《般毒性作用》PPT课件.ppt

1,第六章 化学毒物的一般毒性作用,2,基本概念,一般毒性作用（general toxicity），又称基础毒性，是指外源化学物在一定剂量、一定接触时间和接触方式下对试验动物产生的综合毒效应。 根据接触毒物的时间长短，可分为： 急性毒性 亚慢性毒性 慢性毒性,重要,3,外来化学物一般毒性试验项目,3个月及以内,3-6个月,6个月至终身,4,第一节 急性毒性作用及其评价,5,1 基本概念,急性毒性(acute toxicity)是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后在短期(最长到14天)内所发生的毒性效应。 包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应，最主要的观察指标是LD50。,重要,6,2 急性毒性试验的目的,测试和求出化学毒物对一种或几种试验动物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强度。 并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性。,7,探求化学毒物急性毒性的剂量反应关系与中毒特征。 为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒剂量设计提供参考依据。 研究化学毒物急性中毒的预防和急救治疗措施。 为毒理学机制研究提供线索 。,8,3 急性毒性试验设计,3.1 试验动物的选择 3.2 试验动物的饲养环境 3.3 实验动物染毒方法 3.4 染毒剂量与分组 3.5 试验周期 3.6 观察指标,9,3.1 试验动物的选择,原则： 急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。 动物易于获得 品系纯化 价格较低和易于饲养等条件。,10,3.1.1 试验动物的种属和品系,11,最好用两种种属的动物 啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔 非啮齿类：狗或猴。 急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。而急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。,12,试验动物的选择,13,3.1.2 试验动物的年龄和体重： 急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。 例如：大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗1015kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20。,14,3.1.3 试验动物的性别： 急性毒性试验的主要内容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。 如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。,15,3.1.4 动物数量与随机分组： 大、小鼠等小动物 每组10只 狗等大动物 每组6只 分组原则随机化原则,16,鼠的编号,图2,17,3.1.5 禁食： 经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食 大鼠、小鼠隔夜进食；染毒后禁食4h 大动物每日上午喂食前染毒 染毒后继续禁食24h，但在禁食时要保障饮水。,18,3.1.6 实验动物的预检： 选择健康动物，12周的检疫期。 根据我国的法规和有关规定，国家实行实验动物的质量监督和质量合格证制度。实验动物的保种、饲育、供应和应用单位，由各级医学动物管理委员会进行定期监督、监测，并颁发实验动物和实验设施的合格证书(有效期5年)。应用的实验动物必须有完整的资料。进行动物实验的人员应经培训，取得资格认可(上岗证)。实验动物的饲养设施、环境条件及饲料等必须符合有关的国家标准。,19,3.2 试验动物的饲养环境,恒定的温度：223 湿度：3070% 照度：昼夜各半 饲料合格、饮水合格、垫料合格,20,3.3 实验动物染毒方法的选择:,染毒途径（exposure routes）的选择需考虑： 模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式； 有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较； 受试物的性质和用途； 各种受试物毒性评价程序的要求等。 最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。,21,3.3.1 经口(胃肠道)接触 : 灌胃:小鼠0.21.0mL/只或0.10.5mL/10g 大鼠一次灌胃体积不超过5mL/只 家兔不超过10mL/2kg 狗不超过50mL/10kg 吞咽胶囊: 适合大动物 掺入饲料法,重要,22,3.3.2 经呼吸道接触 吸入接触 注入肺内 3.3.3 经皮肤接触,23,3.3.4 注射途径接触,24,染毒的时间,由于动物存在时间节律，外源化学物在不同时间表现的毒性反应有差别，所以在毒理学实际工作中，尤其是进行亚慢性和慢性染毒时，每日的染毒时间应固定一致，以防止出现时间毒性的影响。,25,3.4 染毒剂量与分组,3.4.1 查阅文献 了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。 确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍思法等。 找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。,26,3.4.2 预试验 设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。 根据确定的剂量组进行染毒。 根据预试验的死亡资料确定组距。,27,可根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD90-lgLD10)(n-1) 或：i=(lgLD100-lgLD0)(n-1) 式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)； n为设计的剂量组数。,28,3.4.3 正式试验 一般来说、根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。例如几率单位法、寇氏法一般设610个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i值后以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值,29,霍恩（Horn）法推荐使用4个染毒剂量组，每组动物数相等（4只或5只）。先将动物在实验动物房饲养观察12d，控制喂养环境，并进行随机分组。小鼠禁食4小时后（在禁食时要保障饮水的供应），给予受试物。,30,一个染毒剂量系列的剂量组距为2.15倍，另一为3.16倍。 以组距2.15倍设计则剂量系列为110t、2.1510t、4.6410t（t=0、1、2）。 以组距3.16倍设计则剂量系列为110t、3.1610t（t=0、1、2）。,31,3.5 试验周期,试验周期以2周为宜。,32,3.6 观察指标,3.6.1 致死剂量或浓度 LD50是经统计学计算得到的毒性参数，并可报告其95可信限。LD50(LC50)值是一个统计量，较少受实验动物个体易感性差异的影响，较为准确，因此是最重要的急性毒性参数，也用来进行急性毒性分级。,重要,33,对于非致死性指标的量化问题，可以利用ED50(median effective dose)和相应的剂量-反应关系曲线来解决。ED50是指一次给予实验动物某种化学物引起动物群体中50的个体出现某种特殊效应的剂量，该指标也是通过统计学计算处理得到的。,34,3.6.2 中毒症状 有些化学物(如有机磷类化合物)中毒症状发展迅速且很快死亡。而有些化学物的中毒症状发展缓慢，甚至出现症状缓解，此后再发生严重症状而死亡。 如碳基镍染毒早期先出现上呼吸道症状，当日即可缓解，23日后或更晚些才出现严重的肺水肿，呼吸困难而死亡。,35,化学物给实验动物染毒后，动物往往出现兴奋抑制死亡，或者抑制死亡的现象。 如以含有氰基的氰氢酸和丙烯腈对大鼠和小鼠染毒后，都很快出现兴奋。染毒丙烯腈的动物首先出现活动增加、骚动、窜跑、甚至跳跃，之后出现呼吸困难，耳与尾青紫色；而氰氢酸呈一过性兴奋，呼吸加快、加深，之后呼吸困难，耳与尾则为桃红色。可见同为氰化物，其中毒机制有所不同。,36,3.6.3 死亡和死亡时间 重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深人研究化学物的毒作用机制提供参考。 小鼠腹腔注射相同剂量的乙醇，发现下午4时和8时死亡率最高；给大鼠相同剂量的苯丙胺，清晨3时的死亡率为78%，而上午8时仅为7%。,37,3.6.4 体重 在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物应在观察期14天内称量其体重的变化以便了解受试物引起毒效应的持续时间。,38,3.6.5 病理检查及其他指标: 急性毒性试验中，对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。,39,观察内容,40,4 急性毒性评价,41,我国食品毒理急性毒性分级法,目前我国食品毒理则沿用了国际上六级标准，即极毒、剧毒、中等毒、低毒、实际无毒、无毒,重要,42,5 经典急性毒性试验的局限性,（1）消耗的动物量大 按经典法的要求测LD50，一次实验需要60100只动物。,43,（2）获得的信息有限 LD50的值又不能等同于急性毒性，死亡仅仅是评价急性毒性的许多观察终点之一。 化学物单次大剂量急性中毒，动物多死于中枢神经系统及心血管功能障碍，并不能很好地显示出各自的毒作用特征，另外，由于死亡迅速，各种器质性变化尚未发展，不能显示出靶器官的病变。,44,（3）测得的LD50仅仅是一个近似值 1977年欧洲共同体组织了13个国家的100个实验室，统一主要的实验条件对5种化学物的LD50进行测定。根据收集到的80个实验室的结果分析，结果仍然存在相当大的差别，可达2.448.38倍,45,（4）在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。 ICH(1991)规定在新药的报批材料中，不必准确地测定LD50，只需了解其近似致死量和详细观察记录中毒表现即可。,46,第二节 蓄积毒性作用及其评价,47,1 基本概念,化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。,48,蓄积作用实际上有二个含义： 物质蓄积(material accumulation) 功能蓄积(functional accumulation),49,2 蓄积毒性试验方法及其评价,化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的主要依据。 蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。,重要,50,2.1 蓄积系数法,蓄积系数(accumulation coefficient)是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量ED50(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量ED50(1)的比值，即： KED50(n)/ED50(1) KLD50(n)/LD50(1),51,2.1.1 固定剂量法： 一般常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。先求出LD50，然后选取相同条件的40只(或更多)实验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组至少20只，雌雄各半。 试验组在120l5LD50的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。,对照组如何处理？,52,此时，计算累积总接触剂量LD50(n)，根据公式计算K值，然后依蓄积系数分级标准评价。但若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验。 试验期最长100d，最短25d。 应根据体重调整剂量。,53,2.1.2 剂量递增法： 在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第2l天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说明其累积剂量已达5.26LD50，即K5。使用本方法时要注意染毒期间定期(每4天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒物的染毒绝对量。,54,2.1.3 剂量固定的20天蓄积法： 它通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为5个组，包括阴性对照组和1/20 LD50、l/10 LD50、1/5 LD50和1/2 LD50四个剂量组，每组动物数10只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒20天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。,55,试验结束时根据下列标准进行评定： 各剂量组均无死亡，即为蓄积性不明显； 如仅1/2LD50剂量组有死亡，其他组均无死亡，则为弱蓄积性； 如1/20LD50剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系时，则为中等蓄积性； 如1/20LD50剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。,56,2.2 生物半减期法：,生物半减期(biological half-life，t1/2)法是用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。 t1/2的测定 测定整个机体的半减期较为复杂，通常是间接测定环境污染物在血液中的浓度降低50所需的时间。,57,2.3蓄积率及其测定,蓄积率(cumulative percent) ，指在一定的时间内，外源化学物在体内的蓄积量与同一期间进入机体总量的百分比。,58,蓄积率测定方法,常用的动物为小鼠或大鼠。首先将受试动物分成蓄积和对照两大组，每组6070只。蓄积组动物每次按一定剂量(低于最小致死量)按同一给毒途径预先给受试物，经过一定时间之后，按常规方法测定蓄积组和对照组的LD50，并按下式计算蓄积率: 蓄积率=（对照组LD50 - 蓄积组LD50）/ 蓄积组预给受试物的总剂量 100% 蓄积率应标明预先给受试物的时间及剂量，在相同时间及剂量条件下，蓄积率越大则表示该物质在体内的蓄积作用越强 ，反之则越弱。,59,3 关于机体的耐受性,在某些情况下，某一外来化学物反复作用于机体后，有时一些本来可以引起机体呈现一定剂量的效应，却没有引起反应，必须加大剂量才能呈现预期效应。 加速代谢 感受能力降低,60,第三节 亚慢性、慢性毒性作用及其评价,61,1 基本概念,亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源化合物所引起的毒性效应。 慢性毒性(chronic toxicity)是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化学毒物所产生的毒性效应。,重要,62,2 试验目的：,研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量反应(效应)关系