T细胞检测技术.ppt

T细胞检测技术,机体接受外来抗原及自身抗原刺激后，通过细胞免疫和体液免疫及相关系统协同作用，对抗原产生应答。,T 细胞应答： T细胞增殖 分泌细胞因子 细胞毒效应 表达特定表面标志,淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,一、淋巴细胞增殖实验,1、原理,（1）形态学检测,2、检测方法,方法学评价,优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。 缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。,（2）3H-TdR掺入法（MTT法）,PHA 淋巴细胞（54h） 3HTdR掺入 （MTT被还原） 收集细胞，检测射线（490nm吸光度）,优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。,原理： CFSE等染料可连结到细胞内蛋白的氨基酸群（PKH26能插入脂膜），并随细胞分裂而分配到子代细胞中，每分裂一次，荧光强度减少一倍。 方法学评价 优点：操作简单；重复性强；安全； 缺点：CFSE可能干扰细胞增殖,（3）CFSE（PKH26等）染色法,二、T细胞分泌功能的检测,T细胞经各种丝裂原或特异性抗原刺激后,分泌的各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，从而间接反映T细胞功能。,1、生物活性检测,对于依赖于该细胞因子而增殖的细胞，细胞增殖程度与细胞因子含量呈正相关。 方法学评价 优点：敏感（pg）；显示细胞因子的活性； 缺点：影响因素多（同一细胞分泌多种细胞因子，多种细胞因子呈现相同功能，细胞因子及其相应受体同时分泌）；,2、免疫学检测,（1）ELISA: 操作简单，非特异性影响大； （2）ELISPOT: 高度的敏感性，可重复性强，抗原特异性精确； （3）ICS：可同时检测产生细胞因子的细胞表型；需要样本量大于ELISPOT，破膜后的细胞不能做进一步功能检测；,优点：简单，适用性广，应用特异的单克隆抗体，可检测单一细胞因子的含量； 缺点：无法反应细胞因子的生物活性；不同单克隆抗体检测的结果不同；敏感性稍差（100pg）,方法学评价,（1）Realtime-PCR （2）分子杂交,2、分子生物学检测,三、T细胞介导的细胞毒实验,特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别靶细胞表面特异性抗原，通过Fas途径及颗粒酶途径，介导靶细胞溶解。,1、51Cr释放实验,铬酸钠（Na251CrO4）中的六价铬能被活细胞摄取，并在细胞溶解后以三价铬的形式被释放。 方法学评价 优点：灵敏、特异，是CTL活性测定的经典方法； 缺点：操作繁琐；放射性；靶细胞51Cr自发释放；,2、IC Assay（In vivo cytotoxicity Assay）,表达特定抗原的肿瘤细胞系经CFSE标记后，皮下注射入小鼠，被小鼠体内抗原特异性CTL作用24小时后，取出肿瘤细胞，检测其CFSE含量。 方法学评价 优点：反应体内杀伤效果； 缺点：影响因素多；,四、T细胞表面标志的检测,特异性T淋巴细胞活化需要第一信号和第二信号。因此检测CTL表面特异性受体或相关的表面标志可以反映CTL的活化状态。,1、Tetramer技术,模拟T细胞活化的第一信号，构建荧光标记的MHC-肽复合物，被特异性T细胞识别。通过检测标记的荧光，反应活化的特异性T细胞。 方法学评价 优点：简便，快速，敏感 缺点：成本高，受HLA型别的限制,2、表面标志CD107a/b的检测,CD107a/b表达于T细胞内的质膜上，随着脱颗粒作用，一过性表达于细胞表面