最低检测限与线性范围试验1.ppt

第二次实验 血清总蛋白测定、 最低检出限 线性范围试验,教学要求与目的 1.掌握血清总蛋白测定原理和测定方 法，了解其临床意义。 2.掌握最低检出限、线性范围的定义、 评价方法及用途。 3.熟悉最低检出限、线性范围的实验 方法。,教学内容 1.双缩脲法测定血清总蛋白。 2.最低检出限测定。 3.线性范围试验。,一、血清总蛋白测定,凯氏定氮法 参考方法,双缩脲法 常规方法,酚试剂法,染料结合法,浊度法、紫外光谱法,（一）实验原理 血清中蛋白质分子中的肽键在碱性溶液中能与Cu2+作用生成稳定的紫红色络合物，此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称双缩脲反应。,在540nm波长处有吸收峰，在一定浓度范围内其吸光度增加与蛋白含量成正比，由此可求得蛋白质含量。,（二）实验试剂 1、双缩脲试剂 氢氧化钠、酒石酸钾钠 硫酸铜、碘化钾 2、标准液 总蛋白 50g/L,（三）操作方法 1、操作参数： 波长：540nm 温度：37 测定模式：终点法,2.操作步骤,混匀，37水浴10分钟，在540nm波长处，用空白管调零，读取各管吸光度。,3、计算,血清总蛋白(g/L),=,测定管吸光度,标准管吸光度,蛋白标准液浓度（50g/L）,参考值：6083g/L,（四）注意事项,严重溶血和黄疸可使测定结果偏高,可 作标本空白管消除。 2.脂肪乳糜干扰比色，可加丙酮离心。 3.右旋糖酐可使测定产生混浊影响结果。,1.精密度较好、准确度较高，WHO 推荐方法。 2.线性范围宽（10-120g/L）。 3.操作简便你、快速，成本低廉。 4.灵敏度较低。,（五）方法学评价,（六）临床意义,1.蛋白浓度升高 （1）血液浓缩：脱水、外伤性休克等。 （2）蛋白质合成增加：多发性骨髓瘤、免疫增殖病等。,（3）蛋白质合成障碍：如肝脏疾病。,（1）蛋白丢失：如肾病综合征。,2.蛋白浓度降低,（2）摄入不足：营养不良。,二、最低检测限试验,检测限（LoD）：是检测系统可检测出的最低分析物浓度。,最低检测限（LLD）：指当标本中不含有待测分析物时，反应响应量可能出现的数值范围，即单次测量可达到的非空白检测响应量对应的分析物量。,功能灵敏度（FS）：以日间重复CV为20%时对应检测限样品具有的平均浓度确定为检测系统或方法可定量报告的分析物的最低浓度或其它量值 。,（一）原理 选择合适的空白标本，该标本与待测标本的区别在于不含有待测物质，一般用处理过的标本或一般标本，在分析步骤中省去关键试剂或操作。,本次实验采用蒸馏水作为空白标本，采用双缩脲法进行多次测定，求出吸光度的均值及标准差，计算最低检测限。,（二）操作步骤,混匀，37水浴10分钟，在540nm波长处，用空白管调零，读取各管吸光度。,（三）计算 1.计算10次测定的平均吸光度及标准差。 2.计算最低检测限：平均吸光度+3S 3.将吸光度值转换成浓度单位。 LLD=A低/A标C标,三、线性范围试验 可报告范围（RR）：指可以报告的所有结果的范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。,分析测量范围（AMR）：指分析样本未经任何预处理（稀释、浓缩等），由检测系统直接测量得到的待测物的可靠结果范围，在此范围内一系列不同浓度的样本分析物的测量值与其实际浓度（真值）呈线性比例关系。,临床可报告范围（CRR）：指定量检测项目向临床能报告的检测范围，患者样本可经稀释、浓缩或其它预处理。,（一）原理 线性范围是指系统最终输出值（浓度或活性）与被分析物浓度或活性成比例的范围。线性范围的测定即测定浓度曲线接近直线的程度，它反映整个系统的输出特征。,本试验使用不同浓度的总蛋白标准溶液，用双缩脲试剂测定各自的浓度，以标准液预期浓度为横坐标，测得浓度为纵坐标，在坐标纸上作图，即可绘制出一条直线，即计量反应曲线。,（二）试剂 1.蛋白质标准液（50g/L） 2.混合血清（120g/L） 3.双缩脲试剂,1.制备不同浓度的样本,2.按下表操作,各测定管均测定双份，混匀，37水浴10分钟，在540nm波长处，用空白管调零，读取各管吸光度。,（四）记录实验数据，并绘制剂量反应曲线。以总蛋白浓度预期值为横坐标，测定值为纵坐标，在坐标纸上绘制曲线，即为剂量反应曲线。,（五）评价 1.目测法：是评估几个不同浓度样本的多次测量均值与实际值之间是否具有肉眼上的直线关系。没有用到统计学方法来验证线性。,2.平均斜率法：是采用最小二乘法直线回归作统计分析方法。以总蛋白浓度预期值为横坐标，测定值为纵坐标，在坐标纸上作图，若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势，,建立回归方程y=a+bx，要求a接近于0，b在0.971.03之间，若满足此条件，则可直接判断该测定方法是否在所要求的线性范围。,若a较大，b1.03或0.97则认为在高浓度或低浓度处的实测值和预期值间有较大偏差。试着舍去某组数据，另作回归分析，直到a接近于0