生化分离工程实验.ppt

生化分离工程实验,指导老师：何 进 教 授 电子邮箱： 联系电话助教学生： 赵有文 刘 舒 胡轶敏 危雅乐 ,菌株的优化培养,总DNA或RNA的抽提,PCR或RT-PCR扩增目的基因,乙醇沉淀回收线性化片断,大肠杆菌表达载体pET-28,酶连产物转化E.coli DH5,挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证),检索感兴趣的基因（hfq/fabz）,直接优化并合成,连T载测序,结晶,结构解析,本次试验内容,本次试验的主要内容,His-Tag系统,pMAL系统,无细胞体系,目的基因的背景资料,Hfq,fabZ,Hfq是一个高度保守的RNA结合蛋白，最初被发现是作为大肠杆菌RNA噬菌体Q复制所必需的管家因子。现在则被认为是细菌基因转录后调控的关键因子，广泛参与细菌多种生命活动的调控。,大肠杆菌fabZ基因编码3-羟基脂酰ACP脱水酶，是大肠杆菌中的必须基因，该基因的突变会导致细菌细胞的死亡。,生化分离工程实验（星期五）,一，接种 按1%的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的LB培养基中 ,做好标记（写清组号，菌株信息、抗性），统一放于第八组台面。,生化分离工程实验（星期五）,将超净台内PA瓶中剩余的菌液用枪吸取200 l于1.5 ml离心管中，10000 rpm/min离心1 min，弃上清，加入200 l的无菌水洗涤菌体上残留的培养基 10000 rpm/min离心1 min，弃上清，然后重悬于40 l灭过菌的去离子水中，100 煮15 min， 10000 rpm/min离心1 min，取上清9.2 l作为菌落PCR的模板。,二，菌液PCR （验证目的基因已转入宿主菌中）,PCR体系,H2O 9.2 l 10 X PCR buffer 2.5 l dNTP 2 .0 l 上游引物 0.5 l 下游引物 0.5 l Taq酶 0.3 l 模板 10 l 总体积 25 l,PCR程序,95 5 min 95 35 s 56 40 s 72 60 s 72 10 min 25 10 min,Cycle 30,注：用质粒做阳性对照，水做阴性对照，不用重复，PCR管上做好标记！,The pMAL-c2 series of vectors have an exact deletion of the malE signal sequence, resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein. The pMAL-p2 series of vectors contain the normal malE signal sequence, which directs the fusion protein through the cytoplasmic membrane, and the fusion proteins can be exported to the periplasm,三，诱导,注：在加入IPTG之前，摇匀菌液并各取1 ml于1.5 ml的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导前”，放于第八组桌面的离心管板中，于20 保存。,四，配试剂,依据每组发的纸条进行,生化分离工程实验（星期五）,将加入诱导剂后的菌液再放入37 200 rpm/min的摇床中诱导培养4-5小时后收集菌体。,注：在离心沉淀之前摇匀菌液取1 ml于1.5 ml的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导后” 放在第八组的离心管板上。 离心时用天平严格配平，沉淀重悬后做好标记放于第八组桌面上！,六，收菌,组氨酸和Ni-NTA,亲和作用原理,6His/Ni-NTA亲和纯化步骤,系统原理示意图,pMAL,Ni柱的清洗与保存,用水洗3次（去掉保存的20%乙醇）,充电（装满NiSO4，温和摇动后自然沉降）,洗涤（3次水洗，去掉游离的Ni),平衡（2次的binding buffer洗）,HisTag 蛋白质的纯化步骤,上样（每次15ml，样品要与柱子充分结合）,加washing buffer（用100%TCA检测不出沉淀为止）,加 Elution buffer （一般收集8ml）,重复第48步,第 1步：2倍体积 6 M 盐酸胍，0.2 M醋酸 第 2步：2倍体积水 第 3步：1倍体积 2% SDS（注意低温容易析出） 第 4步：1倍体积 25%乙醇 第 5步：1 倍体积 50%乙醇 第 6步：1 倍体积 75%乙醇 第 7步：5 倍体积 100%乙醇 第 8步：1倍体积 75%乙醇 第 9步：1倍体积 50%乙醇 第 10步：1倍体积 25%乙醇 第 11步：1倍体积水 第 12步：5倍体积 100 mM EDTA，pH8.0 第 13步：3倍体积水,由于 EDTA处理后仍可有少量蛋白未能完全释放，建议在纯化不同蛋白时应另换 HisBind 树脂。,树脂的再生,当柱流速明显下降，或树脂在使用离子化缓冲液处理之后没能显示深蓝绿色，则树脂需要更彻底的清洗处理。,直链淀粉柱的再生,生化分离工程实验（星期六）,一、裂解细胞,将冷冻保存的细胞团在室温下解冻，冰上破碎至菌液成澄清（ 200-300w超声610s-10s，约20 min）,天平严格配平后10000*g， 4，离心20 min。上清取1 ml于1.5 ml离心管中，作标记为“上清”，沉淀用1 ml对应的buffer（his-tag为binding buffer，pMAL为column buffer）重悬后，保存在1.5 ml的离心管中，标记为“沉淀”，做好组号和菌株标记后，放于第八组台面。,二，蛋白纯化,注：收集到的蛋白做好标记后须在冰上保存，避免其失活,pMAL系统MBP标签的切除 从A595最大的几管(一般是第一、二管)取100 l用于蛋白酶FactorXa的酶解，在100 l洗脱液中取15 ul保存在pcr管中，作为酶切对照，剩下的加入2 ul的FactorXa后置于摇床上震荡反应，室温下反应18 h，分别于第1h、3 h、6 h、17 h取样15 l。,三，SDSPAGE样品的制备,将收集到的14管目的蛋白和之前保存的 “上清”“沉淀”“穿透”（共6管）蛋白各取出20 ul于对应的已经标记的1.5 ml离心管中，加入20 ul SDS-PAGE loading buffer ，将先前保存的“诱导前”“诱导后”（共4管）于10000rpm/min离心1min，弃上清，沉淀用15ul对应的buffer重悬，再加入15ul SDS-PAGE loading buffer，沸水浴15 min后，放于第八组台面。,无细胞体系,生化分离工程实验（星期六）,四，Bradford protein assay,1、标准曲线的制作,（1）标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成1.0mg/ml的标准蛋白质溶液。,（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250溶于50 ml 95%的乙醇后，再加入120 ml 85%的磷酸，用蒸馏水稀释至1 L。,每加完一管立即在漩涡振荡器上混合，25 min后以1号为对照调零测A595以标准蛋白质量（ug）为横坐标，用吸光度A595为纵坐标作标曲,注;震荡过程中不要太剧烈，以免产生较多气泡而无法消除,五，未知蛋白浓度的测定,将保存的纯化的蛋白各取50 ul，加50 ul蒸馏水后再加入5 ml考马斯亮蓝G-250染液试剂，漩涡震荡后静止25 min，以0.1 ml水加 5.0 ml的G-250试剂调零，测其在595nm处的吸光度。,生化分离工程实验（星期六）,六， 配制SDS-PAGE,每组配两块，均采用15孔梳子,注：在配胶前注意梳子厚度（1.0mm和1.5mm）与胶板厚度的一致性,生化分离工程实验（星期天）,跑SDS-PAGE 点样：所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴5分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20 ul。(记录点样顺序) 点样完毕后即可开始电泳，先以80伏电压跑15-20分钟，蛋白质通过积层胶后，更换到120伏，待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色3小时左右。 染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，最后一次可以过夜脱色。,SDS-PAGE的原理,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (Acr) 和交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE),阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠SDS,打断蛋白质的氢键和疏水键，包裹蛋白,根据蛋白所带电荷差异和分子大小不同来分离,掩盖电荷差异和形状区别，而只与分子量有关,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳,引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N、N四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化A