,HBV DNA 定量检测 病毒复制水平最可靠，最直接的证据，与传染性和疾病进展密切相关； 主要用于HBV感染的判断，治疗适应症的选择及抗病毒疗效的判断。 HBV基因分型 基因分型的必要性； 基因分型的主要方法； HBV耐药突变的检测,3.HBV 分子生物学诊断,慢性HBV感染治疗适应症的选择,HBeAg 阳性，HBV DNA 载量 105 copies/ml, ALT 2 ULN; HBeAg 阴性，HBV DNA 载量 104 copies/ml, ALT 2 ULN; HBV DNA持续阳性，年龄40岁，ALT大于正常上限，也可给予抗病毒治疗； HBV DNA持续阳性，年龄40岁，ALT持续正常，应密切随访，动态观察疾病进展，必要时行肝组织检测，有病变证据时，可以给予抗病毒治疗；,23,HBV 感染抗病毒治疗的疗效评估,治疗终点：HBV DNA 明显下降或低于检测下限，并伴有ALT正常； HBV DNA 水平治疗开始后3个月内持续下降1 log以上才说明治疗有效； 每日0.5mg恩替卡韦治疗1年时, HBeAg 阳性和阴性慢性乙型肝炎患者HBV DNA 检测不到率分别为67% 和90%, 恩替卡韦的HBeAg转换率为21% , 与其他口服抗病毒药相似。 并不以HBeAg转阴或HBsAg转阴为治疗终点或目标。,24,HBV DNA 定量检测试剂盒的性能对比,25,26,同时可以实现对HCV,HIV-1,衣原体，及淋病的一体化检测,Back,病毒基因突变,疾病进展,临床表现,对干扰素应答,耐药变异,生化学改善,HBeAg血清学转换,HBV DNA清除,急性乙型肝炎,慢性乙型肝炎,肝硬化 (LC),肝细胞癌 (HCC),27,HBV基因型/基因亚型,常用HBV基因分型方法比较,28,B型特异性“引物对”的特异度分析,B型特异性引物HB（正义链）：5-ACC GTG AAC GCC CAC MGG AA-3,29,Back,4.HBV 临床药物治疗监测,乙肝病毒的耐药性检测，是精准治疗乙肝的关键！ 目前由于治疗不够规范，造成我国目前超过95%的乙肝患者发生耐药、病毒变异、病毒耐药，变异检测势在必行！ 拉米夫定是第一个被批准治疗慢性乙型肝炎的口服抗病毒药, 已在全世界广泛应用。但其耐药发生率高, 治疗1年时耐药发生率为23%, 2年为46% , 3年为55% , 4和5年分别为65%和71% 。,30,耐药-核苷(酸)类似物 (NA) 治疗失败最重要原因,31,拉米夫定LMV,阿德福韦酯ADV,替比夫定LdT,恩替卡韦ETV,HBV,替诺福韦TDV,NAs：,抑制病毒复制,长期使用,耐药变异,临床耐药,表型耐药,基因耐药,耐药 研究,32,33,34,Polymerase,Terminal protein,Spacer,Reverse Transcriptase (RT),RNaseH,rt1,rt344,逆转录酶 (RT) 区某些位点变异与耐药相关,preS1,preS2,HBsAg,s1,s266,可同时分析：耐药变异，HBsAg变异，基因型，血清型,全长RT区分析技术路线,HBV DNA 提取,snPCR扩增RT区,PCR 产物直接测序,生物信息学分析与数据信息挖掘,血清与资料收集,可同时分析：耐