《发酵工艺的控制》PPT课件.ppt

发 酵 工 艺 的 控 制,第 五 章,第五章 发酵工艺的控制,1. 概述 . 温度的影响及其控制 . pH的影响及控制 . 溶氧的影响和控制 . 泡沫的作用和控制 . 补料的作用和控制 . 发酵终点的判断,发酵过程控制是发酵的重要部分 控制难点：过程的不确定性和参数的非线性 发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于优化发酵是十分必要的,1. 概述,一、发酵过程的方式 二、发酵过程的代谢参数,一、发酵过程的方式,分批培养 补料分批培养 半连续培养 连续培养,分批培养中微生物的生长规律,迟滞期,对数生长期,稳 定 期,死亡期,迟滞期：菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。 对数生长期：当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累， 稳定期：随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期 死亡期：最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。,1、 分批发酵(间隙发酵) 最简单的发酵过程，培养基灭菌后, 接入菌种，进行发酵, 除了空气的通入和排气外, 没有物料的加入和取出。 整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。,优点： 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程容易掌握 缺点 ： 产率低,分批培养的优缺点：,2、补料分批培养,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，在工厂的实际生产中采用这种方法很多。 补料分批培养的优缺点: 优点: 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件。 缺点: 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降; 增加了染菌机会,3、半连续培养,在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。 半连续培养的特点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。,4、连续培养,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。 达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，基质浓度都是恒定的。 连续培养的优缺点 优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。 缺点 ：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。,发酵过程的分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断。,二、发酵过程的代谢参数,代谢参数按性质分可分三类： 物理参数：温度、转速、压力、空气流量、粘度等 化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、溶解氧、 pH、产物浓度等 生物参数：菌丝形态、菌浓度、呼吸强度、关键酶活力等,发酵过程的主要控制参数,1. 物理参数 （1）温度（） 直接影响发酵过程的酶反应速率，氧的溶解度和传递速率，菌体生长速率和合成速率。 （2）压力（Pa） 影响发酵过程氧和CO2的溶解度，正压防止外界杂菌污染。罐压一般控制在0.21050.5105 Pa。,（3）搅拌速度（r/min） 搅拌器在发酵过程中的转动速度。 其大小影响发酵过程氧的传递速率，还受发酵罐的容积限制（见下表）,（5）空气流量（m3空气/（m3发酵液min） 单位时间内单位体积发酵液里通入空气的体积，一般控制在0.51.0（m3空气/（m3发酵液min） （6）粘度（Pas） 细胞生长或细胞形态的一种标志，反映发酵罐中的菌丝分裂情况，表示菌体的浓度。,2. 化学参数 （1）pH （酸碱度） 发酵工艺重要的参数之一，与菌体生长和产物合成有密切关系。包括起始pH ，发酵过程中的pH 。 （2）基质浓度（g/L） 发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度，对菌体的生长和代谢合成有重要影响，是产物代谢控制的重要手段。 （3）溶解氧浓度（饱和度，） 溶解氧是好氧发酵的必备条件，通常用饱和百分度表示。,（5）产物浓度（g（u）/ml） 检验发酵是否正常与否的重要参数， 是决定发酵周期长短的根据.,3. 生物参数 （1）菌丝形态 菌丝形态是衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。 （2）菌体浓度 菌体浓度是控制微生物发酵的重要参数之一。生产上，常常根据菌体浓度来决定补料量和供氧量，以保证生产达到预期水平。,2 . 温度的影响及其控制,一、温度对发酵的影响 （1）影响微生物各种酶催化反应的速度 微生物可生长的温度范围较广，总体说在-1095。在生物学范围内温度每升高10，生长速度通常就加快一倍；温度每升高10酶反应速度增加23倍； 菌体生长的酶反应和产物合成酶反应温度往往是不同的，因而发酵过程的温度直接影响产率； （2）影响产物合成的方向 金霉素链霉菌四环素发酵时，30一下时金霉素增多，35时只生产四环素； （3）影响发酵液的物理性质,二、 影响发酵温度的因素,发酵液的温度变化受生物热、搅拌热 、蒸发热 、辐射热 和显热的影响， 用公式表示为： Q发酵Q生物+Q搅拌Q蒸发 Q辐射Q显,（1）生物热、搅拌热,生物热：是菌体在生长繁殖过程中产生的热能，来自菌体的分解代谢，生物热的大小和菌种、培养基成分和菌体的呼吸强度有关。 培养基愈丰富，生物热愈大； 细胞数量愈多，生物热愈大； 呼吸强度愈高，生物热愈大。 搅拌热：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量，,（2）蒸发热、显热和辐射热,蒸发热：空气进入发酵罐，与醪液充分混合，引起水分蒸所需的热能为 显热：水分蒸发、进气和废气排出因温度差异所带走的部分热能为 辐射热：发酵罐外壁与大气间的温度差异使发酵罐中的部分热能通过罐体向大气辐射的热能为,三、 温度的控制,（1）最适温度的选择 最适发酵温度使既适合菌体生长，又适合代谢产物合成的温度。两个温度往往不一致。如： 乳酸链霉菌发酵生产乳酸，最适菌体生长温度为34，最适产物合成温度为30； 最适发酵温度随菌种、基质成分、培养条件和菌体生长阶段而异； 理论上讲，发酵过程可以设置不同的发酵温度时段，包括菌体生长发酵温度和产物合成发酵温度等。生产上，由于发酵液体积大，少则几十立方米，多则上百上千立方米，升降温度时间长，难度大，通常采用一个发酵温度。,（2） 温度的控制,发酵罐在发酵过程中一般不需加热，选用微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的现实意义。 生产中，温度的控制是采用冷却水通入发酵罐的蛇管或夹套中，热交换保持恒温发酵的。,3. pH的影响及控制,（1） pH的影响 培养基中的pH值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长和最适生产的pH范围。一般微生物的最适生长pH范围为： 细菌：pH7.08.0、霉菌：pH4.05.8、 酵母菌：pH3.86.0 产物的合成也有最适pH，青霉素合成最适pH为6.56.8。 发酵过程中，控制发酵液的pH值是控制生产的指标之一，pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。 控制pH值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染。在发酵工业中，维持适宜的pH已成为生产成败的关键因素之一。,（2）pH的变化因素,发酵过程中，pH的变化与菌种、培养基的成分和培养条件有关。微生物通过其活动也能改变环境的pH值，菌体本身具有调节周围pH 的能力。 例：地中海诺卡氏发酵利福霉素SV时，起始pH为6.8及7.5时，最终pH均达7.5，产率正常；起始pH为6.0时，最终pH为4.5，产率减少； 培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子(如醋酸根、磷酸根)被吸收或氮源被利用后产生NH3 ，则pH上升；阳离子(如NH4、K+ )被吸收或有机酸的积累，使pH下降。 一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。,（3） 发酵pH的确定和控制,（1）根据实验确定最佳发酵pH，正交试验。 （2）pH的控制 考虑培养基成分的生理酸性盐和生理碱性盐的缓冲作用； 生产中常用补加酸碱来控制，如氨水，尿素，硫酸铵等。,4. 溶氧的影响和控制,（1） 溶氧对发酵的影响 溶氧是需氧发酵控制的重要参数之一，氧的溶解度很小，氧的溶解度仅为6.4mg /L ， 溶氧大小对菌体生长和产物的性质和产量产生不同影响；例如，谷氨酸发酵时，通气不足会积累大量乳酸和琥珀酸； 不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求也不相同。例如，天氡酰胺酶发酵，前期为好气培养，后期为厌氧培养，产酶能力会大大提高。,（2） 发酵过程的溶氧变化,发酵前期，菌体繁殖迅速，菌体摄氧率增加，需氧量增加，溶氧下降。 发酵中期，需氧量在有所减少，菌体和发酵液粘度均达到峰值；溶氧在较低水平维持一段时间后，开始上升； 发酵后期，产物大量合成，呼吸强度比较稳定，溶氧增加， 发酵过程中有时会发生溶氧异常情况（异常下降或升高） 异常下降原因可能有：污染好氧菌；或菌体向好氧代谢途径迁移，或供氧设备发生故障等。 异常上升原因可能有：污染噬菌体，菌体完全被裂解；或菌体向厌氧代谢途径迁移,（3）溶氧的控制,溶氧浓度的控制可从供氧和需氧两方面着手，其中供氧是主要的： 需氧方面：需氧量与菌体浓度，基质浓度和种类，培养条件有关。 供氧方面：生产中常采用加大通气速率，或提高搅拌转速，或适当增加罐压；,通气可以供给大量的氧：通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。 搅拌则能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解， 罐压方面，一般来说，若培养罐深，搅拌转速大，通气管开孔小或多，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度就大。 搅拌可以提高通气效果，但是过度地剧烈搅拌会导致培养液大量涌泡，容易增加杂菌污染的机会，微生物细胞也不宜剧烈搅拌,5. 补料的作用和控制,1. 分批补料培养（fed-batch culture）的优点和应用 分批补料培养是先投入一定量底物装入罐内，到发酵过程的适当时期，开始连续补加碳-能源或氮源或其他基质，使发酵过程中，限制性底物浓度在罐内保持一定；发酵液体积达到最大工作体积时，终止发酵，醪液一次全部取出的发酵方法； 介于分批发酵与相连续发酵之间的一种发酵技术，在发酵工业中普遍应用。,分批补料发酵的优点,（1）可以解除底物抑制，产物反馈抑制，分解代谢产物抑制； （2）可避免菌体过量生长，能改善发酵液性质； （3）能有效控制菌浓度，菌体细胞的质量,2. 分批补料发酵的补料方式和控制,补料方式有单组分补料（限制性因子）和多组分补料； 反馈控制系统包括传感器、控制器、驱动器三个单元组成；既可以直接控制限制性因子（碳源、氮源或碳氮比）的浓度，也可以间接控制溶氧、pH、呼吸强度、CO2浓度、产物浓度,6. 泡沫的影响和控制,1. 泡沫的影响 泡沫是发酵醪液中具有表面活性蛋白类表面活性剂物质，在通气条件下形成的。泡沫是一种胶体体系； 面上泡沫，分布在醪液上面，气液界面明显，气相比例大； 面下泡沫，又称流态泡沫，分布在醪液中，气液界面不明显，体系稳定； 泡沫的负面影响： 减少发酵罐工作体积，引起醪液逃液； 降低溶氧，减少氧传递系数； 引起污染，严重时会导致倒罐；,2. 泡沫的控制,（1）调整培养基成分 避免或减少一起泡沫的培养基成分； 改善发酵工艺，采用分批补料方法发酵； 改变发酵的部分物理化学参数，如温度，pH值，通气和搅拌 （2）机械消泡 增加消泡装置，内消法和外消法， （3）消沫剂消泡法 消泡剂是抑制底表面张力的表面活性剂， 天然油脂类：豆油，玉米油，棉籽油，菜子油，猪油等； 聚醚类：GP型聚合物（氧化丙烯和甘油聚合物，）；GPE型聚合物（氧化丙烯、环氧乙烷和甘油聚合物，亲水性，泡敌）； 硅酮类： 高碳醇、脂肪酸和酯类,7. 发酵终点的判断,1. 发酵过程的优化主要指标有： 产物得率最大（或产量最大）， 经济效益最大 成本最低 产品质量最好 2. 发酵终止时间的确定是以上指标的综合考虑，生产力高、成本低、利润大为准则确定放罐时间。 3. 特殊因素,染菌的控制,（1）染菌的原因 设备、管道、阀门漏损、灭菌不彻底； 空气净化不好； 无菌操作不严或菌种不纯等。 （2）染菌的控制 严格无菌操作技术 前期污染，重新灭菌 后期污染，即使停止,习题： 发酵的四种方式及特点 微生物在密闭状态的生长规律及其原理 发酵过程的几个重要参数及其控制,（1）菌体生长阶段（发酵前期或平衡期） 碳源和氮源等进行分解代谢，基质不断被消耗，菌体不断繁殖，菌浓不断增加； 菌体摄氧率增加，溶解氧浓度下降，菌体达到临界浓度时，氧浓度达最小； pH发生一些变化，或先升后降，或先降后升； 发酵体系出现某一限制因子，菌体生长速率下降，中间代谢产物大量积累； 菌体生理发生变化，与次级代谢相关的酶被解除控制，菌体进入产物合成阶段。,（2）产物合成阶段（分泌期或发酵中期） 发酵过程中代谢变化如下： 菌体达到临界浓度，菌体基本不繁殖，但细胞内含物仍在增加，菌体干重增加；总DNA含量达定值； 基质继续被消耗，产物不断被合成，代谢仍然包括基质的分解代谢和产物合成代谢；但菌体的呼吸强度不变； 环境条件对产物合成很敏感，需严加控制温度，pH/，基质浓度和溶解氧浓度； 基质浓度不能过高或过低，过高则会引起菌体繁殖，过低会加速菌体老化；,（3）菌体自溶阶段（自溶期或发酵后期） 发酵过程中代谢变化如下： 菌体细胞衰老，细胞开始自溶； 氨氮含量增加，pH上升； 产物合成能力衰退，生产速率下降； 发酵一旦进入自溶阶段必须结束，否则产物会被破坏，还会给后续工艺带来困难。,第三节 菌体浓度的影响及其控制,菌体细胞浓度（cell concentration）是指单位体积醪液中菌体的含量，反映菌体细胞的多少、菌体的分化阶段，与菌体的生长速率有密切关系。 1. 影响菌浓的因素 （1）微生物种类 菌体的繁殖速率与微生物的自身遗传特性有关，取决于细胞结构的复杂性和生长机制。典型的细菌、酵母、霉菌和原生动物的倍增时间为： 细菌45分钟 酵母90分钟 霉菌3小时 原生动物6小时,（2）基质浓度 由Monod关系式 得出，生长速率取决于基质浓度。 当基质浓度S10Ks时，比生长速率就接近最大值。,基质抑制效应： 所有营养物质均存在一个上限浓度，在此限度内，菌体的比生长速率随浓度增加而增加，但超过此浓度，浓度继续增加会引起生长速率下降的现象（可能时基质浓度过高，形成高渗透压，引起细胞脱水而抑制微生物生长）。 一些营养物质的上限浓度为： NH4+5g/L ， PO43- 10g/L， 葡萄糖 100g/L,（3）其他环境条件 温度 pH值 渗透压 水分活度,2. 菌浓对发酵的影响 （1） 对代谢产物得率的影响 初级代谢发酵产物与菌浓成正比关系，Rp=QpmX， 如氨基酸、维生素，菌浓越大，产率越高； （2）对溶解氧的影响 菌浓越大，能提高摄氧率（OUR），使摄氧率按比例增加（OURQO2X）， 菌浓越大，表观粘度增加，降低氧传递速率（OTR），使溶解氧减少。,3. 菌浓的控制 控制基质浓度， 调节基质组成； 中间不料控制（补加磷酸盐提高菌浓）。,第四节 基质的影响及其控制,基质即培养微生物的营养物质，供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质混合物。 基质的种类和浓度与发酵代谢有着密切关系，控制基质的种类和浓度是提高代谢产物的重要方法。,1. 碳源的种类和浓度 快速利用碳源能迅速参与代谢、菌体繁殖、产生能量，并产生分解代谢产物（如丙酮酸），有利于菌体生长。 缓慢利用碳源多为聚合物，为菌体缓慢利用，有利于延长产物合成，特别有利于延长抗生素发酵的分泌期， 乳