环境重金属高灵敏荧光分析方法研究论文

桂林理工大学 硕士学位论文 环境重金属高灵敏荧光分析方法研究 姓名：汪菊玲 申请学位级别：硕士 专业：分析化学 指导教师：侯明 20090401 桂林理工大学硕士学位论文 中文摘要 许多重金属属于人体必需的微量元素，一旦缺少某种或某几种，就会使人体健康受 到威胁。但无论必需元素还是有毒元素，人体对它的耐受都有一个阈值，超过这个阈值 后便对健康造成危害。因此，测定环境中的重金属显得尤为重要。本文以环境中的重金 属高灵敏度荧光分析方法研究为主要内容，所做的工作如下： 1 ) 研究了在盐酸介质中，C T M A B 与1 3 的离子缔合物的共振散射光谱。实验发现， 在V ( V ) ) 存在条件下，I - C T M A B 溶液的共振光散射强度会大大增加。根据散射光强度 与溶液中钒浓度在一定范围内成正比的关系，提出了共振光散射法测定痕量钒的新方法， 其线性范围为2 6 0n g m l 一，检出限为O 6 6n g m l 。用拟定的方法测定环境水样，回收 率在9 8 7 10 2 。4 ，结果令人满意。 2 ) 在p H = 5 0 溶液中，在十二烷基硫酸钠( S L S ) 作用下，吖啶橙与曙红Y 能发生 有效的能量转移，使曙红Y 荧光增强，N i ( I I ) 的加入使曙红Y 在5 4 1n l i l 处发生荧光 猝灭，其荧光猝灭程度与镍的含量成线性，由此建立了能量转移荧光测定痕量镍的新方 法。实验表明，镍的含量在O 0 0 1 0 1g g m L 。1 范围内与荧光猝灭强度A F 符合比尔定律， 检出限为O 5 3n g m L “ 1 ，对l 嵋N i 2 + 进行1 1 次测定，其相对标准偏差为2 4 。用本 法测定植物样中镍含量，相对误差小于3 ，结果满足痕量分析要求。 3 ) 室温下以六偏磷酸钠为稳定剂，在水相中合成了C d S 量子点通过分析配比、p H 值、稳定剂、温度等因素，获得了强荧光C d S 量子点的制备条件。在最佳条件下制备的 硫化镉( C d S ) 纳米晶结构良好、粒度均匀、荧光激发专一，最大激发波长在3 7 0n I n ，其 发射荧光的波长位于5 2 4n m ，发射强度大，并利用粒度分析、U V i s 、荧光光谱等表征 手段对所制得样品的结构和形貌进行分析。 4 ) 常温下在水溶液中制备了六偏磷酸钠稳定的C d S 纳米粒子，以合成的纳米粒子 为荧光探针，建立了荧光猝灭定量检测P b ( I I ) 和C o ( I I ) 离子的新方法。研究了C d S 纳米 粒子与P b ( I I ) 和C o ( I I ) 荧光反应的最佳条件，在最佳实验条件下，其P b ( I I ) 质量浓度在 0 0 4 O 9 6I t g m L 。1 范围内与，呈良好的线性关系，方法的检出限为0 0 2 77g g m L 一。 C o ( I I ) 质量浓度在O 0 1 O 3 0g g m L o 范围内与，呈良好的线性关系，方法的检出限为 0 0 0 38 3I - t g m L 。方法经济、简单、快速、灵敏度高、检出限比较低、检测范围较宽。 关键词：共振散射；钒( V ) ；吖啶橙：曙红Y ；能量转移；荧光猝灭； 镍；硫化镉： 铅；钻 桂林理工大学硕士学位论文 A b s t r a c t s M a n yh e a v ym e t a l sa r ee s s e n t i a lt r a c ee l e m e n t st oh u m a n ，O N C et h el a c ko fo n e o rs e v e r a l ， i tw o u l db eat h r e a tt oh u m a nh e a l t h T h eh u m a nb o d yh a sat h r e s h o l do ft h et o l e r a n c et ot h e h e a v ym e t a l s W h e nb e y o n dt h et h r e s h o l d ，i tw o u n dm a k eh a r mt oh e a l t h ，S Od e t e r m i n a t i n gt h e h e a v ym e t a l si nt h ee n v i r o n m e n ti se s p e c i a l l yi m p o r t a n t I nt h i sp a p e r ，h i g hs e n s i t i v i t y f l u o r e s c e n c ea n a l y s i sm e t h o d su s e df o rd e t e r m i n gh e a v ym e t a l si nt h ee n v i r o n m e n tw e r e i n v e s t i g a t e d T h ew o r kd o n ea sf o l l o w s 1 ) T h es p e c t r u mo fV ( V ) 一K I C T M A Bi o na s s o c i a t i o nc o m p l e xh a st h er e s o n a n c ei n h y d r o c h l o r i d ea c i dm e d i u m I th a sb e e nf o u n dt h a tt h ei n t e n s i t yo fr e s o n a n c el i g t hs c a t t e r i n g - _ - _ - _ - _ 。I _ _ _ _ _ _ - - _ 。_ _ _ - _ _ I _ o f1 3 - - C T M A Bs o l u t i o nw a se n h a n c e ds i g n i f i c a n t l yi nt h ep r e s e n c eo fV ( V ) ，a n dt h e r ei sa l i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ei n t e n s i t yo fr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n ga n dt h ec o n c e n t r a t i o no f V ( V ) i nac e r t a i nr a n g e B a s e do nt h i s ，an e wm e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no ft r a c ev ( V ) w a se s t a b l i s h e da n dt h ec o r r e s p o n d i n gc o n c e n t r a t i o no fV ( V ) i nt h er a n g ef r o m2t o6 0 n g m L - 1u n d e rr o o mt e m p e r a t u r e D e t e c t i o nl i m i t ( 3 S ) o ft h em e t h o dw a sf o u n dt ob eO 6 6 n g m L - ! “ T h em e t h o dh a sb e e nu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fV ( V ) i ne n v i r o m e n t a lw a t e r s a m p l ew i t hs a t i s f a c t i o n 2 ) A n e n e r g yt r a n s f e rf l u o r e s c e n c et e c h n i q u ef o ra c r i d i n eo r a n g e ( A O ) a n dE o s i n Y ( E Y ) i ss t u d i e d ，a n do p t i m u mc o n d i t i o n so fe n e r g yt r a n s f e rs y s t e mi sa l s oe x p e r i m e n t e d I ti s f o u n dt h a t i nt h ea q u e o u sm e d i u ma tp H = 5 0a n di nt h ep r e s e n c eo fs o d i u md o d e c y ls u l f a t e ( S L S ) ，e n e r g yt r a n s f e r sf r o mA Ot o E Yw h i c hm a k e st h ef l u o r e s c e n c eo fE o s i nY e n h a n c e m e n t ，t h en i c k e l ( I I ) e n a b l e st h es y s t e mf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ga t5 4 1n m ，An e w m e t h o db ye n e r g yt r a n s f e rf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gf o rd e t e r m i n a t i o no ft r a c en i c k e lw i t h N i ( I I ) - A O E Yi se s t a b l i s h e d T h ed e t e r m i n a t i o nr a n g eo f n i c k e li s0 0 0 1t oO 1 嵋m L ，w i t h d e t e c t i o nl i m i to f0 5 3 n g m L 一T h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ti sR = 0 9 9 91 ，a n dr e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o ni s2 4 T h ei n f l u e n c eo ff o r e i g ni o n so nt h ed e t e r m i n a t i o no fO 1p g m L 一N i ( I I ) w a se x a m i n e d ，w i t har e l a t e de r r o ro f5 T h em e t h o dh a sb e e na p p l i e dt od e t e r m i n a t i o no f t r a c en i c k e li nb i o l o g i c a ls a m p l e sw i t ht h er e l a t i v ee r r o rl e s st h a n3 ，r e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n5 8 ，w h i c hm e e tt h er e q u i r e m e n t so f t r a c ea n a l y s i s 3 ) As o d i u mh e x a m e t a p h o s p h a t e - s t a b i l i z e ds u s p e n s i o no fC d Sq u a n t u md o t s ( Q D s ) w a s p r e p a r e da tr o o mt e m p e r a t u r e i na q u e o u ss o l u t i o n E f f e c t so ft h er a t i oo ft h er e a c t a n t s c o n c e n t r a t i o n ，p H ，s t a b i l i z e ra n dt e m p e r a t u r ew e r ei n v e s t i g a t e do nt h ep h o t o l u m i n e s c e n c e t h u s - p r e p a r e dC d SQ d s O nt h e b e s tc o n d i t i o n ，t h ep r e p a r a t i o no fh i g h - q u a l i t yC d S s e m i c o n d u c t o rn a n o c r y s t a l l i t e so fw u r t z i t es t r u c t u r ei Sd e s c r i b e d C r y s t a l l i t e sw i t hc o n s i s t e n t I I 桂林理工大学硕士学位论文 c r y s t a ls t r u c t u r ea n dah i g hd e g r e eo fm o n o d i s p e r s i t yw e r es y n t h e s i z e d H i 曲s a m p l eq u a l i t y r e s u l t ss h o w e di n s h a r pf l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o n a t3 7 0n mi nw a v e l e n g t ha n ds t r o n g p h o t o l u m i n e s c e n c ee m i s s i o na t5 2 4mi n w a v e l e n g t h T h ec r y s t a l l i t es t r u c t u r ew a s c h a r a c t e r i z e db yac o m b i n a t i o n o f p a r t i c l es i z ea n a l y s i s ，U V V i sa n dF Ls p e c t r as p e c t r u m 4 ) As o d i u mh e x a m e t ap h o s p h a t e s t a b i l i z e ds u s p e n s i o no fC d Sq u a n t u md o t s ( Q D s ) w a s p r e p a r e da tr o o mt e m p e r a t u r ei na q u e o u ss o l u t i o n An e wa p p r o a c hw a sp r o p o s e df o rt h e s e n s i t i v ed e t e r m i n a t i o no fl e a di o na n dc o b a l ti o nw i t hn a n o p a r t i c l e sa st h ef l u o r e s c e n c ep r o b e T h eo p e r a t i n gc o n d i t i o n ss u c ha st h ec o n c e n t r a t i o no fC d Sn a n o p a r t i c l e s ，t h ep Ho ft h e m e d i u ma n dt h er e a c t i o nt i m ea n dt e m p e r a t u r ew e r eo p t i m i z e d W i t hm a x i m u me x c i t a t i o n w a v e l e n g t ha n de m i s s i o nw a v e l e n g t h ，t h el i n e a rr a n g ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fP b 2 + w a sO 0 4 t o0 9 6l a g m L “ 1w i t had e t e c t i o nl i m i to f0 0 2 77l a g m L “ 1 a n dt h el i n e a r r a n g ef o rt h e d e t e r m i n a t i o no fC 0 2 + w a s0 01t oO 3 0l a g m L 1 w i t had e t e c t i o nl i m i to f0 0 0 38 3l a g m L I t w a sp r o v e dt ob eam e t h o dw i t hl o w c o s t ，s i m p l e ，r a p i d ，s e n s i t i v e ，l o wd e t e c t i o nl i m i t K e ww o r d s ：R e s o n a n c es c a t t e r i n g ；V a n a d i u m ( V ) ；a c r i d i n e o r a n g e ；e o s i nY ；e n e r g y t r a n s f e r ；f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ；n i c k e l ；c a d m i u ms u l f i d e ；l e a d ；c o b a l t I I I 研究生学位论文独创性声明和版权使用授权书 独创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。对论文的完成提供过帮助的有关人员已在论文中作了明确的说明并表 示谓十意。 学位论文作者( 签字) ：垒鱼硷 签字日期：脚：i ：! 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解( 学校) 有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的印刷本和电子版本，允许论文被查阅和借 阅。本人授权( 学校) 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国 科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过 网络向社会公众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：江萄诠 签字日期：) 肋7 年 月1 日 翩擗绣以 签字日期：夕尸年多月乡日 桂林理工大学硕士学位论文 1 1 重金属测定方法研究进展 第一章绪论弟一早三百了匕 1 1 1 重金属的基本概念及测定意义 重金属指原子密度大于5g e m 3 的金属元素，大约有4 5 种，如C u 、P b 、Z n 、C d 、 M n 、F e 、C o 、N i 、V 、N b 、T a 、T i 、H g 、W 、M o 、A u 、A g 等【I 】o 尽管M n 、C u 、Z n 、 C o 、N i 等重金属是生命活动所需要的微量元素，但是大部分重金属如P b 、C d 、H g 等 并非生命活动所必须，而且所有重金属超过一定浓度都对人体有毒。 随着城市的扩大和大规模工业的发展，大气、土壤、水环境中均存在重金属污染， 重金属污染是危害最大的水污染问题之一。重金属通过矿山开采、金属冶炼、化工生产 废水、施用农药化肥和生活垃圾等人为污染源，以及地质侵蚀、风化等天然源形式进入 水体，加之重金属具有毒性大、在环境中不易被代谢、易被生物富集并有生物放大效应 等特点，不但污染水环境，也严重威胁人类和水生生物的生存，因此测定环境中的重金 属具有重要的意义。 1 1 2 钒的测定方法概述 钒是第五族( V B ) 元素，密度为5 9g e m 3 。钒是人体必需的微量元素之一，对人 体的健康具有重大的意义。钒的生物学及毒理学研究始于1 8 7 6 年，并在2 0 世纪的7 0 、 8 0 年代得到了迅速发展。研究发现，钒的化学性质是决定钒生物效应的基础。钒化合物 毒性及生命效应的大小除同钒的总量有关外，更重要的是受钒的化合特性及赋存形态的 影响。属钒的毒性很低，但其化合物对动植物体有中等毒性，且毒性随钒化合态升高而 增大，五价钒的毒性最大；V 0 2 + 为生物无效，而V O a - 却容易被吸收。可见，不同的化 学存在形式呈现出不同的生物效应。在环境体系中，钒可以以( 1 ) ( + 5 ) 的氧化态存在并 通常形成许多的聚合物。在组织外流体和细胞内，钒的主要形式分别为钒酸盐( v 0 3 一，V “ ) 和钒氧阳离子( V 0 2 + ，v 4 + ) ，钒酸盐进入细胞后，被谷胱甘肽( C l o H l 7 0 6 N 3 S ) 及其它物 质还原成钒氧阳离子，并同蛋白质、磷酸盐、柠檬酸、乳酸等配位体结合而稳定存在。 当元素钒在人体内的累积达一定浓度时，将对人体产生毒性作用。钒可刺激眼睛、鼻、 咽喉、呼吸道，导致咳嗽：与钙竞争使钙呈游离状态，易发生脱钙；钒也是一种能被全 身吸收的毒物，能影响胃肠、神经系统和心脏，中毒时肾、脾、肠道出现严重的血管痉 挛、胃肠蠕动亢进等症状，因此测定环境中的钒具有重要的意义。测定钒的方法很多， 有分光光度法、催化动力学法、原子吸收法、电化学法和质谱法等。 传统的分光光度法测定钒的方法欠缺在于显色剂灵敏度、选择性和准确度都不是很 理想。为此人们进行了大量的工作：一方面，通过萃取、浮选等分离手段提高方法的选 桂林理工大学硕士学位论文 择性；另一方面，研究合成新型灵敏度高、选择性好的显色剂用于光度分析或者通过双 显色剂协同显色，使方法的灵敏度得到了提高。另外，还有研究者通过V ( V ) 对某些 褪色反应具有明显的催化作用，建立了催化动力学分光光度法【2 弓J 。此类方法灵敏度高， 但反应条件不易准确控制，稳定性差，选择性也不是很理想。近年来，对钒的原子吸收 法也有报道。王继池【4 】报道了石墨炉原子吸收直接测定原油中痕量钒镍，试验结果表明， 本法操作较为简便，方法精密度较高，但需加基体改进剂消除背景干扰。此外，电化学 法测定钒的报道也不少。王术皓等人【5 】在硫酸介质中，以酒石酸为活化剂，痕量钒对澳 酸钾氧化乙基橙的反应具有极强的催化作用，研究了最佳反应条件，且发现在氨性缓冲 溶液中乙基橙及其氧化产物具有良好的极谱峰，以极谱法监测催化反应过程中乙基橙及 其氧化产物浓度的变化，建立了催化动力学极谱法测定痕量钒的新方法。毛勋等人【6 】研 究了钒一荧光镓( L M G ) 络合物在碳糊电极上的吸附伏安行为，发现其在+ O 8 1V ( v s S C E ) 的阳极二次导数峰电流与V ( V ) 的浓度在一定范围内呈线性关系检出限为1 0 1 0 田 m o l L ( S N = 3 ) 。该法用于煤飞灰，粉煤灰和水样中钒的测定，结果满意。但这类方法容 易引起汞污染，对操作人员的健康不利。等离子体质谱法( I C P M S ) 具有灵敏度高、 谱线简单的特点和快速测定同位素比值的能力，同时测定多种痕量元素不必分离富集。 张萌等人【7 】用I C P M S 准确测定螺旋藻、茶多酚等9 种人体必需微量元素的含量，但这 类方法的仪器昂贵、不易普及。 共振瑞利散射是指当瑞利散射位于或接近于分子吸收带时，电子吸收电磁波频率与 散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量，并产生再次散射，这种吸收再散射 过程称为共振瑞利散射或共振增强瑞利散射。P a s t e m e c k 等人【8 】于1 9 9 3 年首次使用荧光 分光光度计建立了共振光散射技术对卟啉类化合物在核酸上的聚集进行了研究并将其 用于生化分析的研究中，开创了该技术在分析化学中应用的先河。由于其灵敏度高且操 作简便、仪器简单，己广泛应用于生物大分子核酸【9 1 1 1 、蛋白质【1 2 14 1 、表面活性剂【1 5 】、 金属元素【1 每19 1 、非金属元素【2 0 1 、药物【2 1 1 等的检测，但未见共振光散射法测定痕量钒的研 究。 1 1 3 镍的测定方法概述 镍是第V I I I 族元素，密度为8 9g c m 3 。镍是生物与人体内不可缺少的微量元素， 分布在生物体内各种组织中，镍参与核酸和蛋白质的代谢、激素的调节过程，镍是许多 酶的辅助因子与激活剂且与细胞膜的功能有密切联系，镍在生物体内与铁、铜、锌等动 物必需的元素之问既有协同性又有拮抗性。生物缺镍会引起生长速度降低、死亡率提高、 总血清蛋白浓度和红血球数量的减少、总类脂量和胆固醇减少、骨组织强度降低和膝关 节肿大等症状，当镍摄入过量时，会发生中毒1 2 2 1 。由于镍在电镀工业中有广泛的应用， 通常会对工业区附近的土壤及地下水源造成污染，如果人吸入大量镍会损害肺，并会伤 2 桂林理工大学硕士学位论文 害心肌、肝和肾。另外，某些镍的化合物是致癌物质，因此镍的测定愈加受到重视。目 前，测定痕量镍的方法主要有分光光度法、原子光谱法、电化学法、质谱法等。 分光光度法是镍分析中应用最广的方法。丁二酮肟是特效的经典方法，M e h r o r a n g G h a e d i 2 3 】将表面活性剂十二烷基硫酸钠应用于测定体系中，使表观摩尔吸光系数提高到 6 8 6 1 0 4 ，同时提高了测定的选择性，不需分离可直接测定水样、巧克力和蔬菜中的微 量镍。L a w a l 2 4 1 等发现在苯甲醇中镍丁二酮肟体系生成黄色溶液，并能稳定一个月，在 3 6 5 和3 7 2n n l 处出现两个最大吸收，用于镍的测定，效果良好。此类体系的反应条件易 于控制，但灵敏度不是很高。近几年，原子光谱法在镍的测定分析中也有应用。E n s a f i ”j 将水样先通过装满以活性炭为担体的焦酚微型柱，N i ( I I ) 得到富集，然后酸洗脱，利用 火焰原子吸收光谱法( F A A S ) i 9 1 J J 定，在最佳检测条件下，最低检测限可达3n g m L ，回l 发 率可达9 8 6 - 9 9 8 。但其测定某元素需要该元素的光源，多元素同时测定尚有困难， 有相当一些元素的测定灵敏度还不能令人满意。陈乔华等人【2 6 】采用硝酸溶解样品，电感 耦合等离子发射光谱同时测定铝合金中的M n 、M g 、C r 、C u 、N i 、F e 、T i 、Z n 元素。 经实验，该方法简单、快速，结果准确、可靠。但其设备费用和操作费用较高，且对有 些元素优势并不明显。电化学方法也是测定镍的重要方法。S o u n d e r a j a n 2 7 】等利用微分 脉冲吸附溶出伏安法( D A P d S V ) 同时测定了高纯砷中的镍和钻，结果满意。邹洪【2 8 】等研 究了在N a 2 C 0 3 N a H C 0 3 ( p H 9 7 0 ) 亚硝基红盐和氯代十四烷基毗咤体系中，单扫描示 波极谱法同时测定钴与镍，应用于水样和生物样品中微量钴镍的测定，但方法用到汞电 极，对环境及人体健康都有危害。用质谱法和其他技术联用测定镍也有报道。索卫国等 人【2 9 J 采用H N 0 3 H 2 0 2 微波4 步消解电感耦合等离子体质谱法同时测定了醋酸纤维, 和T ”c 以- f h o ) 而松弛。F R E T 其实质是电子激发能在适当的 能量给体( D ) 和能量受体( A ) 对之间的传递，这种传递距离最大可达7 O 1 0 0n m ， 其直观的表现就是供体和受体之间达到合适的距离内( 1 l On m ) ，以供体的激发光激发， 供体产生的荧光强度比它单独存在时要低得多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随 它们的荧光寿命的相应缩短和拉长。并不是所有的荧光物质就一定可以构成荧光共振能 量转移对，一对合适的能量转移对的供体和受体之间必须满足一定的条件：( I ) 两利，荧 光物质的激发光谱要分的足够开；( 2 ) 两种物质的发射光谱要分的足够开：( 3 ) 其中供 体物质的发射光谱要与受体物质的激发光谱要有相当的重叠；( 4 ) 两种物质的偶极具有 一定的相对取向；( 5 ) 两种物质的分子相对距离在1 1 0n l n 内。如果当能量给体分子( D ) 和能量受体分子( A ) 相隔的距离大于D A 的碰撞直径时，只要D 与A 的基态和第一 激发态两者的振动能级能量差相当，或者说D 的发射光谱和与A 的吸收光谱能有效地 重叠，仍然可以发生从D 到A 的非辐射能量转移，又称长距离能量转移，这是一种偶 极一偶极耦合作用的共振能量转移过程。荧光物质分子之间的能量转移方式可以分为辐 6 桂林理工大学硕士学位论文 射转移与非辐射转移，荧光共振能量转移属于非辐射能量转移。故这种方式的能量转移 可以发生在两种不同的分子之间或同一分子的不同生色团之间。4 ) 催化荧光法，利用被 测物质或其他物质对某个荧光反应的催化作用，或被测物质及其他物质催化某个反应， 所得反应产物对荧光体具有增强抑制作用。从而间接地对该被测物质进行测量。 荧光光谱分析法在实际操作中受到多种因素的影响，掌握好这些因素，对完成分析 任务至关重要。首先要注意溶剂的影响，一是溶剂的选择要适宜，二是溶剂应达到足够 的纯度；其次要避免荧光污染；第三要注意表面吸附、氧化和光分解等干扰；第四要考 虑温度、溶液p H 值、溶液粘度的影响；第五要防止光散射与荧光猝灭( 荧光猝灭分析法 除外) 。在实际工作中，情况常常是很复杂的。对于不同样品来说，各种因素的影响程 度也不一样，采取合理措施排除影响，才能得到正确的测定结果。 1 2 2 荧光分析法的应用 1 2 2 1 在生化方面的应用 ( 1 ) 蛋白质分析 高峰等讨论了灿烂甲酚蓝( B C B ) 十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸钠体系随蛋白质 的加入其荧光强度的变化。对H A S 4 4 】的线性范围为0 0 0 38 9 7 8m g L 1 ，检出限为3 8 9 u g L 。陈鸿琪、夏闽【4 5 1 利用阳离子荧光染料吖啶红( A R ) 与十二烷基磺酸钠体系，可检 测的线性范围为0 4 8m g L 以的B S A ，检出限为0 0 6m g - L - 1 。沈含熙等改用吖啶橙( A O ) 一6 】 作荧光探针，发现当蛋白质加入到A O 的非荧光二聚体溶液中，体系的荧光明显增加， 测定H A S 和B S A ，检出限为0 0 8m g L 1 。刘保生等【47 1 研究了吖啶橙( A O ) 与罗丹明 6 G ( R 6 G ) 之间能量转移的最佳条件。在p H = 7 2 0 的T i r s H C l 缓冲溶液，十二烷基苯磺酸 钠介质中，A O R 6 G 能够发生有效能量转移，使R 6 G 荧光增强。蛋白质的加入使R 6 G 荧 光猝灭，以此建立了利用A O R 6 G 荧光共振能量转移间接测定蛋白质的新方法。牛血清 白蛋白、人血清白蛋白工作曲线线性范围分别为1 肌3 1 和1 0 3 0m g L ：检出限分别为 0 3 2 和0 3 3m g L ：平行6 次测定相对标准偏差为1 1 - - , 2 0 ；回收率为9 6 7 1 0 3 2 。覃文武【4 8 1 提出了一种荧光猝灭测定蛋白质的新方法。茜素与牛血清白蛋白反应导 致其荧光猝灭。茜素的最大激发波长和发射波长分别46 5 和5 2 0n n l 。在最佳实验条件 下，牛血清白蛋白在4 5 “ 1 0 0l a g m L 以范围内成直线关系。其检测限为4 5l a g mL ， 相对标准偏差分别为4 5 ( 3 0l a g m L 。1 牛血清白蛋白) 和2 6 ( 60l a g m L d 牛血清白蛋 白) W a n gLY 等【4 9 】发现蛋白质可使外表面修饰了一层巯基乙酸钠的功能性硫化锌纳米 粒子的荧光增强，对H A S 、B S A 和Y G 的线性范围分别为0 1 - - - 4 0 ，0 2 3 0 和0 1 4 5m g L I ，检出限分别为0 0 1 5 ，0 0 2 4 和0 0 1 7m g L - 1 。而在2 6 7n m 和p H5 1 2 条f - I 二 下，使用L 巯基丙氨酸包裹的硫化锌纳米粒子【5 0 】，对B S A 、H S A 、Y G 和卵自蛋白( O V A ) 的线性范围分别为O 0 3 - - - 8 0 ，O 0 1 6 0 ，O 0 5 8 0 和0 0 4 一 4 0m g L 。在2 7 4n m 和 7 桂林理工大学硕士学位论文 p H7 0 下改用硫化镉纳米粒子【5 l l 作为蛋白质荧光探针，对B S A 、H A S 和Y G 的线性范 围分别为0 1 3 0 ，O 1 4 4 和O 1 1 1 0m g - L 1 ，检出限分别为0 0 l ，O 0 2 1 和0 0 1 9 m g L 。采用硫化镉胶态纳米粒子，并在其外表面修饰一层巯基乙酸，可利用其外表面 的功能性基团对人血清白蛋白进行测定，对H A S 和Y G 的线性范围分别为O 2 “ 3 5 和 O 2 1 1 0m g L ，检出限分别为O 0 9 和0 1 8m g L I1 5 2 】。对B S A 的线性范围为0 1 3 2 m g L 1 ，检出限为0 0 8m g L 11 5 3 J 。 ( 2 ) 核酸分析 魏亦男等人在p H6 2 的六次甲基四胺缓冲溶液中，邻菲咯啉在紫外光( 入= 2 3 0 或2 6 7 r i m ) 的照射下，能发射出3 6 7n n l 的荧光，天然和热变性h s D N A 以及y R N A 的加入会导 致邻菲咯啉的荧光猝灭，根据该反应可在较宽范围内灵敏地测定溶液中核酸的含量，用 于h s D N A 的测定，其线性范围为O 2 2 5 和2 5 1 8 0l a g m L “ ，检出限为O 0 7 “g m L 。【”】。 李文友等人 5 5 1 建立了在p H = 4 5 的条件下以单一染料N R 为荧光探针测定痕量核酸的新 方法。该方法具有检出限低、反应快速、稳定性好和操作简单( 单一染料试剂) 等特点， 已成功地用于实际样品的分析。陈敬华等人【5 6 】在p H 6 5 的T r i s H C l 的缓冲介质中，在 2 5 8n n l 的紫外光激发下，1 0 苯基吖啶酮( P A C R ) 于4 2 0n l n 处有很强的荧光发射。核酸 的加入，可以使得体系荧光在峰位基本不变的情况下，发生荧光猝灭。其荧光猝灭程度 与小牛胸腺D N A 在0 1 3 0m g L 范围内呈良好的线性关系，检出限可达O 0 4 4m g L ， 还用光谱法探讨了1 0 苯基吖啶酮与D N A 之间的作用机理，认为二者之间可能存在嵌 插作用。陈敬华等人【5 。7 】还研究了1 0 一苯基3 磺酸基吖啶酮( P S A C R ) 在p H6 0 的六次甲基 四胺H C l 缓冲介质中，在3 7 2n m 的紫外光激发下，于4 3 5n m 处有很强的荧光发射。 D N A 的加入，可以使体系荧光在峰位基本不变的情况下，发生猝灭。其猝灭比值与小 牛胸腺D N A 的质量浓度在O 1 3 0m g L 的范围内呈良好的线性关系，检出限可达 O 0 4 0 m g L 。并用光谱法探讨了P S A C R 与D N A 之间的作用机理，推N - - 者之间通过嵌插 作用结合。干宁等人【5 8 】使用紫外和荧光光谱法研究了环丙氟沙星( C I F ) 和小牛胸腺 D N A ( c t D N A ) 之间的相互作用。在p H 7 0 磷酸盐缓冲液中，C I F 在2 7 0n m 激发和在4 2 0n m 处有很强的荧光发射。它们间的沟槽作用导致小牛胸腺c tD N A 对C I F 的荧光存在着很 强的猝灭作用，猝灭常数为2 6 4 X1 0 4m o l 1 L ( 2 5 ) 。利用c tD N A 对C I F 的荧光猝灭作 用建立了核酸测定的新方法，线性范围为8 0n m o l L 1 - 4 5 9 m o l L 1 ，对2 51 t m o l L 。c t D N A 的相对标准偏差为4 2 。郭兴家等人【5 9 】在模拟生理条件下，利用荧光猝灭法研究了胆 红素( B R ) 和牛血清白蛋白( B S A ) 的相互作用。结果表明胆红素对B S A 有较强的荧光猝灭 作用，两者形成了新的复合物，属于静态荧光猝灭，发生了分子内的非辐射能量转移。 计算了不同温度下的结合位点数n ，结合常数K A ，以及对应的热力学参数A G ，日和A S 。 根据F 6 s t e r 非辐射能量转移理论确定了胆红素和B S A 间的结合距离r 。此外，利用同步 荧光光谱，分析了胆红素对牛血清白蛋白构象的影响。宗志新等人邮】在室温条件下，阿 8 桂林理工大学硕士学位论文 的平能嵌入D N A 的碱基对之间，而阿的平荧光大幅猝灭。酸性介质下，激发波长3 4 8 ， 4 2 8 或4 4 9n n l ，碱性介质下激发波长为3 6 2 或4 2 2n l n ，发射波长均为5 0 2n n l 。基于此对 核酸进行定量测定方法简单、快速、灵敏。对于双链或单链小牛胸腺D N A ，线性范围O 4g g m L ，检测限0 0 3 “m L ，共存物质干扰小。在不同浓度c tD N A 存在下，温度对 荧光猝灭的影响结果显示猝灭方式为静态猝灭。汪乐余等人【6 I 】报道了无机纳米溶胶C d S 的合成，并对其进行了功能化修饰。研究了功能性C d S 纳米溶胶的荧光性质。对小牛胸 腺D N A 进行了定量测定，考察了各种影响因素，在最佳实验条件下，该方法的线性区 间0 1 1 5m g L ，检测限为0 0 1 8m g L 。与传统的有机染料相比，该方法简单、快速、 灵敏度高。 1 2 2 2 在药物分析方面的应用 潘祖亭等人【6 2 】系统地研究了在T r i t o nX 一1 0 0 存在下的弱碱性介质中，羧苄青霉素、 氨苄青霉素、长效青霉素和头孢菌素V I 对2 ，7 二溴羟汞基荧光黄钠盐的荧光定量猝灭 作用，提出了一种间接荧光猝灭测定p 内酰胺类抗生素含量的新方法该法简便、快速， 体系稳定，线性范围宽，并已成功地用于体液中p 内酰胺类抗生素残留物的检测。颜承 农等人【6 3 】研究了甲睾酮与浓硫酸反应产物的荧光光谱性质，提出了利用表面活性剂增敏 荧光光谱测量甲睾酮含量的新方法，初步探讨了表面活性剂十二烷基硫酸钠( S D S ) 的增 敏作用机理，并证实溶液中溶解氧对本实验体系有明显的荧光猝灭作用。该法操作简便， 检出限低，用于成品药物分析，结果令人满意。傅丽等人畔1 基于司帕沙星能够猝灭四溴 荧光素的荧光且荧光猝灭程度与司帕沙星的量成正，建立了一种测定微量司帕沙星的方 法。在p H3 5 的C l a r k L u b s 缓冲溶液中，四溴荧光素激发波长九。= 4 8 5n l T l 、发射波长 1 e m = 5 4 5n i n ，司帕沙星的质量浓度在O 2 0m g L 范围内符合比耳定律，方法检出限为 4 2 7 “g L 。已用于片剂及胶囊中司帕沙星的测定。6 次平行测定回收率为9 3 8 - - 1 0 4 - 3 ，相对标准偏差为1 1 - - 2 8 。王金中等人1 6 5 】在弱酸性介质中，氨苄青霉素能 够阻抑钒( V ) 催化过硫酸钾氧化罗丹明B 的荧光猝灭反应，从而建立了阻抑动力学荧光 法测定氨苄青霉素含量的新方法，氨苄青霉素的质量浓度与荧光强度的变化在1 “ - “ 2 5 m g L 。范围内呈良好线性关系。该方法简便、快速，并应用于药物制剂中氨苄青霉素含 量的测定。冯霞光等人【6 6 1 研究了万古霉素的荧光猝灭机理，建立了测定万古霉素的方 法。该方法具有操作简便、快速及选择性好等优点，可用于注射液中万古霉素含量的测 定，与药典法对照，结果令人满意。 用荧光法研究药物分子与蛋白质的结合反应可以综合利用蛋白质和药物的荧光狞 灭、荧光敏化、能量转移和实验条件的影响等多方面的信息。如：通过F 6 r s t e r 能量转 移理论求算药物与氨酸残基之间的距离【6 7 舶】；S c a t c h a r d 作图法研究蛋白质分子与药物小 分子的结合常数及结合位点数【6 9 】：根据反应前后热力学焙变A H 和嫡变A S 的相对大小， 可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型【7 0 1 。张海容等人【7 1 】用荧光光谱法、分光光 9 桂林理工大学硕士学位论文 度法研究了水溶液中喹诺酮类药物司帕沙星与牛血清白蛋I 刍( B S A ) 、鸡蛋I 刍( C E A ) 的相互 作用，求得它们间的结合常数为Kj = 8 2 9 x 1 0 6 ，K 牛= 4 4 1 1 0 7 ；结合位点数分别为玎群 = 0 5 8 8 ，玎牛- - 0 7 9 3 ，并根据F 6 r s t e r 非辐射能量转移机制，测定了司帕沙星与两种血清白 蛋白相互结合时其给体受体间距离俾鸡= 1 9 9n m ，R 牛= 2 0 9n m ) 暑l 能量转移效率( 鸱 卸7 6 6 ，E 卑旬7 1 4 ) 。实验表明，随着温度升高，B S A 及C E A 的猝灭曲线斜率降低。证 实了司帕沙星与B S A 和C E A 的相互结合作用为单一的静态猝灭过程