专题五DNA的粗提取与鉴定.ppt

5.1 DNA的粗提取与鉴定,1.通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质。 2.理解DNA粗提取与鉴定的原理。,课题目标(B),1.提取DNA的方法： （1）DNA的溶解性： 【思考1】DNA在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点？对此有什么应用？ 【思考2】利用什么原理可以来将DNA与蛋白质进一步分离开？,一、基础知识,DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反,DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质 则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。,（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性： 蛋白酶能水解 ，但对 没有影响； 大多数蛋白质不能忍受 的高温，而DNA在 以上才会变性。 能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。 （3）DNA的鉴定： 如何鉴定DNA？,沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图,在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度比较大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。,（一）实验材料的选取,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,（三）除去滤液中的杂质(纯化),（四） DNA的析出与鉴定,二、实验设计,（一）实验材料的选取,从下列材料中选取23种,原则：,鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌,凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,思考：(1)教材中选取鸡血作为实验材料，有什么优点？ (2）获取的鸡血可以直接使用吗？,一真核生物，DNA都在染色体上二是因为鸡血细胞核大，DNA含量丰富，材料易得；三不要去除细胞壁，,不可以， 方法：0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液100 mL，置于500 mL烧杯中，+新鲜的鸡血（约180 mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免血液凝结。,1.必修一学习的质壁分离，你还记得方法和原理吗? 2.鸡血细胞溶液：,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒沿同一个方向搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。过滤后收集滤液。,方法：一般510 mL的鸡血细胞液加入20 mL蒸馏水搅拌5 min。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。,思考：（1）可以用滤纸吗？ （2）此步骤获得滤液的成分有哪些？DNA在哪里。,不可以，孔径太小。需要用到纱布，除去一些颗粒较大的杂质，获得含有DNA的滤液。,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。 DNA在滤液里。,想一想：洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,洗涤剂离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNA释放 食 盐NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中,（3）对于动物细胞我们可以利用细胞的渗透压来破碎细胞，但是很多情况下，人们不得不面对植物材料，那么我们是不是还可以通过加入一定量的蒸馏水来涨破细胞呢？,通过研磨来破碎植物细胞的细胞壁。在研磨的过程中，一般还会加入洗涤剂和食盐。,经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的DNA释放。若研磨不充分，会使提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,1. DNA的溶解性,2. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,（三）除去滤液中的杂质,（1）溶解细胞核内的DNA 在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中。 方法：在溶液中加入两倍体积的浓度为2 mol/L的NaCl溶 液，搅拌1 min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。 （2） DNA的析出 加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。 方法：实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.10.2 mol/L。加水过程一般分三次进行，当总加水量为300 mL左右时，DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。 用34层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。如果采用离心法，效果更好。用4 000 r/min转速的离心机，离心15 min，除去上清液(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含有DNA。此时注意观察DNA黏稠物的颜色。,（3）将DNA黏稠物再溶解，,继续用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3 min，使DNA充分溶解，以免损失。用34层纱布进行过滤（或离心），滤去杂质，收集含有DNA的滤液。,思考：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质?,用高浓度的盐溶液溶解DNA，去除在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去在盐溶液中的杂质。因此通过反复的溶解与析出DNA，就能去除与DNA溶解度不同的杂质。,2mol/L,过滤取纱布上的滤物,纱布过滤,再次溶解DNA,2mol/LNaCl溶液,思考：方案二与方案三的原理有什么不同？,方案二利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离,（四） DNA的析出与鉴定,向滤液中贴壁缓慢加入50mL预冷的体积份数为95%乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现DNA丝状物。,1、DNA的初步纯化,思考：为什么加入预冷的酒精？,预冷的乙醇溶液具有以下优点。 1.抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解 2.降低分子运动，易于形成沉淀析出 3.低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂,2. DNA的鉴定：,二苯胺法,在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺变蓝。,溶解：在物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5mL，放入丝状物，用玻璃棒搅拌，使之溶解。 显色：加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 设置对照组：在5mL体积的2mol/L的NaCl溶液中加入4mL的二苯胺试剂，置于沸水中加热5min。,加冷酒精使DNA析出（纯化）,冷酒精,DNA的鉴定,方法步骤,加入物质,目的,1,.,制备鸡血细胞液,柠檬酸钠溶液,2,.,提取鸡血细胞细胞核物质,20 m1,蒸馏水,3,.,溶解细胞核内的,DNA,2 mo1,L,的,NaCl,溶液,40,mL,4,.,析出含,DNA,的黏稠物,蒸馏水,9,.,DNA,的鉴定,B,:,(1),向试管中加入,2mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2)4 m,L,二苯胺试剂,加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固,加速血细胞破裂,溶解DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大限度地释出,使含DNA的黏稠物被留在纱布上,使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含DNA的滤液中的杂质,提取DNA, A出现蓝色 B无变化,真题练习,（2012.18）下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是 A洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度 B将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝 C常温下菜花匀浆中有些酶类会影响DNA的提取 D用玻棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少,（2011.19）在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，相关叙述正确的是 A用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物 B调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质 C将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色 D用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,三、课题成果评价,（一）是否提取出了DNA,（二）用不同的实验材料和方法,（2010.32）(7分)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下： 材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份每份l0 g。剪碎后分成两组，一组置于20、另一组置于一20条件下保存24 h。 DNA粗提取： 第一步：将上述材料分别放人研钵中，各加入l5 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤取滤液备用。 第二步：先向6只小烧杯中分别注人10mL滤液，再加人20 mL体积分数为95的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。,第三步：取6支试管，分别加入等量的2molL NaCl溶液溶解上述絮状物。 DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂。混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅,结果如下表。 分析上述实验过程，回答下列问题： (1)该探究性实验课题名称是 。 (2)第二